Biochemical markers of the functional state of liver in rats fed diets with different protein and sucrose content

Abstract

The study of mechanisms of the metabolic disorders in conditions of deficiency or excess of individual nutrients in the diet is a live issue. The influence of the simultaneous excess sucrose intake and protein deficiency in the diet on the functional state of the liver remains poorly understood.

The aim of the research was to study the rate of generation of the superoxide radicals, the content of triglycerides and glycogen in the liver, as well as the activity of enzymatic markers of the liver state in rats fed diets with different protein and sucrose content.

Material and methods. The studies were conducted over 28 days on 48 white non-linear rats, randomized into 4 groups: 1 - animals fed full-value semi-synthetic ration (14% protein); 2 - animals receiving low-protein ration (4.7% protein); 3 - animals receiving high-sucrose diet (40% sucrose), 4 - animals receiving low-protein high-sucrose diet. Serum sorbitol dehydrogenase activity was determined by the kinetic method in the reaction of NADH-dependent reduction of D-fructose to D-sorbitol. Serum alanine aminotransferase activity and aspartate aminotransferase was evaluated using a kit of reagents (Ukraine).

Results and discussion. It was found that in rats fed low protein diet, no changes in the de Ritis coefficient were observed, while the activity of sorbitol dehydrogenase in blood serum increased 1.7 fold. However, no changes in the rate of superoxide radical formation, as well as glycogen and triglyceride level in the liver were observed. In animals fed high-sugar diet, a rise in the de Ritis coefficient on the background of increased serum sorbitol dehydrogenase activity (more than 3.5 times) was revealed. At the same time, the rate of the superoxide radical formation in the liver mitochondria enhanced by 3 fold, with an increased accumulation of glycogen and triglycerides. The most pronounced changes in liver state were observed in animals fed low-protein/high-sugar diet: a marked increase in the de Ritis coefficient with a 5-fold increase in the activity of sorbitol dehydrogenase, and a 6-fold elevation in the intensity of the superoxide radical generation in liver mitochondria. The triglyceride content in the liver doubled, while the glycogen content remained at the level of control values.

Conclusion. The data obtained represent disturbances of the functional liver state as a consequence of the relatively short-term excessive consumption of sucrose, especially in combination with a alimentary protein deficiency. It was found that the leading factor in the formation of destructive changes in the liver was excessive sucrose consumption, while the concomitant protein deficiency exacerbated the functional changes in hepatocytes.

Keywords:protein deficiency, high sucrose diet, liver, de Ritis ratio, superoxide, triac-ylglycerol

For citation: Voloshchuk ON., Kopylchuk G.P., Holinei TYu. Biochemical markers of the functional state of liver in rats fed diets with different protein and sucrose content. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (6): 61-7. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10065 (in Russian)

В настоящее время, несмотря на актуальность, вопрос о механизмах формирования метаболических нарушений в условиях дефицита или избытка отдельных нутриентов в пищевом рационе остается открытым [1-4]. Известно, что в рационе современного человека преобладают легкоусвояемые углеводы, а также распространено недостаточное потребление полноценных белков. Алиментарная недостаточность белка, возникающая вследствие потребления белковых продуктов с низкой биологической ценностью, распространенности научно необоснованных диет, неодинаковой доступности различных слоев населения к основным источникам полноценного белка, сопровождается нарушением целого ряда метаболических процессов. В то же время хроническое потребление рациона с высоким содержанием добавленного сахара (сладких напитков, сиропов, кондитерских изделий) уменьшает потребление пищи, содержащей эссенциальные нутриенты, способствует развитию ожирения, формированию резистентности к инсулину и неалкогольной жировой болезни печени [5, 6]. Показано, что избыточное потребление сахарозы сопровождается накоплением триглицеридов в гепатоцитах с последующей интенсификацией генерации активных форм кислорода и формированием окислительного стресса, а также способствует воспалению в печени [7]. Увеличение содержания сахарозы в пище усугубляет метаболические нарушения в печени, что отражается на ее функционировании [8].

Целью работы стало исследование скорости генерации супероксидного радикала, содержания триглицеридов и гликогена в печени, а также активности аланин- (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ), сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови крыс, содержащихся на рационах с различной обеспеченностью белком и сахарозой.

Материал и методы

Исследования проводили на белых нелинейных крысах (n=48) с исходной массой тела 130-140 г и возрастом 2-2,5 мес. На протяжении всего исследования длительностью 28 сут определяли индивидуальные показатели поедаемости корма и изменения массы тела: через сутки контролировали потребление корма, через каждые 3 дня животных взвешивали. Работу с животными осуществляли с учетом положений Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.

Крыс содержали индивидуально в пластмассовых клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum. Исследования проводили на 4 группах животных (по 12 крыс в каждой). Животные 1-й (контрольной) группы на протяжении 28 сут получали рацион, содержавший 14% белка за счет казеина, 10% жира (соевое масло) и 76% углеводов (кукурузный крахмал - 61%, сахароза - 10%, микрокристаллическая целлюлоза - 5%), сбалансированный по всем нутриентам [9]. Содержание витаминной смеси составляло 1%, минеральной - 3,5% [10]. Энергетическая ценность рациона - 3601 ккал/кг. Животные 2-й группы получали изокалорийный рацион, содержащий 4,7% белка, 10% жира и 85,3% углеводов (за счет увеличения количества кукурузного крахмала). Животные 3-й группы получали высокосахарозный рацион, содержащий 40% сахарозы при общем уровне белка 14%, жира - 10%, углеводов - 76% (энергетическая ценность рациона - 3798 ккал/кг) [11]. Животных 4-й группы содержали на низкобелковом/высокосахарозном рационе: 4,7% белка, 40% сахарозы и необходимое количество других нутриентов (3798 ккал/кг).

Цервикальную дислокацию крыс под легким эфирным наркозом осуществляли на 29-е сутки эксперимента. Сыворотку крови получали стандарным методом, митохондриальную фракцию из гомогената печени выделяли методом дифференциального центрифугирования при 0-3 °С [19].

Активность сорбитолдегидрогеназы (КФ 1.1.1.14) в сыворотке крови определяли кинетическим методом [12] , базирующемся на способности фермента восстанавливать D-фруктозу в D-сорбит с одновременным окислением NADH. Активность АЛТ (КФ 2.6.1.2) и АСТ (КФ 2.6.1.1) в сыворотке крови оценивали, используя наборы реактивов ("Филисит-Диагностика", Украина). Коэффициент де Ритиса рассчитывали как соотношение активности АСТ/АЛТ.

Интенсивность образования супероксидного радикала регистрировали в тесте с нитросиним тетразолием [13] . Содержание триглицеридов в ткани печени определяли с помощью набора реактивов ("Филисит-Диагностика", Украина) после предварительной экстракции хлороформ-метальной смесью (соотношение 2:1), содержание гликогена определяли после его экстракции и последующего гидролиза до глюкозы [14]. Содержание белка определяли по методу Лоури.

Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с применением программы обработки статистических данных Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Общее состояние всех животных по внешнему виду, качеству шерстного покрова и поведению при ежедневном осмотре было удовлетворительным. Масса тела животных в начале и в конце эксперимента, а также абсолютная и относительная масса печени указаны в таблице. Результаты исследований показали, что наиболее выраженный прирост массы тела наблюдался у животных, содержавшихся на высокосахарозном рационе, при этом у крыс указанной группы наблюдалось увеличение как абсолютной, так и относительной массы печени. В то же время наименее выраженный прирост массы тела наблюдался у крыс, потреблявших низкобелковый рацион.

Результаты исследований показали, что у крыс, содержавшихся на низкобелковом рационе, не наблюдалось статистически значимых изменений коэффициента де Ритиса (рис. 1А), при незначительном увеличении активности АЛТ (рис. 1В) и сохранении на уровне контроля активности АСТ (рис. 1Б). При сохранении целостности плазматических мембран гепатоцитов АЛТ и АСТ обычно высвобождаются в плазму с постоянной скоростью [15]. Поскольку AЛT присутствует преимущественно в цитоплазме гепатоцитов, а ACT - как в цитозоле клеток, так и в митохондриях, при незначительном увеличении проницаемости плазматической мембраны коэффициент де Ритиса не изменяется. В то же время активность сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови крыс, содержащихся на низкобелковом рационе, увеличилась в 1,7 раза (рис. 2). Известно [16, 17], что сорбитолдегидрогеназа локализуется только в цитозоле гепатоцитов, поэтому даже незначительное повышение активности сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови указывает на изменение проницаемости мембран клеток печени. Активность сорбитолдегидрогеназы сыворотки является чувствительным маркером повреждения печени [18].

Следует отметить, что у животных, получавших низкобелковый рацион, не наблюдалось изменений скорости образования супероксидного радикала (рис. 3), а также содержания в печени гликогена и триглицеридов (рис. 4). Полученные результаты исследований позволяют сделать вывод, что у крыс, содержавшихся на низкобелковом рационе, наблюдается только незначительное увеличение проницаемости мембран гепатоцитов, при этом изменения интенсивности генерации супероксида и содержания гликогена, а также триглицеридов не обнаружены.

В то же время результаты исследований показали, что для животных, содержавшихся на высокосахарозном рационе, было свойственно повышение коэффициента де Ритиса (см. рис. 1), при этом активность сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови увеличивалась более чем в 3,5 раза (см. рис. 2). Выявленные изменения активности исследуемых ферментов указывают на деструктивные изменения гепатоцитов и повреждение паренхимы печени. Известно, что увеличение коэффициента де Ритиса указывает на высвобождение внутриклеточного фермента (как митохондриальной, так и цитозольной ACT) и, таким образом, свидетельствует о гепатоцеллюлярном повреждении [19].

При этом скорость образования супероксидного радикала в митохондриях печени увеличивалась в 3 раза (см. рис. 3), что может рассматриваться как один из вероятных механизмов повреждения гепатоцитов в условиях избытка в рационе сахарозы. Показано, что потребление больших количеств сахарозы вызывает интенсификацию митохондриального дыхания, вследствие чего наблюдается усиленная утечка электронов на молекулярный кислород с последующей активацией генерации супероксида. В свою очередь супероксидный радикал может способствовать воспалению через активацию опосредованных ядерным фактором NF-kB клеточных сигнальных путей [20].

Кроме того, нами установлено, что в ткани печени крыс в на фоне чрезмерного потребления сахарозы наблюдалось усиленное накопление как гликогена, так и триглицеридов (см. рис. 4). Как известно, связанный с диетой с высоким содержанием сахарозы нежелательный атерогенный липидный профиль, возможно, обусловлен влиянием фруктозы на липогенез печени. Во-первых, потому что печень является основным органом метаболизма фруктозы через инсулин-независимый путь, а во-вторых, потому что поступление фруктозы в гликолиз обходит основной путь, обеспечивая тем самым нерегулируемые количества липогенных субстратов ацетил-КоА и глицерол-3-фосфата [8]. Более того, фруктоза способна превращаться в печени в триозы, которые могут также использоваться для синтеза триглицеридов de novo. Следствием усиления липогенеза может стать стеатоз печени.

Наиболее выраженные изменения показателей печени наблюдались у животных, содержащихся на низко-белковом/высокосахарозном рационе. У них наблюдалось выраженное повышение коэффициента де Ритиса (см. рис. 1А) при 5-кратном увеличении активности сорбитолдегидрогеназы (см. рис. 2), при этом в 6 раз увеличилась интенсивность генерации супероксидного радикала в митохондриях печени (см. рис. 3). Следует отметить, что в исследуемых экспериментальных условиях вдвое увеличилось содержание триглицеридов в печени, но значение гликогена сохранилось на уровне контроля (см. рис. 4).

Учитывая, что накопление триглицеридов в печени, интенсификация генерации супероксида, а также повышенное соотношение AСT/AЛT являются предпосылками для отдаленных осложнений, включая фиброз и цирроз печени [15], установленные нами изменения показателей состояния печени свидетельствуют о деструктивных процессах в печени и нарушении ее функционирования в условиях алиментарного дефицита белка и избытка сахарозы в рационе.

Полученные данные свидетельствуют о нарушении функционального состояния печени при относительно кратковременном (на протяжении 28 сут) избыточном потреблении сахарозы, особенно в сочетании с недостаточностью белка в рационе. Можно сделать вывод, что ведущим фактором формирования деструктивных изменений в печени является избыточное потребление сахарозы, при этом сопутствующий алиментарный дефицит белка усугубляет функциональные изменения гепатоцитов.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература

1. Wu G. Dietary protein intake and human health // Food Funct. 2016. Vol. 7, N 3. P. 1251-1265. doi: 10.1039/c5fo01530h

2. Tikole R.V., Kulkarni R., Uppinakudru S. et al. Nutritional deficiency disorders in paediatrics: an ayurvedic perspective // Int. J. Res. Ayurveda Pharm. 2013. Vol. 4, N 4. P. 605-607. doi: 10.7897/2277-4343.04431

3. Malta А., de Oliveira J.C., Ribeiro T.A., Tofolo L.P. et al. Low-protein diet in adult male rats has long-term effects on metabolism // J. Endocrinol. 2014. Vol. 221, N 2. P. 285-295. doi: 10.1530/JOE-13-0473

4. Kitada M., Ogura Y., Monno I., Koya D. The impact of dietary protein intake on longevity and metabolic health // EBioMedi-cine. 2019. Vol. 43. P. 632-640. URL: https://doi.org/10.1016/ j.ebiom.2019.04.005

5. Maciejczyk M., Matczuk J., Zendzian-Piotrowska M. et al. Eight-week consumption of high-sucrose diet has a pro-oxidant effect and alters the function of the salivary glands of rats // Nutrients. 2018. Vol. 10, N 10. P. 1-19. doi: 10.3390/nu10101530

6. Ragab S.M., Abd Elghaffar S.Kh., El-Metwally T.H. et al. Effect of a high fat, high sucrose diet on the promotion of non-alcoholic fatty liver disease in male rats: the ameliorative role of three natural compounds // Lipids Health Dis. 2015. Vol. 14. P. 83. doi: 10.1186/ s12944-015-0087-1

7. Chung M., Ma J., Patel K. et al. Fructose, high-fructose corn syrup, sucrose, and nonalcoholic fatty liver disease or indexes of liver health: a systematic review and meta-analysis // Am. J. Clin. Nutr. 2014. Vol. 100, N 3. P. 833-849. URL; https://doi.org/10.3945/ajcn.114.086314

8. Morsy M.D., Abdel-Razek H.A., Eid R.A., El-Naby W.M.H. Impact of different doses of sucrose on the liver function and ultrastructure in rats // Med. J. Cairo Univ. 2014. Vol. 82, N 1. P. 133-144.

9. Волощук О.Н., Копыльчук Г.П., Кадайская Т.Г. Состояние системы энергообеспечения митохондрий печени в условиях алиментарной депривации протеина // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 3. С. 12-16.

10. Reeves P., Nielsen F., Fahey G. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: Final Report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the AIN-76A Rodent Diet // J. Nutr. 1993. Vol. 123, N 11. P. 1939-1951.

11. Fernandes-Lima F., Monte L., Nascimento F., Gregorio B. Short exposure to a high-sucrose diet and the first "hit" of nonalcoholic fatty liver disease in mice // Cells Tissues Organs. 2016. Vol. 201, N 6. P. 464-472. doi: 10.1159/000446514

12. Rose C.I., Henderson A.R. Reaction rate assay of serum sorbitol dehydrogenase activity at 37 °C // Clin. Chem. 1975. Vol. 21. P. 1619-1624.

13. Kopylchuk G.P., Voloshchuk O.M. Peculiarities of the free radical processes in rat liver mitochondria under toxic hepatitis on the background of alimentary protein deficiency // Ukr. Biochem. J. 2016. Vol. 88, N 2. P. 66-72.

14. Van Der Vies J. Two methods for the determination of glycogen in liver // Biochem. J. 1954. Vol. 57, N 3. P. 410-416. doi: 10.1042/bj0570410

15. Botros M., Sikaris K.A. The de ritis ratio: the test of time // Clin. Biochem. Rev. 2013. Vol. 34, N 3. P. 117-130.

16. Ozer J., Ratner M., Shaw M. et al. The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity // Toxicology. 2008. Vol. 245, N 3. P. 194-205. doi: 10.1016/j.tox.2007.11.021

17. Singh A., Bhat T.K., Sharma O.P. Clinical biochemistry of hepato-toxicity // J. Clin. Toxicol. 2011. Vol. S4. P. 1-19. doi: 10.4172/2161-0495.S4-001

18. Волощук О.Н., Копыльчук Г.П., Бучковская И.М. Активность маркерных ферментов печени при токсическом гепатите в условиях алиментарной депривации протеина // Экспер. и клин. гастроентерол. 2014. Т. 108, № 8. С. 96-100.

19. Lambis L.A., Solana T.J.B., Gastelbondo B.P. et al. Risk factors associated with nonalcoholic fatty liver disease in a Colombian Caribbean population // Rev. Col. Gastroenterol. 2016. Vol. 31, N 2. P. 89-94.

20. Tan B.L., Norhaizan M.E., Liew W.P. Nutrients and oxidative stress: friend or foe? // Oxid. Med. Cell Longev. 2018. Vol. 2018. Article ID 9719584. doi: 10.1155/2018/9719584

References

1. Wu G. Dietary protein intake and human health. Food Funct. 2016; 7 (3): 1251-65. doi: 10.1039/c5fo01530h

2. Tikole R.V., Kulkarni R., Uppinakudru S., et al. Nutritional deficiency disorders in paediatrics: an ayurvedic perspective. Int J Res Ayurveda Pharm. 2013; 4 (4): 605-7. doi: 10.7897/2277-4343.04431

3. Malta А., de Oliveira J.C., Ribeiro T.A., Tofolo L.P., et al. Low-protein diet in adult male rats has long-term effects on metabolism. J Endocrinol. 2014; 221 (2): 285-95. doi: 10.1530/JOE-13-0473

4. Kitada M., Ogura Y., Monno I., Koya D. The impact of dietary protein intake on longevity and metabolic health. EBioMedicine. 2019; 43: 632-40. URL: https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.04.005

5. Maciejczyk M., Matczuk J., Zendzian-Piotrowska M., et al. Eight-week consumption of high-sucrose diet has a pro-oxidant effect and alters the function of the salivary glands of rats. Nutrients. 2018; 10 (10); 1-19. doi: 10.3390/nu10101530

6. Ragab S.M., Abd Elghaffar S.Kh., El-Metwally T.H., et al. Effect of a high fat, high sucrose diet on the promotion of non-alcoholic fatty liver disease in male rats: the ameliorative role of three natural compounds. Lipids Health Dis. 2015; 14: 83. doi: 10.1186/s12944-015-0087-1

7. Chung M., Ma J., Patel K., et al. Fructose, high-fructose corn syrup, sucrose, and nonalcoholic fatty liver disease or indexes of liver health: a systematic review and meta-analysis. Am J Clin Nutr. 2014; 100 (3): 833-49. URL; https://doi.org/10.3945/ajcn.114.086314

8. Morsy M.D., Abdel-Razek H.A., Eid R.A., El-Naby W.M.H. Impact of different doses of sucrose on the liver function and ultrastructure in rats. Med J Cairo Univ. 2014; 82 (1): 133-44.

9. Voloshchuk O.N., Kopylchuk G.P., Kadayskaia T.G. State of the energy-supply system of the liver mitochondria under the conditions of alimentary deficiency of protein. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2014; 83 (3): 12-6. (in Russian)

10. Reeves P., Nielsen F., Fahey G. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: Final Report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the AIN-76A Rodent Diet. J Nutr. 1993; 123 (11): 1939-51.

11. Fernandes-Lima F., Monte L., Nascimento F., Gregorio B. Short exposure to a high-sucrose diet and the first "hit" of nonalcoholic fatty liver disease in mice. Cells Tissues Organs. 2016; 201 (6): 46472. doi: 10.1159/000446514

12. Rose C.I., Henderson A.R. Reaction rate assay of serum sorbitol dehydrogenase activity at 37 °C. Clin Chem. 1975; 21: 1619-24.

13. Kopylchuk G.P., Voloshchuk O.M. Peculiarities of the free radical processes in rat liver mitochondria under toxic hepatitis on the background of alimentary protein deficiency. Ukr Biochem J. 2016; 88 (2): 66-72.

14. Van Der Vies J. Two methods for the determination of glycogen in liver. Biochem J. 1954; 57 (3): 410-6. doi: 10.1042/bj0570410

15. Botros M., Sikaris K.A. The de ritis ratio: the test of time. Clin Biochem Rev. 2013; 34 (3): 117-30.

16. Ozer J., Ratner M., Shaw M., et al. The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity. Toxicology. 2008; 245 (3): 194-205. doi: 10.1016/j.tox.2007.11.021

17. Singh A., Bhat T.K., Sharma O.P. Clinical biochemistry of hepa-totoxicity. J Clin Toxicol. 2011; S4: 1-19. doi: 10.4172/2161-0495. S4-001

18. Voloshchuk O.N., Kopylchuk G.P., Buchkovskaia I.M. Activity of the marker liver enzymes under the conditions of toxic hepatitis and alimentary deprivation of protein. Eksperimental’naya i klin-icheskaya gastoenterologiya [Experimental and Clinical Gastroenterology]. 2014; 108 (8): 96-100. (in Russian)

19. Lambis L.A., Solana T.J.B., Gastelbondo B.P., et al. Risk factors associated with nonalcoholic fatty liver disease in a Colombian Caribbean population. Rev Col Gastroenterol. 2016; 31 (2): 89-94.

20. Tan B.L., Norhaizan M.E., Liew W.P. Nutrients and oxidative stress: friend or foe? Oxid Med Cell Longev. 2018; 2018: 9719584. doi: 10.1155/2018/9719584