Концентрация дейтерия в пищевых продуктах и влияние воды с модифицированным изотопным составом на показатели свободнорадикального окисления и содержание тяжелых изотопов водорода у экспериментальных животных
РезюмеВ статье представлены результаты исследования содержания дейтерия (D) в пищевых продуктах, а также влияния воды с модифицированным изотопным составом со сниженным содержанием дейтерия (ВМИС ССД) на концентрацию тяжелых изотопов водорода в крови и лиофилизированных тканях крыс. Наиболее существенное различие в содержании D выявлено при изучении образцов картофеля и свиного жира, у которых показатели стандартного дельта-обозначения (δ) D в промилле, привязанные к международному стандарту SMOW (Standard Mean Ocean Water), составили соответственно -83,2‰ и -250,7‰ (p<0,05). Среди исследованных образцов воды концентрация D колебалась от -75,5‰ (≪Нарзан≫) до +72,1‰ (≪Кубай≫), что свидетельствует о способности ряда пищевых продуктов увеличивать содержание тяжелых атомов водорода в организме. При экспериментальном моделировании пищевого рациона крыс-самцов линии Вистар в возрасте 5-6 мес (масса тела 235Ѓ}16 г) путем использования ВМИС ССД (δD=-743,2‰) вместо питьевой воды (δD=-37,0‰) с идентичным минеральным составом показано, что через 2 нед возможно достоверное (p<0,05) формирование изотопного (дейтерий-протий, D/H) гради- ента в организме. Изменения направленности изотопного D/H градиента у лабораторных животных в сравнении с его физиологическими показателями (72-127‰, ≪плазма>>ткани≫) обусловлено различной скоростью реакций изотопного обмена в плазме крови и тканях (печени, почки, сердца), что объясняется поступлением в составе модифицированного пищевого рациона органических субстратов с большей, чем у ВМИС ССД, концентрацией D, которые участвуют в построении клеточных структур и приводят в итоге к перераспределению D и смене направленности D/H градиента ≪плазма<<ткани≫ от 87,29‰ (плазма-почка) до 188,72‰ (плазма-сердце), что сопровождается изменением адаптационных возможностей организма. Подобное применение пищевых веществ с модифицированным изотопным составом, направленным на уменьшение содержания тяжелых нерадиоактивных атомов, позволит проводить целенаправленную нутриционную коррекцию прооксидантно-антиоксидантного статуса у населения в регионах с неблагоприятной экологической обстановкой, стимулируя работу цитопротективных механизмов за счет создаваемого изотопного D/H градиента, который оказывает влияние на различные компоненты системы неспецифической защиты, включая процессы свободнорадикального окисления. Кроме того, периодическая оценка изотопного состава нутриентов позволит осуществлять мониторинг качества потребляемых населением пищевых продуктов, а при необходимости производить определение географической локации их происхождения.
Ключевые слова:дейтерий, пищевые продукты, вода со сниженным содержанием дейтерия, хемилюминесценция, лиофилизированные ткани, крысы
Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 43-50.
Изучение распространенности изотопов различных химических элементов в биосистемах представляет собой одну из актуальных проблем современной биологии и медицины, что связано со способностью более тяжелых атомов существенно влиять на скорость метаболических процессов в живых организмах, а следовательно, изменять их адаптационные возможности и выживаемость в меняющихся условиях внешней среды [6, 19, 22]. Одним из ключевых механизмов, приводящих к увеличению количества тяжелых изотопов в организме в результате усиления реакций изотопного обмена, является их поступление в составе пищевого рациона, что связано с различной степенью кумуляции тяжелых атомов в пищевых продуктах в зависимости от их химического состава.
Этим объясняется также возможность проведения корригирующих мероприятий по изменению процентного содержания тяжелых изотопов in vivo при введении в пищевой рацион продуктов с модифицированным изотопным составом. Подобные возможности появились в связи с развитием технологий получения пищевых веществ с заданным соотношением легких и тяжелых изотопов [12, 24].
Известно, что самым распространенным тяжелым изотопом в биообъектах является дейтерий (D), количество которого в плазме крови в несколько раз превышает показатели калия, кальция, магния и намного больше содержания многих микроэлементов (фтора, йода, меди, марганца и кобальта). В работе [7] было показано, что в плазме крови человека концентрация D выше, чем в принимаемой им питьевой воде, являющейся основным источником тяжелых изотопов водорода, однако, поскольку последний входит в состав не только воды, но и органических молекул, из которых состоят белки, жиры и углеводы, можно предположить, что колебания содержания D в тканях обусловлены составом пищевого рациона в целом. Вода с модифицированным изотопным составом со сниженным содержанием дейтерия (ВМИС ССД) - изотополог воды 1H216O, образованный легкими стабильными изотопами входящих в его состав элементов, содержание которого в природной воде составляет 99,73-99,76 мол.% (молекулярных процента). Как моноизотопная композиция 1H216O является предельным случаем изотопной чистоты, которой в естественных условиях не существует. Для ее получения ведут тонкую многостадийную очистку природных вод или синтезируют из исходных элементов 1H2 и 16O. В то же время природная вода представляет собой многокомпонентную смесь изотопологов, где на 106 молекул воды в среднем содержится 311 молекул 1HD16O. Весовые количества изотопологов в природной воде рассчитаны на основании данных прямого определения их содержания методом молекулярной спектроскопии [20].
Концентрация молекул воды, содержащих тяжелые изотопы водорода, в природной воде колеблется в пределах, зафиксированных в основном международном стандарте изотопного состава гидросферы - SMOW, который определен по изотопному составу глубинной воды Мирового океана, и содержание дейтерия у него в соответствии с показателями стандартного дельта-обозначения (δD, в промилле) составляет 0,0‰. При этом положительная величина отклонения характеризует обогащение анализируемого образца тяжелыми изотопами (D) по отношению к стандарту, а отрицательная указывает на обогащение анализируемого образца легкими изотопами (протий, Н).
Все возрастающий интерес медико-биологической научной общественности к соотношению изотопов водорода объясняется рядом биологических эффектов, которые наблюдаются при изменении соотношения D и Н в организме. ВМИС ССД может изменять скорость деления различных клеточных культур [10, 13, 16, 23], в том числе регулируя апоптоз. Согласно данным литературы, такие воздействия сопровождаются повышением адаптивных возможностей и структурными перестройками иммунных органов (тимуса и селезенки) у экспериментальных животных [5, 14], в том числе было показано, что ВМИС ССД обладает радиопротекторными свойствами [9]. В ряде работ продемонстрировано ее влияние на состояние прооксидантно-антиоксидантной системы крови в физиологических условиях и при моделировании патологических процессов [2, 18]. Однако, несмотря на столь широкое внимание ученых разных стран к уникальным свойствам ВМИС ССД, до сих пор нет единого мнения о механизмах ее влияния на биологические объекты.
Принимая во внимание все вышеизложенное, целью исследования являлось изучение изотопного состава некоторых пищевых продуктов, а также оценка влияния ВМИС ССД на показатели свободнорадикального окисления (СРО) и концентрацию тяжелых атомов водорода в плазме крови и тканях печени, почки и сердца в эксперименте на лабораторных животных.
Материал и методы
Объектом исследования были пищевые продукты, а также кровь и лиофилизированные внутренние органы (печень, почки, сердце) 20 крыссамцов линии Вистар в возрасте 5-6 мес (масса тела 235±16 г, колебание массы тела по группе ±12 г). Исследуемые пищевые продукты и воду приобретали в оптово-розничной сети г. Краснодара. Для определения изотопного состава продуктов питания и лиофилизированных органов брали органический образец массой от 0,5 до 3 мг, что связано с различной плотностью образцов, который далее высушивали сублимацией в соответствии с методом [15], после чего отбирали 50±10 мкг вещества для анализа и проводили изучение его изотопного состава с использованием масс-спектрометра "DELTAplus", снабженного периферийным устройством для пробоподготовки к изотопному анализу водорода "H/Device" ("Finnigan", Германия) по методике [25] в собственной модификации [12].
ВМИС ССД получали на установке, разработанной в Кубанском государственном университете, исходный показатель δD в получаемой воде составлял (-743,2‰), минерализацию полученной воды производили путем добавления минеральных солей для получения физиологически полноценного минерального состава питьевой воды (минерализация 314-382 мг/л: гидрокарбонаты 144-180 мг, сульфаты менее 1 мг, хлориды 60-76 мг, кальций 6 мг, магний 3 мг, натрий 50-58 мг, калий 50-58 мг). Минеральный состав ВМИС ССД (δD=-743,2‰) и воды (δD=-37,0‰) был идентичен.
Определение концентрации дейтерия в воде и плазме крови было проведено с помощью спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР) "JEOL JNM-ECA" 400MHz ("Jeol", Япония), по методике [1] на базе Центра коллективного пользования "Диагностика структуры и свойств наноматериалов" ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный университет" (г. Краснодар), при финансовой поддержке гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых МК-1568.2014.4.
Изучение влияния ВМИС ССД на изотопный состав плазмы крови и тканей, а также оценку интенсивности СРО проводили на крысах, которые были разделены на 2 группы: животные 1-й группы (опытная группа, n=10) в течение 2 нед получали виварный рацион и ВМИС ССД (-743,2‰), 2-й группы (интактная группа, n=10) - виварный рацион и минерализованную питьевую воду (-37,0‰). Все животные содержались в виварии при сходных условиях в отношении температуры, влажности, освещения.
Для оценки интенсивности СРО в плазме крови был использован метод люминол-зависимой H2O2-индуцированной хемилюминесценции, максимум вспышки хемилюминесценции (МВХЛ) измеряли на хемилюминотестере ЛТ-01 ("Horos", Joint Venture Soviet-Swedish Company, РФ) по методике [4], результаты выражали в виде МВХЛ в условных единицах (усл. ед.). Измерение уровня свободных радикалов в гомогенатах тканей (печени, почки и сердца) проводили с помощью электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на спектрометре "JES Fa 300" ("JEOL", Япония) в X-диапазоне (СВЧ мощность 1 мВт, частота микроволнового излучения 9144 МГц, амплитуда высокочастотной модуляции 0,1 мТл), образцы тканей предварительно подвергали лиофилизации (в лиофильной сушилке "ЛС-1000" ("Проинтех", РФ), концентрацию парамагнитных центров (ПМЦ) в пересчете на 1 г образца (ПМЦ/г) определяли путем сравнения с сигналом стандартного образца (TEMPOL) по методу [12]. Исследование проводили в рамках задания Министерства образования и науки РФ (проект № 1269).
Статистическую обработку полученных данных осуществляли методами вариационной статистики с использованием свободного программного обеспечения - системы статистического анализа R (R Development Core Team, 2008). Оценку достоверности найденных отличий средних величин (M) между группами проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни (для независимых групп, достоверным считали различие при р<0,05).
Результаты и обсуждение
Содержание D в воде, поступающей в водопроводную сеть г. Краснодара, составило -35,7‰, т.е. было несколько ниже международного стандарта изотопного состава гидросферы SMOW, что позволяет говорить об отсутствии антропогенного загрязнения ее тяжелыми изотопами водорода и невозможности избыточного поступления дейтерия в организм при употреблении такой воды населением.
При анализе данных о содержания D в пищевых продуктах (табл. 1) выявлено его существенное отличие от содержания в водопроводной воде, особенно в свином и говяжьем жире, сливочном масле, концентрация D в которых была меньше на 22,3, 19,1 и 16,5% соответственно (p<0,05). Менее значимые различия отмечены при изучении мясных продуктов: с концентрацией D на 7,9-8,6% ниже, чем у воды в этом регионе. В свою очередь данные по содержанию D в овощах и зерне были меньше показателей водопроводной воды лишь на 5,1-5,8%. При оценке содержания D в дистиллированной и бидистиллированной воде, полученных из водопроводной воды, не было найдено статистически значимых отличий в сравнении с уровнем D в последней (табл. 2), тогда как в некоторой бутилированной воде содержание D значимо отличалось. При этом в ряде проб выявлено превышение стандарта SMOW на 0,8-7,2%, что может приводить к избыточному поступлению D в организм при употреблении такой воды населением.
)
В то же время среди бутилированных образцов воды отмечено и заметно меньшее содержание D в сравнении со стандартом SMOW (см. табл. 2): наиболее значимо отличалась вода "Нарзан", показатели D в которой были ниже значения SMOW на 7,6%, а в сравнении с водопроводной водой на 4,1%, что говорит о целесообразности ее применения в пищевом рационе с целью снижения содержания тяжелых изотопов водорода в организме. Актуальность этого вопроса обусловлена тем, что одной из важных задач Концепции здорового питания населения Российской Федерации является формирование региональных программ здорового питания [11], в том числе учитывающих распределение тяжелых изотопов в пищевых продуктах, особенно в регионах с неблагополучной экологической обстановкой, что позволило бы уменьшить воздействие неблагоприятных факторов на организм человека.
Кроме того, полученные результаты позволяют проводить не только сравнительную оценку изотопной нагрузки по D/H у населения при формировании пищевого рациона, но и учитывать перемещение людей в различных регионах, что возможно использовать в судебно-медицинских исследованиях. Так, в исследовании, проведенном в 2 регионах США - East Greenbush (New York) и Fairbanks (Alaska), - было показано, что содержание D в волосяном покрове и моче коррелирует с его содержанием в пищевом рационе [17]. Причем при перемещении человека между регионами концентрация D в моче изменяется в соответствии с его концентрацией в пищевом рационе. Авторы предлагали использовать подобные исследования для учета географических перемещений человека.
Аналогичные подходы применимы и в биологии для учета географической локации и миграции различных представителей фауны.
Изучение влияния ВМИС ССД на изотопный состав плазмы крови и тканей в эксперименте in vivo показало, что при ее использовании происходит выраженное в различной степени снижение концентрации D во всех органах. В опытной группе наиболее существенное изменение уровня D характерно для почки, который через 2 нед эксперимента был на 10,8% ниже содержания D в печени и на 14,2% меньше показателей D в сердце (табл. 3). Еще более значительное понижение концентрации D наблюдалось в плазме крови, что сопровождалось сменой направленности изотопного D/H градиента ("плазма>>ткани" на "плазма<<ткани"). Описанные изменения обусловлены низкой скоростью обмена дейтерия на протий в тканях: в углерод-водородных связях (R3C-D) в составе органических субстратов, не имеющих атомов с неподеленной электронной парой, т.е. неспособных образовывать в отличие от гидроксильных (-О-Н), сульфгидрильных (-S-H), первичных (-NH2) и вторичных (=N-H) аминогрупп комплексы с водородными связями, которые могут быстро обмениваться атомами D при поступлении с водой преимущественно протия в составе пищевого рациона.
Наблюдающиеся изменения изотопного состава тканей вызывают неспецифические изменения в метаболической и функциональной активности защитных систем, связанные, по-видимому, с субстрессовым воздействием изотопного D/H градиента, в том числе на отдельные звенья иммунной и прооксидантно-антиоксидантной систем. Так, при формировании изотопного градиента на 14-е сутки эксперимента у крыс 1-й опытной группы наблюдалось повышение уровня хемилюминесценции в плазме крови на 4,3% при сравнении с показателями у интактных животных 2-й контрольной группы [МВХЛ(1)=2,109±0,089 усл.ед., МВХЛ(2)=2,021±0,057 усл.ед., p=0,049] и увеличение СРО в лиофилизированной почке на 6,5%, что отражало повышение количества ПМЦ в пересчете на 1 г ткани при сравнении с показателями интактной группы [ЭПРпочки (1)=833,91±16,95 ПМЦ/г, ЭПРпочки (2)= 782,56±34,92 ПМЦ/г, p=0,028], тогда как в лиофилизированных печени и сердце отмечена тенденция к повышению уровня ПМЦ, но достоверных изменений в сравнении с показателями интактной группы не выявлено [ЭПРпечени (1)= 1683,07±37,26 ПМЦ/г, ЭПРпечени (2)=1603,71± 94,20 ПМЦ/г, p=0,070; ЭПРсердца (1)=4316,38± 189,63 ПМЦ/г, ЭПРсердца (2)=3850,62±138,92 ПМЦ/г, p=0,096].
Это может подтверждать рассуждения некоторых авторов о механизмах активации иммунной системы организма посредством воздействия ВМИС ССД на кинетику реакции генерации Н2О2 изолированными митохондриями [8], при этом ими установлено, что снижение концентрации D относительно природного уровня приводит к достоверному ускорению исследованной реакции.
В других исследованиях показано, что различные метаболические процессы приводят к фракционированию изотопов водорода и углерода в разной степени [21], а следовательно, изменяют термодинамические характеристики макромолекул и кинетику ферментативных процессов.
В целом полученные результаты указывают на возможность нутриционной коррекции изотопного обмена в плазме крови и тканях с помощью продуктов с модифицированным изотопным составом, а также перспективность использования диетотерапии с повышенным показателем соотношения легких изотопов к тяжелым изотопам при дисбалансе в работе прооксидантно-антиоксидантной и других защитных систем организма [3, 10].
Заключение
На основании выполненных исследований необходимо отметить, что концентрация D в пищевых продуктах существенно различается. Наибольшие уровни D отмечены у некоторых образцов бутилированной воды ("Кубай", Miniliya), которые на 5,9-11,2% превышали показатели D в водопроводной воде, потребляемой населением в регионе, в то время как наименьшие показатели содержания D установлены для воды марки "Нарзан" (-75,5‰), что позволяет использовать последнюю для коррекции изотопного состава пищевого рациона у населения в экологически неблагоприятных по содержанию тяжелых атомов водорода областях.
Среди других пищевых продуктов наиболее низкое содержание D отмечено в свином и говяжьем жире, сливочном масле, что объясняется преобладанием углерод-водородных связей в их составе, неспособных обмениваться в реакциях изотопного обмена D и протием.
Применение ВМИС ССД (особенно с показателями δD≤-743,2‰) позволяет в течение достаточно короткого времени проводить изменение направленности изотопного градиента по содержанию D в плазме крови и органах, что сопровождается умеренной стимуляцией процессов СРО в почках и повышением МВХЛ в плазме, отражающего активацию функционирования прооксидантной системы организма. Поэтому можно использовать ВМИС ССД с профилактической целью для повышения адаптационных возможностей организма при отсутствии развития острых патологических состояний в период проведения указанных превентивных мероприятий, что в дальнейшем ведет к регулируемому изменению ряда показателей гуморальных и клеточных систем неспецифической защиты.
Кроме того, изучение изотопного состава пищевого рациона и биологических жидкостей можно применять для учета географических перемещений человека и оценки миграционных потоков в биологии.
Литература
1. Барышев М.Г., Болотин С.Н., Фролов В.Ю. и др. Способы получения воды с пониженным содержанием дейтерия // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. - 2013. - № 1. - С. 13-17.
2. Басов А.А., Барышев М.Г., Джимак С.С. и др. Влияние воды с модифицированным изотопным составом на показатели свободнорадикального окисления in vivo // Фізіол. журн. - 2013. - Т. 59, № 6. - С. 50-57.
3. Басов А.А., Быков И.М. Сравнительная характеристика антиоксидантного потенциала и энергетической ценности некоторых пищевых продуктов // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 3.- С. 77-80.
4. Басов А.А., Павлюченко И.И., Плаксин А.М., Федосов С.Р. Использование аналогово-цифрового преобразователя в составе системы сбора и обработки информации с хемилюминитестером LT-01 // Вестн. новых медицинских технологий. - 2003. - Т. 10, № 4. - С. 67-68.
5. Григоренко Д.Е., Сапин М.Р., Федоренко Б.С. Влияние бездейтериевой легкой воды на состояние лимфоидной ткани селезенки у мышей в постлучевой период // Вестн. новых медицинских технологий. - 2010. - Т. ХVII, № 1. - С. 9-11.
6. Киркина А.А., Лобышев В.И., Лопина О.Д. и др. Изотопные эффекты малых концентраций дейтерия воды в биологических системах // Биофизика. - 2014. - Т. 59, вып. 2. - С. 399-407.
7. Лобышев В.Н., Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D2О в биологических системах. - М.: Наука, 1978.
8. Помыткин И.А., Колесова О.Е. Влияние естественной концентрации тяжелых изотопологов воды на скорость генерации Н2О2 митохондриями // Бюл. экспер. биол. - 2006. - № 11. - С. 514-516.
9. Раков Д.В., Ерофеева Л.М., Григоренко Д.Е. и др. Влияние воды с пониженным содержанием тяжелого стабильного изотопа водорода дейтерия и кислорода (18О) на развитие лучевых повреждений при гамма-облучении в низкой дозе //Радиационная биология. Радиоэкология. - 2006. - Т. 46, № 4. -С. 475-479.
10. Сапин М.Р. Григоренко Д.Е., Федоренко Б.С. Отдаленные последствия воздействия воды, очищенной от дейтерия, на лимфоидную ткань селезенки мышей в пострадиационный период // Вестн. лимфологии. - 2010. - № 3. - С. 40-45.
11. Тутельян В.А., Суханов Б.П., Керимова М.Г. Предпосылки и факторы формирования региональной политики в области здорового питания в России // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 6. - С. 39-43.
12. Baryshev M.G., Basov A.A., Bolotin S.N. et al. NMR, EPR, and mass spectroscopy estimates of the antiradical activity of water with modified isotope composition // Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. - 2012. - Vol. 76, N 12. - P. 1349-1352.
13. Bild W., Nastasa V., Haulica I. In vivo and in vitro research on the biological effects of deuterium-depleted water: 1. Influence of deuterium-depleted water on cultured cell growth // Rom. J. Physiol. - 2004. Vol. 41, N 1-2. - P. 53-67.
14. Bild W., Stefanesku I., Haulica I. Research concerning the radioprotective and immunostimulating effects of deuterium-depleted water // Rom. J. Physiol. - 1999. - Vol. 36, N 3-4. - P. 205-218.
15. Bowen G.J., Chesson L., Nielson K. et al. Treatment methods for the determination of δ2H and δ18O of hair keratin by continuousflow isotope-ratio mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2005. - Vol. 19. - P. 2371-2378.
16. Cong F., Zhang Y.-R., Sheng H.-C. et al. Deuterium-depleted water inhibits human lung carcinoma cell growth by apoptosis // Exp. Ther. Med. - 2010. - N 1. - P. 277-283.
17. O’Brien D.M., Wooler M.J. Tracking human travel using stable oxygen and hydrogen isotope analyses of hair and urine // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2007. - Vol. 21. - P. 2422-2430.
18. Olariu L., Petcu M., Cuna S. The role of deuterium depleted water (DDW) administration in blood deuterium concentration in Cr (VI) intoxicated rats // Lucrari stiinlifice medicina veterinara. - 2010. - Vol. 43, N 2. - P. 193-196.
19. Pricope F., Titescu S.G., Caraus I., Ureche D. Effect of deuteriumdepleted water on reproduction of rainbow trout // Environ. Chem. Lett. - 2003. - Vol. 1. - P. 149-151.
20. Rothman L.S., Barbe A., Benner D.C. et al. The HITRAN Molecular Spectroscopic Database: Edition of 2000 including update through 2001 // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer. - 2003. - Vol. 82, N 1-4. - P. 5-44.
21. Smith B.N., Epstein S. Biogeochemistry of the stable isotopes of hydrogen and carbon in salt marsh // Plant Physiol. - 1970. - Vol. 46, N 5. - P. 738-742.
22. Soleyman-Jahi S., Zendehdel K., Akbarzadeh K. et al. In vitro assessment of antineoplastic effects of deuterium depleted water // Asian Pac. J. Cancer Prev. - 2014 - Vol. 15, Issue 5. - P. 2179-2183.
23. Wang H., Zhu B., He Z. et al. Deuterium-depleted water (DDW) inhibits the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro // Biomed. Pharmacother. - 2013. - Vol. 67. - P. 489-496.
24. Yeh H.-M. Recovery of deuterium from water-isotopes in thermal diffusion columns connected in series // Prog. Nuclear Energy. - 2010. - Vol. 52. - P. 516-522.
25. Zimermann U., Cegla U. Der Deuterium-und Sauerstoff-18-Gehalt der Korperflussigkeit des Menschen und seine Anderung bei Ortswechsel // Natur. wissenschaften. - 1973. - Vol. 60, Issue 5. - P. 243-246.