Прямое определение продуцентов Т-2- и НТ-2-микотоксинов грибов рода Fusarium в продовольственном зерне методом ПЦР (сообщение 2)

РезюмеДля минимизации погрешности ПЦР-анализа при определении видового состава токсигенных грибов рода Fusarium непосредственно в зерне проведена работа по совершенствованию метода экстракции грибной ДНК. Исследованы образцы зерна с известными уровнями загрязнения Т-2- и НТ-2-токсинами. Сопоставлена эффективность экстракции ДНК Fusarium spp. методами нуклеосорбции и методом с цетилтриметиламмоний бромидом (ЦТАБ). Показана эффективность метода ЦТАБ в сочетании с увеличением количества исходной пробы размолотого зерна в 10 раз. При таком подходе выявлено бо￿льшее число видов Fusarium, чем при ПЦР-анализе объединенной пробы мицелия Fusarium тех же образцов. В экстракте ДНК из образца ячменя обнаружен труднокультивируемый вид F. langsethiae, не выявленный в пробе объединенного мицелия. Данный образец зерна содержал самые высокие уровни Т-2/НТ-2-токсинов - 0,075/0,345 мг/кг (определенных ВЭЖХ) из числа положительных проб. В других образцах зерна (как содержащих, так и не содержащих Т-2- и НТ-2-токсины) методом ПЦР выявлен F. sporotrichioides - потенциальный продуцент этих токсинов. Для 10 моноспоровых изолятов F. sporotrichioides, выделенных из зерна, исследовано образование Т-2- и НТ-2-токсинов в эксперименте при выращивании на среде картофельно-сахарозный агар. Количество синтезированного Т-2-токсина, измеренного методом ИФА, составляло от 0,4 до 184,5 мг/л среды. При этом 3 штамма показали очень высокий уровень (от 117,2 до 184,4 мг/л), 2 из которых были выделены из ячменя, не содержащего эти токсины. Таким образом, отсутствие токсина в образцах зерна не гарантирует отсутствие в них высокоактивных продуцентов микотоксинов. Показано, что прямое определение в зерне Fusarium spp. методом ПЦР с экстракцией ДНК грибов по методу ЦТАБ с увеличенной массой исходной пробы позволяет выявить большее число видов Fusarium (включая некультивируемые штаммы), чем методом микологического посева с ПЦР-анализом пробы объединенного мицелия.

Ключевые слова:Fusarium spp., ПЦР в реальном времени, экстракция ДНК из зерна, продовольственное зерно, Т-2- и НТ-2-токсины, F. sporotrichioides, F. langsethiae

Вопр. питания. - 2013. - № 4. - С. 48-54.

Известно, что грибы рода Fusarium относятся к так называемым полевым грибам - заражающим злаковые еще в поле. Они поражают растение на разных стадиях развития, выделяя при этом вторичные метаболиты, в том числе токсины, патогенные для человека. В процессе роста, развития и созревания злаковых культур может меняться микофлора зерна, в частности видовой состав Fusarium spp., но независимо от этого в тканях растений и в зерновке остаются ДНК грибов и синтезированные ими микотоксины, анализ которых важен для ранней и быстрой диагностики партий продовольственного зерна, особенно для зерна, закладываемого на хранение.

В проведенных нами ранее исследованиях [5] разработан подход к ускоренному определению зараженности продовольственного зерна грибами рода Fusarium. Он основан на совмещении традиционного микологического посева на этапе выделения и метода ПЦР с использованием видоспецифичных праймеров на этапе идентификации, позволяет значительно сократить время анализа и получать высокоспецифичные данные о видовом составе жизнеспособных продуцентов трихотеценовых микотоксинов (ТТМТ).

В то же время в зерне могут присутствовать и нежизнеспособные (некультивируемые) виды грибов, токсины которых, тем не менее, содержатся в зерне.

В этом случае полную информацию может дать только анализ ДНК грибов, выделенной непосредственно из зерна. Однако гетерогенность загрязнения партии зерна и неравномерность распределения мицелия в зерновке, а также малые количества исследуемого материала (обычно размер навески для экстракции ДНК - 200 мг) могут вносить погрешность в результаты, получаемые методом ПЦР-анализа. Поэтому представляется важным дальнейшее совершенствование метода определения зараженности продовольственного зерна грибами рода Fusarium, позволяющего идентифицировать виды, содержащиеся в зерне в некультивируемом состоянии.

Большое количество публикаций последних лет подтверждает видоспецифичный характер токсинообразования Fusarium spp., что привело к появлению классификации видов Fusarium по хемотипам [3]. Для дальнейшего развития данного направления актуально проведение комплексных исследований по выделению чистых культур Fusarium из продовольственного зерна различного географического происхождения, подтверждению их видовой принадлежности методом ПЦР и определению спектра продуцируемых ими токсинов высокочувствительными и специфичными методами. Это даст возможность с высокой степенью вероятности прогнозировать присутствие опасных фузариотоксинов в продуктах растительного происхождения в зависимости от видового состава грибов-контаминантов.

Цель исследования - подбор эффективного метода экстракции ДНК грибов рода Fusarium непосредственно из зерна для определения их видового состава, сравнительный анализ видового состава Fusarium, обнаруживаемого в образцах зерна микологическим методом и методом ПЦР непосредственно в зерне, а также определение токсинообразующей способности изолятов

Fusarium spp. - продуцентов Т-2-токсина, выделенных из зерна с различным уровнем загрязненности этим токсином.

Материал и методы

1. Экстракция ДНК грибов непосредственно из зерна

Метод ЦТАБ (СТАВ). Метод основан на использовании в качестве детергента цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ), растворяющего мембраны клеток, что позволяет в дальнейшем разделить ДНК и полисахариды. Для экстракции брали навеску размолотого зерна массой 2 г.

При экстракции использовали протокол, рекомендованный Еврокомиссией для анализа образцов пищевых продуктов на присутствие ГМО растений [7]. Режим экстракции - 30 мин при 65 °С.

Метод "ДНК-сорб-С". Экстракцию проводили с использованием коммерческого набора "ДНКсорб-С" производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Навеску размолотого зерна массой 100 мг помещали в микропробирку с 800 мкл буфера лизирующего раствора и 34 мкл лизирующего реагента. Режим экстракции - 1 ч при 64 °С.

Выделение ДНК проводили в соответствии с инструкцией к набору.

Метод "Сорб-ГМО-А". Экстракцию проводили с использованием коммерческого набора "СорбГМО-А" производства ЗАО "Синтол"/ВНИИСБ. Навеску размолотого зерна массой 100 мг помещали в микропробирку с 800 мкл лизирующего буфера и 15 мкл протеиназы. Режим экстракции - 30 мин при 60 °С. Выделение ДНК проводили в соответствии с инструкцией к набору.

2. Экстракцию ДНК из мицелия грибов проводили по ранее описанной методике [5].

3. ПЦР в режиме реального времени проводили по ранее описанной методике [5].

Определение продукции Т-2-токсина штаммами Fusarium spp. в условиях in vitro проводили на моноспоровых изолятах Fusarium spp., выделенных из образцов изучаемого продовольственного зерна. Для этого в асептических условиях инокулировали картофельно-сахарозный агар (КСА) [3], разлитый по 1 мл в стерильные флаконы вместимостью 10 мл, частью мицелия исследуемых штаммов Fusarium, пробирки закрывали газопроницаемыми целлюлозными пробками. Посевы термостатировали при 24±1 °С в течение 7 сут.

Экстракцию Т-2-токсина, накопленного штаммами Fusarium при термостатировании, проводили 70%-ным раствором метанола, который вносили во флаконы с мицелием в количестве 1 мл, пробирки герметично укупоривали резиновыми пробками и встряхивали в течение 20±1 ч. Полученный экстракт отбирали в пластиковые герметично закрывающиеся пробирки.

Содержание-Т-2 токсина в экстрактах определяли иммуноферментным методом с использованием тест-набора RIDASCREEN ® T-2-Toxin, производства фирмы "R-Biopharm", Германия, в соответствии с прилагаемой методикой.

Экстракты предварительно разводили в 1000 и в 10 000 раз 70%-ным раствором метанола.

Содержание Т-2- и НТ-2-токсинов в зерне определяли методом ВЭЖХ [6].

Результаты и обсуждение

1. Экстракция ДНК Fusarium из зерна

Поскольку количество ДНК Fusarium spp., содержащееся в зерне, несоизмеримо меньше, чем в грибном мицелии, необходимо было подобрать эффективный метод экстракции, позволяющий выявлять все присутствующие в данном образце зерна виды Fusarium spp.

Для экстракции ДНК из растительных тканей чаще всего используют 2 варианта методов:

первый - на основе использования детергента ЦТАБ, лизирующего мембраны клеток грибов и позволяющего в дальнейшем разделять ДНК и полисахариды, и второй - на основе нуклеосорбции, основанный на концентрировании ДНК на сорбенте. В табл. 1 приведены технические параметры методов, использованных в настоящей работе. Как видно при сравнении технических параметров (число стадий, продолжительность анализа), наиболее предпочтительными с практической точки зрения являются методы на основе нуклеосорбции. Именно это обстоятельство стало поводом для проверки возможности использования методов "ДНК-сорб-С" и "Сорб-ГМО-А" для экстракции ДНК Fusarium непосредственно из зерна.



2. Оценка эффективности способов экстракции ДНК Fusarium spp. непосредственно из зерна для видовой идентификации методом ПЦР в реальном времени

Сравнительную оценку эффективности методов экстракции ДНК Fusarium spp. проводили на 2 образцах зерна (№ 6 и № 11), отличающихся по видовому составу жизнеспособных Fusarium spp., установленному ранее [5]. Критерием полноты выделения целевой ДНК Fusarium spp. было совпадение видового состава Fusarium, определенного в экстрактах ДНК, полученных непосредственно из зерна, и в экстрактах ДНК из объединенной пробы мицелия грибов [5].

Как видно из табл. 2, наибольшее количество видов Fusarium было обнаружено в экстрактах ДНК из зерна, полученных методом ЦТАБ.

Для образца № 6 все 4 вида Fusarium, обнаруженные в экстракте ДНК из мицелия, были выявлены и в экстракте ДНК из зерна. Для образца № 11 в экстракте ДНК из зерна дополнительно был обнаружен F. graminearum, который не был выявлен в мицелии, что можно объяснить некультивируемостью штамма, присутствовавшего в зерне изначально, но утратившего жизнеспособность в дальнейшем.

При использовании набора "ДНК-сорб-С" в экстракте ДНК из образца зерна № 6 было обнаружено 3 вида и не был обнаружен F. tricinctum, присутствовавший в мицелии, а из образца зерна № 11 не был обнаружен F. sporotrichiodes, но при этом обнаружен F. graminearum, не выявленный в мицелии, что совпало с результатами, полученными для экстракта ДНК методом ЦТАБ, и подтверждает первоначальную контаминацию данного образца зерна видом F. graminearum.

Данные отличия могли быть обусловлены разницей в количестве исходного материала, взятого для экстракции (100 мг и 2 г соответственно), и подтверждает преимущество большей массы навески.

При использовании набора "Сорб-ГМО-А" было выявлено больше всего несоответствий в видовом составе Fusarium в зерне и в мицелии - в экстракте ДНК из зерна образца № 6 не выявлен ни один вид Fusarium, а в экстракте ДНК из зерна образца № 11 выявлен только F. tricinctum. По-видимому, более мягкие термические условия экстракции в данном методе оказываются недостаточными для полноты экстракции ДНК грибов из растительного материала.





Таким образом, сравнение использованных методов экстракции ДНК Fusarium spp. из зерна по критерию полноты видового состава Fusarium spp. показало, что наиболее подходящим для этой цели является метод ЦТАБ, несмотря на его многостадийность и длительность. Предпочтение этого метода для экстракции ДНК грибов также описано в работах исследователей для литобионтных грибов [1].

3. Прямое обнаружение Fusarium spp. в образцах зерна методом ПЦР с видоспецифичными праймерами

Используя выработанный подход, на следующем этапе определяли зараженность зерна наиболее вероятными потенциальными продуцентами Т-2и НТ-2-токсинов - F. sporotrichiodes и F. langsethiae, а также F. poae. В эксперименте использовали образцы зерна с известным уровнем загрязнения микотоксинами [5, 9]. Комплексные исследования загрязненности продовольственного зерна ТТМТ (Т-2- и НТ-2-токсинами) и зараженности продуцентами этих токсинов позволяют наиболее полно отразить картину контаминации зерна. В табл. 3 приведены результаты обнаружения F. sporotrichioides, F. langsethiae и F. poae в экстрактах ДНК, полученных из пробы объединенного мицелия [5] и непосредственно из зерна, а также данные о содержании токсинов в этих же образцах зерна [9].

Наибольшее число видов Fusarium обнаружено в экстрактах ДНК из зерна по сравнению с составом в экстрактах ДНК из объединенной пробы мицелия. В 8 из 14 образцов зерна виды Fusarium, обнаруженные в зерне, не совпадают с видами, обнаруженными в мицелии (образцы № 12, 17-20, 22-24). Это, безусловно, связано с достаточно высокой чувствительностью метода идентификации на основе ПЦР при исследовании непосредственно зерна, позволяющего обнаруживать все ранее присутствующие виды независимо от их жизнеспособности. Особенно важно, что только в экстракте ДНК из зерна в образце № 18 был обнаружен опасный высокоактивный продуцент Т-2- и НТ-2-токсинов - F. langsethiae, который не был выявлен в экстракте ДНК из мицелия, а также при проведенном ранее микологическом посеве. Данный вид Fusarium, недавно выделенный в самостоятельный вид [8], представляет трудности в обнаружении традиционными микологическими методами, так как является медленнорастущим, а также может быть идентифицирован ошибочно как F. poae ввиду схожести макро- и микроморфологических признаков.

Из табл. 3 также видно, что именно образец зерна № 18, контаминированный F. langsethiae, содержал наибольшее количество Т-2- и НТ-2-токсинов.

В последнее время все чаще появляются сообщения об обнаружении F. langsethiae на территории РФ, причем в несвойственных для данного северного вида южных регионах [4], в данном случае образец № 18 (ячмень) был получен из Липецкой области.

В подавляющем большинстве образцов, загрязненных Т-2- и НТ-2-токсинами, обнаружен продуцент этих токсинов - F. sporotrichioides, исключение составил образец № 21 (пшеница), в котором обнаружены токсины, но не выявлен ни один из возможных продуцентов, что требует более подробного исследования видового состава контаминантов в этом образце. В то же время в образце № 12 (ячмень, сорт Карпеевка рядовая), не загрязненном Т-2- и НТ-2-токсинами, обнаружен F. sporotrichioides, что возможно для селекционных сортов, обладающих устойчивостью к фузариозу [2].

Исследование токсинообразующей способности продуцентов Т-2-токсина в опыте in vitro

10 штаммов F. sporotrichioides (моноспоровых изолятов) - продуцентов Т-2-токсина, выделенных из зерна, исследовали на способность к токсинообразованию в эксперименте in vitro, полученные данные представлены в табл. 4. Количество Т-2-токсина, обнаруженного в экстрактах, в среднем составило 58,8 мг/л среды (медиана 33,7 мг/л), при этом 3 штамма показали очень высокий уровень Т-2 - от 117,2 до 184,4 мг/л (штаммы № 10.10-1, 12.2-1 и 12.9-1/1). Такое количество Т-2-токсина сходно с уровнем его образования высокотоксигенными штаммами-продуцентами F. langsethiae - до 130 мг/л, что показано в ранее опубликованных исследованиях токсинообразования F. langsethiae в таких же условиях [8].

Наиболее токсиногенным оказался штамм F. sporotrichioides 12.9-1.1, выделенный из образца зерна № 12, в котором Т-2-токсин не был обнаружен (в пределах чувствительности метода ВЭЖХ - до 5 мкг/кг). Из полученных данных следует, что отсутствие токсина в образцах зерна не гарантирует отсутствие в них высокоактивных продуцентов опасных токсинов.

Таким образом, показано, что определение зараженности зерна грибами рода Fusarium с использованием метода ПЦР с экстракцией ДНК грибов по методу ЦТАБ, позволяет выявить более широкий спектр Fusarium spp., включая нежизнеспособные штаммы, по сравнению с традиционным методом микологического посева.

Для оценки безопасности продовольственного зерна выбор метода определения зараженности зерна токсигенными грибами рода Fusarium должен определяться целями исследования. Традиционный микологический метод позволяет обнаруживать жизнеспособные продуценты микотоксинов, что дает возможность оценить риск образования микотоксинов в партиях зерна, закладываемых на хранение. Метод ПЦР-анализа позволяет обнаружить в образцах зерна продуценты микотоксинов независимо от их жизнеспособности, что дает основание предполагать наличие в этих образцах и синтезированных ими микотоксинов.

Наиболее полная оценка уровня безопасности продовольственного зерна может быть получена при комплексном исследовании по двум показателям: зараженность зерна грибами рода Fusarium - продуцентами микотоксинов - и загрязненность микотоксинами, так как оба эти показателя дополняют, а не исключают друг друга.

Литература

1. Быков В.Ю., Богомолова Е.В. Успехи медицинской микологии. - Т. 5. - М.: Национальная академия микологии, 2005. - С. 12-13.

2. Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П. // Тр. по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 2009. - № 165. - С. 39-44.

3. Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П., Левитин М.М. и др. (ВИЗР). - Приложение к журналу "Защита и карантин растений" № 5, 2011. Фузариоз зерновых культур.

4. Гаврилова О.П., Гагкаева Т.Ю. // Иммунопатол., аллергол., инфектол. - 2010. - № 1. - С. 6.

5. Минаева Л.П., Короткевич Ю.В., Шевелева С.А. Подход к ускоренному определению зараженности продовольственного зерна грибами рода Fusarium и их видовой идентификации (Часть 1) // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 3. - С. 61-66.

6. Седова И.Б., Захарова Л.П., Пименова В.В. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 6. - С. 21-25.

7. Сома М., Кверчи М. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов. Сессия 6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ВОЗ Европейское Региональное Бюро. http://gmo-crl. jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/manual20RUS/UM20RusCovers.pdf

8. Torp M., Nirenberg H.I. // Int. J. Food Microbiol. - 2004. - Vol. 95. - P. 247-256.

9. Tutelyan V.A., Zakharova L.P., Sedova I.B. et al. // Food Additives and Contaminants: Part B. - 2013. - Vol. 6, N 2. - P. 1-7. http://dx.doi.org/10.1080/19393210.2013.767862

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»