В настоящее время в России по данным, представленным в национальной нанотехнологической сети, производится более 200 наименований наноматериалов. Несмотря на неоспоримые инновационные качества, наноматериалы в силу своих особых физико-химических свойств могут представлять определенную угрозу для здоровья и безопасности человека и вызывать в будущем серьезные социальные, экономические и этические проблемы [5]. Присутствие нанодисперсных частиц, в том числе тяжелых металлов, в выбросах промышленных предприятий в атмосферный воздух и сбросах в водоемы может обусловливать загрязнение источников питьевого водоснабжения и сельскохозяйственной продукции.
С учетом прогнозируемого роста контактов человека с наноматериалами, в том числе при поступлении их в организм с продуктами питания, особую актуальность приобретают вопросы их токсикологогигиенической оценки безопасности. Требуются уточнение и систематизация недостаточно изученных физических и токсикологических параметров при пероральном поступлении в организм ряда широко распространенных в объектах среды обитания наночастиц тяжелых металлов, в частности оксида марганца [4].
Цель данного исследования - токсиколого-гигиеническая оценка безопасности нанодисперсного оксида марганца (III, IV).
Материал и методы
Предварительная оценка потенциальной опасности наночастиц оксида марганца (III, IV) со структурой бернессита выполнена по расчету суммарного показателя частных опасностей (D) генеральной определительной таблицы, составленной на основании обобщения данных о физико-химических параметрах, молекулярно-биологических и токсических свойствах в соответствии с методическими указаниями [7].
Синтез и оценка удельной поверхности частиц нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) проведены в лаборатории многофазных дисперсных систем института технической химии УрО РАН (г. Пермь). Водный монодисперсный наноразмерный оксид марганца (III, IV) получали в микроэмульсионной системе (водный раствор ПАВ - цетилтриметиламмоний бромид) [2]. Размер и форму тестируемого материала оценивали методом динамического светорассеивания на анализаторе частиц "Horiba LB-550" (фирма "HORIBA Jobin Yvon S.A.S.", Франция). Концентрацию частиц в растворе осуществляли методом атомноадсорбционной спектрометрии с ацетилено-воздушным пламенем на анализаторе "Perkin Elmer 3110" (фирма "Perkin Elmer Corporation", США) в лаборатории анализа наноматериалов и физических факторов отдела химико-аналитических методов исследований ФБУН "ФНЦ медикопрофилактических технологий управления рисками здоровью населения" (г. Пермь). Стабильность нанодисперсного состояния частиц в водном растворе обеспечивали ультразвуковой обработкой. Для сравнительного анализа использован водный дисперсный раствор оксида марганца (III, IV), содержащий частицы в микродиапазоне.
Параметры острой токсичности нанодисперсного оксида марганца (III, IV) оценивали на основании результатов развернутых острых опытов в соответствии с методическими указаниями [3, 6] на 70 нелинейных белых мышах - самцах с массой тела 27±2 г (M±m). Животные были разделены на 7 групп по 10 особей в каждой. Мышам опытных групп (1-3-я) вводили внутрижелудочно однократно через зонд нанодисперсный раствор оксида марганца (III, IV) в дозе соответственно 2000, 3500 и 5000 мг/кг в виде водного раствора в объеме, составляющем 1-2% от массы тела животных. Мышам групп сравнения (4-6-я) вводили микродисперсный раствор оксида марганца (III, IV) соответственно в тех же дозах, что и животным 1-3-й групп, с соблюдением аналогичных условий введения. Контрольная, 7-я группа, получала воду однократно внутрижелудочно через зонд из того же расчета.
Срок наблюдения за животными после введения тестируемых веществ составил 14 сут. Мышей содержали по 5 особей в клетке. На протяжении всего эксперимента мыши получали полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов" [6]. Доступ к корму и питьевой воде не ограничивали.
Параметры острой токсичности (LD50) рассчитывали с помощью статистической программы Probit Analysis v.4.0, реализующей алгоритм метода максимального правдоподобия [8]. На основании результатов исследования острой токсичности расчетным способом устанавливали индекс кумуляции по отношению результатов гибели животных в течение 1-х суток к показателю гибели в течение всего эксперимента. С целью прогноза степени опасности рассчитывали величины пороговой дозы хронического эффекта и максимально недействующей дозы для нано- и микродисперсных растворов оксида марганца (III, IV) [3].
Критериями токсического действия соединений служили летальный эффект, среднее время гибели животных, изменение поведения, общего состояния, внешнего вида, специфические симптомы развития интоксикации. У животных из 2-й и 5-й групп, погибших во время эксперимента, забирали печень, селезенку, тимус, левое и правое легкие, левую и правую почки, сердце, подвздошную кишку, головной мозг. Органы фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, серийные срезы с блоков окрашивали гематоксилином и эозином. Изучали структуру органов с использованием светового микроскопа "Micros" (фирма "Micros", Австрия) при увеличении Ч200-1000. У выживших в эксперименте животных из групп 1-7 на 4-й день эксперимента забирали венозную кровь из хвостовой вены при ампутировании кончика хвоста хирургическим скальпелем, готовили мазки, фиксировали их в метиловом спирте. В дальнейшем мазки окрашивали по методу Паппенгейма, включающему комбинацию двух способов: Май-Грюнвальда и Романовского-Гимзы [1]. Оценку изменений эритроцитов и тромбоцитов в мазках крови выполняли при помощи микроскопа "Micros" (фирма "Micros", Австрия) при увеличении Ч1000. Из эксперимента животных выводили декапитацией.
Результаты и обсуждение
На основании экспериментальных исследований установлено, что фактический размер наночастиц оксида марганца (III, IV) в дисперсном растворе составил 34-39 нм (97,8% от общего количества частиц); размер его микрочастиц в дисперсном растворе, использованном в качестве сравнения, составлял 0,4-592 мкм. Наночастицы имели несферическую форму, что способствует снижению скорости их выведения из организма фагоцитирующими клетками иммунной системы через лимфатические протоки и обусловливает увеличение времени контакта частиц с тканями [7].
Удельная площадь поверхности наночастиц оксида марганца (III, IV) составила 150,23 м2/г и превысила в 1,2 раза площадь поверхности микрочастиц (130 м2/г), что может обусловливать высокую реакционную способность наночастиц in vitro и in vivo [10].
По имеющимся в литературе данным, при взаимодействии с клеточными мембранами наночастицы оксида марганца (IV) стимулируют избыточное образование активных форм кислорода [9, 12] с последующей интенсификацией апоптоза [11, 13]. Наночастицы оксида марганца (III, IV) обладают цитотоксической активностью, реализующейся путем угнетения митохондриальной деятельности [12]. В результате комплексной оценки физических параметров и биологических эффектов предварительно установлено, что наночастицы оксида марганца (III, IV) опасны для здоровья человека (D=1,75 - средняя степень опасности), в связи с чем необходимы дальнейшие токсиколого-гигиенические исследования для установления качественных и количественных параметров токсичности.
В остром эксперименте установлено, что клиническая картина острой интоксикации при введении нано- и микродисперсных растворов оксида марганца (III, IV) носит однотипный и неспецифический характер. У животных 1-6-й групп в первые 20 мин отмечались повышенная возбудимость, судороги, сменившиеся состоянием торможения и угнетения, слабой реакцией на звуковые и болевые раздражители, поверхностным дыханием. Гибель экспериментальных животных во 2-й и 3-й группах отмечалась преимущественно в 1-е сут, в 1-й группе - в период до 48 ч, а в 5-й и 6-й группах сравнения - в период от 48 до 72 ч (см. таблицу). В 4-й и 7-й группах гибели животных в течение срока наблюдения не засвидетельствовано.
Динамика гибели животных после однократного зондового внутрижелудочного введения различных доз нано- и микродисперсного растворов оксида марганца (III, IV)
Установлено, что при однократном зондовом внутрижелудочном введении LD50 нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) составляет 2340 мг/кг (3-й класс опасности), микродисперсного его раствора - 6000 мг/кг (4-й класс опасности). С помощью расчетов определено, что наночастицы указанного раствора обладают сверхкумулятивностью (индекс кумулятивности - Ik=0,79), микрочастицы - средней кумулятивностью (Ik=0). Расчетные величины пороговой дозы и максимально недействующей дозы хронического эффекта для нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) составили соответственно 1,6 и 0,26 мг/кг, что в 2,3 раза ниже аналогичных показателей для микродисперсного раствора.
Анализ изменений в венозной крови экспериментальных животных позволил установить, что наночастицы дисперсного раствора оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 и 5000 мг/кг оказывают более выраженное токсическое действие на эритроциты и тромбоциты, чем микродисперсный аналог. Это подтверждается наличием полихроматофильных эритроцитов, доля которых составила 20 и 35% от общего числа эритроцитов в периферической крови мышей соответственно 2-й и 3-й группы. При введении микродисперсного оксида марганца (III, IV) в аналогичных дозах доля полихроматофильных эритроцитов в крови мышей составила соответственно 10 и 15%. В 10-20% эритроцитов крови экспериментальных животных 2-й и 3-й группы обнаружены патологические тельца Жоли, что в 2 раза превысило данный показатель в крови мышей в 5-й и 6-й группах. Нанодисперсный раствор оксида марганца (III, IV) вызывает массивную агрегацию тромбоцитов в крови экспериментальных животных 2-й и 3-й групп, в то время как микродисперсный раствор приводит к единичным явлениям агрегации тромбоцитов, причем только при введении дозы 5000 мг/кг. В мазках крови мышей 7-й группы патологических изменений не обнаружено.
Морфологические исследования при введении нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг выявили изменения во всех исследованных органах экспериментальных животных. Отмечены резкое расширение и полнокровие венозных сосудов печени, почек, заметное переполнение кровью венозных сосудов миокарда и эпикарда, а также камер сердца. В мозговом веществе почек обнаружены кровоизлияния. Наблюдались пролиферативные процессы в макрофагальной и лимфоидной системах экспериментальных животных. Выявлены повышение количества макрофагов и их активизация в печени, обеих почках и (особенно) в легких (рис. 1). В печени клетки Купфера увеличены и выбухают в просвет синусоидных капилляров, мезангиальные клетки в почечных тельцах гипертрофированы, а многочисленные альвеолярные макрофаги содержат фагоцитированный материал. Лимфоидные узелки белой пульпы селезенки расширены, имеют тенденцию к слиянию, в них не наблюдается типичного деления на зоны. В органе преобладает красная пульпа с явлениями диффузной и очаговой лимфатизации. Пролиферация клеток лимфоцитарного и макрофагального рядов приводит к лейкоцитарной инфильтрации паренхиматозных органов. Выявляются многочисленные перипортальные и внутридольковые лим-фоидно-гистиоцитарные инфильтраты в печени, и периваскулярные и межканальцевые - в почке (рис. 2 а, б). Инфильтрация органов лимфоцитами настолько активна, что преодолевает гематоэнцефалический барьер - лимфоидные инфильтраты обнаруживаются даже в белом веществе больших полушарий головного мозга (рис. 3).
При введении микрородисперсного раствора оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг наблюдается некоторое расширение синусоидных капилляров печени и сосудов микроциркуляторного русла почек (рис. 4). Расширен просвет капсул некоторых почечных телец (рис. 5). В паренхиматозных органах лимфогиостоцитарная инфильтрация носит эпизодический характер, инфильтраты располагаются только в соединительной ткани, они небольших размеров. В отличие от мышей 2-й опытной группы, у животных 5-й группы в коре больших полушарий головного мозга инфильтраты не определяются; отмечается только незначительный периваскулярный и умеренный перицеллюлярный отек, преимущественно в зернистом слое (рис. 6).
Рис. 1. Макрофагальная реакция в легком мыши 2-й (опытной) группы, погибшей в 1-е сут при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, окраска гематоксилином и эозином, *1000
Рис. 2. Лимфогистиоцитарные внутридольковые инфильтраты в печени мыши (а) и периваскулярные инфильтраты в почке мыши (б) 2-й группы, погибшей в 1-е сут при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, окраска гематоксилином и эозином (здесь и на последующих рисунках); 200
Рис. 3. Лимфоцитарная инфильтрация в белом веществе больших полушарий головного мозга мыши 2-й группы, погибшей в 1-е сут при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, *400
Рис. 4. Расширение синусоидных капилляров и гипертрофия ядер части гепатоцитов печени мыши 5-й группы (сравнения), погибшей через 40 мин при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, *400
Таким образом, анализ морфологических изменений внутренних органов экспериментальных животных при однократном внутрижелудочномзондовом введении нано- и микродисперсного растворов оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг позволил установить более выраженный их характер у мышей 2-й группы, чем у животных 5-й. Эти изменения касаются системы кровообращения и характеризуются расширением и полнокровием венозных кровеносных сосудов во всех изученных органах. Особенно заметно переполнение кровью венозных сосудов миокарда, эпикарда и всех камер сердца. В группе сравнения выраженных изменений у мышей не обнаружено - у них выявляется лишь пролиферация лимфоидной системы, результатом чего становится гипертрофия коркового вещества долек тимуса, лимфоидных фолликулов белой пульпы селезенки и лимфатизации ее красной пульпы. При этом в печени, почках и легких животных 5-й группы также наблюдалась активация клеток макрофагального ряда. Пролиферация лимфоидных клеток и макрофагов приводит к гистолейкоцитарной инфильтрации паренхиматозных органов. Иными словами, возникающие при воздействии нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) изменения со стороны внутренних органов выражены в большей степени, чем при действии микродисперсного раствора. Они характеризуются в основном нарушениями со стороны венозного русла, что приводит к кровоизлияниям в паренхиматозных органах, особенно в почках. При введении микродисперсного раствора оксида марганца кровоизлияний во внутренних органах не обнаруживается.
Анализ полученных результатов позволяет заключить, что нанодисперсный раствор оксида марганца (III, IV) при однократном зондовом внутрижелудочном введении обладает в 2,6 раза большей степенью токсичности и кумулятивности (3-й класс опасности по критерию LD50), чем микродисперсный раствор (0,4-592 мкм) (4-й класс). Прогнозный расчет параметров хронической токсичности показал, что пороговая и максимально недействующая дозы для нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) составила соответственн о 1,6 и 0,26 мг/кг, что в 2,3 раза ниже аналогичных показателей для микродисперсного аналога. Внутрижелудочное однократное поступление наночастиц дисперсного раствора оксида марганца (III, IV) в организм в дозе 3500 мг/кг вызывает гематотоксическое действие, проявляющееся в виде патологических включений в эритроцитах и повышенной агрегации тромбоцитов, степень выраженности и распространенности которых нарастает с увеличением дозы. Наблюдаются расстройства кровообращения в виде расширения и полнокровия вен и заполнения их просвета эритроцитами, приводящие к кровоизлияниям во всех изученных органах. Выявлены пролиферативные процессы в лимфоидной и макрофагальной системах, результатом которых являются гипертрофия коркового вещества долек тимуса, лимфоидных фолликулов белой пульпы селезенки и лимфатизации ее красной пульпы, активация клеток макрофагального ряда в печени, почках и легких.
Рис. 5. Расширение просвета капсул почечных телец в почке мыши 5-й группы, погибшей через 40 мин при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, *400
Рис. 6. Незначительный периваскулярный и умеренный перицеллюлярный отек в зернистом слое коры больших полушарий головного мозга мыши 5-й группы, погибшей через 8 ч при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, *400
Литература
1. Бокуняева Н.И., Жевелик Ю.С., Золотницкая Р.П. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - М.: Медицина, 1975. - 383 с.
2. Грег С., Синг К. Адсорбция, удельная поверхность, пористость: Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - 306 с.
3. Методические указания по разработке и научному обоснованию предельно допустимых концентраций вредных веществ в воде водоемов. - М.: МЗ СССР, 1976.
4. Онищенко Г.Г., Зайцева Н.В., Землянова М.А. Гигиеническая идентификация последствий для здоровья при внешнесредовой экспозиции химических факторов / Под ред. Г.Г. Онищенко. - Пермь: Книжный формат, 2011. - 529 с.
5. Онищенко Г .Г. Стратегия безопасности наноиндустрии // Здоровье населения и среда обитания. - 2011. - № 5. - С. 4-8.
6. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов: методические указания - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 43 с.
7. Тутельян В.А., Гмошинский И.В., Гинцбург А.Л. и др. Методические рекомендации по выявлению наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека: Метод. рекомендации. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 35 с.
8. Finney D .J. Probit Analysis. - Cambridge, 2009. - 272 p.
9. Hussan S.M., Jovorina A.K. The interaction of manganes nanoparticles with pc-12 cells induces dopamine depletion // Toxicol. Sci. - 2006. - Vol. 92, N 2. - P. 456-463.
10. Lison D., Lardot C., Huaux F. et al. Infuence of partice surface area on the toxicity of insoluble manganese dioxide dusts // Arch. Toxicol. - 1997. - Vol. 71. - P. 725-729.
11. Pahl H.L. Activators and target genes of Rel/NF-kB transcription factors // Oncogene. - Vol. 18. - P. 6853-6866.
12. Sakon S., Xue X., Takekawa M. et al. NF-kB inhibits TNFinduced accumulation of ROS that mediate prolonged MAPK activation and necrotic cell death // EMBO J. - 2003. - Vol. 15. - P. 3 8 9 8 - 3 9 0 9 .
13. Takizawa H., Ohtoshi T., Kawasaki S. et al. Diesel exhaust particles induce NF-kB activation in human bronchial epithelial cells in vitro: importance in cytokine transcription // J. Immunol. - 1999. - Vol. 162. - P. 4705-4711.