История применения человеком молока одомашненных животных начинается в период позднего неолита, когда люди постепенно перешли от охоты на диких животных и собирательства плодов и кореньев к оседлому образу жизни. Используя новые навыки, человек научился воспроизводить животных и растения для производства продуктов питания. Одним из главных достижений неолитической "сельскохозяйственной революции" было приручение жвачных молочных животных - коз и коров. Это, по сути, обеспечило постоянный доступ человека к мясу, шерсти, шкуре и, конечно, молоку. Первые попытки приручения диких коз были предприняты 8-10 тыс. лет назад в зоне так называемого плодородного полумесяца [4, 28]. Таким образом, без преувеличения можно говорить о том, что уже несколько тысяч лет подряд молоко домашних коз (Capra aegagrus hircus) и других сельскохозяйственных животных - желанный и ценнейший пищевой ресурс человечества.
Производство и потребление козьего молока в мире
Исторически сложилось, что козы вплоть до относительно недавнего времени выращивались преимущественно на частных подворьях или в мелких фермерских хозяйствах. За исключением отдельных стран, коммерческая продажа жидкого козьего молока была практически неизвестна до Второй мировой войны. После Второй мировой войны козье молоко прежде всего использовали в качестве заменителя коровьего молока для лиц, страдающих аллергией и различными гастроинтестинальными расстройствами. Причиной нового всплеска интереса к козьему молоку, особенно в странах Западной Европы, США и странах Океании с 1960 по 1970 г., был общемировой тренд "Назад к природе" [45, 50, 80]. В научной литературе рост производства и потребления козьего молока объясняют 4 основными факторами:
1) приростом общей численности населения Земли и, соответственно, увеличившейся потребностью в пище и использовании сельскохозяйственного сырья;
2) повышенным спросом на продукты для здорового питания (англ. health foods), такие, как козий йогурт, козий сыр и др.;
3) альтернативой для людей, страдающих пищевой аллергией и (или) гастроинтестинальными расстройствами;
4) наличием ряда интересных характеристик фракционного состава и физико-химических особенностей [1-3, 14, 50, 76].
В соответствии с данными Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (Food and Agriculture Organization of the United Nations - FAO), в настоящее время в мире производится примерно 700 млн тонн молока в год, из них около 80% приходится на коровье, 10% - на буйволиное, 2,5% - на козье, 1,5% - на овечье и 1% - на верблюжье молоко [40]. На рис. 1 представлены крупнейшие мировые производители козьего молока. Как видно из рисунка, мировыми лидерами по производству козьего молока являются Индия (26,3%) и Бангладеш (14,3%). Доли лидеров европейских стран, таких, как Франция и Испания, составляют примерно по 4%, а Греции - 3,3% от всего рынка козьего молока [10, 14]. Подсчитано, что производство козьего молока в мире за последние 20 лет выросло более чем на 50%, примерно с 10 млн тонн в 1990 г. до 15,2 млн тонн в 2008 г. [8].
&hide_Cookie=yes)
В рамках мировой тенденции развития производства и потребления козьего молока и продуктов на его основе отдельно стоит выделить возросший интерес к продуктам из козьего молока, предназначенным для новорожденных детей, - заменителям женского грудного молока, или так называемым сухим молочным смесям. По нашей оценке, адаптированные молочные смеси на козьем молоке на данный момент занимают примерно 8% всего российского рынка детских смесей, из которых на долю адаптированных смесей на основе цельного козьего молока приходится примерно 7%.
Такое прогрессирующее распространение в диетическом питании козьего молока и продуктов на его основе способствует актуализации проблемы оценки качества козьего молока, в том числе в сравнении с коровьим молоком. Молоко различных млекопитающих, в том числе козы, содержит гетерогенную популяцию клеток, которые, как правило, называют соматическими клетками (СК Соматические клетки - теоретически различные клетки организма млекопитающих (включая человека), за исключением половых или бактериальных клеток.).
Для оценки качества молока широко используется именно показатель числа СК [79]. Этот удобный к применению на практике показатель молока считается чувствительным маркером состояния здоровья вымени у коров или коз [80-81]. Оценка же пищевой и биологической ценности молока базируется в большей степени на подробной характеристике основных составляющих - жиров, белков и углеводов, а также витаминов и минеральных веществ [5]. В настоящее время появляются данные о наличии корреляции между показателем СК и биологической ценностью молока [20].
Анализ доступных данных литературы по клеточному составу, определяющему гигиеническую оценку и качество молока, а также по характеристике молочного жира, определяющего энергетическую и пищевую ценность козьего молока, и стал основной темой настоящего обзора литературы.
Соматические клетки в козьем молоке
В настоящее время возникает очевидная необходимость разработки дополнительной нормативно-правовой базы для обеспечения полноценного включения козьего молока в промышленную переработку. Причиной этого является несоответствие состава козьего молока-сырья общепринятым стандартам, ранее разработанным для свежего коровьего молока-сырья. Одними из актуальнейших моментов разрабатываемой гигиенической оценки стали вопросы количества СК в козьем молоке-сырье.
Учитывая тот факт, что существенным отличием козьего молока-сырья от коровьего является повышенное содержание СК, в Российской Федерации специально для козьего молока были разработаны технические условия (ТУ 9837-001-00495220-98 "Молоко козье. Требования при закупках"). В соответствии с техническими условиями козье молокосырье подразделяют на три сорта: высший, первый и второй. Содержание СК в молоке высшего и первого сортов не должно превышать 1 000 000 в 1 см3, в молоке второго сорта - 1 500 000 в 1 см3.
Для сравнения: в США разрешенный лимит по СК для коровьего молока, установленный Food and Drug Administration (FDA), составляет 750 000 в 1 см3, а для козьего и овечьего молока - 1 000 000 в 1 см3. В Европейском союзе, согласно директиве от 1992 г. (Directive 92/46ECC Council, 1992), разрешенный предел содержания СК для коровьего молока составляет 400 000 в 1 см3 и нет ограничений по СК на козье или овечье молоко-сырье [73]. Известно, что у большинства видов млекопитающих преобладающими клетками в молоке являются лейкоциты: лимфоциты, полиморфноядерные нейтрофилы и макрофаги, которые служат важными компонентами защиты молочной железы от бактерий. Одновременно молоко также содержит эпителиальные клетки, апоптические, поврежденные макрофагами и неповрежденные клетки эпителия, не связанные с процессом воспаления.
В отличие от коровьего молока, где макрофаги (<60%) являются преобладающим типом СК [15, 69, 71], в молоке коз преобладают полиморфноядерные нейтрофилы (45-75%) [34]. По данным М. Боутинарда и соавт. (Boutinard М., 2002), в молоке коров с неинфицированным выменем в состав СК входит незначительное количество эпителиальных клеток [15]. В то же время указывается, что от 10 до 20% СК в козьем молоке являются эпителиальными клетками. Для сравнения: СК женского грудного молока могут содержать от 50 до 90% эпителиальных клеток (foam-клетки и эпителиальные клетки) [15]. Некоторыми исследователями высказано предположение, что наличие эпителиальных клеток в молоке может обусловливаться элиминацией мертвых (отторгшихся) клеток апикальной части секреторного эпителия молочной железы. Однако методом витальной окраски (trypan blue) с подсчетом количества живых клеток установлено, что в грудном молоке может содержаться до 90%, а в козьем - до 40% от общего числа СК живых (непрокрашенных) эпителиальных клеток [15, 43, 92].
Для более детального изучения вопроса, касающегося СК в молоке, мы рекомендуем статью М. Бутинауда и соавт. (Boutinaud M., 2002), где в сравнительном аспекте приведены данные об общем количестве СК, а также подробно описаны типы СК в молоке разных видов сельскохозяйственных животных и человека в разные периоды лактации [15].
Цитоплазматические включения козьего молока
Другой отличительный признак козьего молока от коровьего - цитоплазматические включения (ЦПВ)*, которые попадают в молоко в результате слущивания апикальной части секреторных клеток молочной железы/вымени. Для характеристики таких клеточных фрагментов в англоязычной литературе введен специальный термин "сhristiesomes" [103]. Показано, что козье молоко содержит многочисленные сhristiesomes с хорошо сохранившимся эндоплазматическим ретикулумом, митохондриями и жировыми глобулами. Большинство ЦПВ не содержат ядер, и только примерно 1% может иметь различные ядерные фрагменты [33]. Число ЦПВ в молоке здоровых коз варьирует от 71 до 306×103 в 1 см3 [15, 34]. Количество ЦПВ в молоке коз варьирует в зависимости от породы коз, периода лактации, окружающей среды, климата или других условий [36, 49].
В коровьем молоке содержатся более плотные ЦПВ с небольшим количеством мелких везикул или многочисленными микроворсинкоподобными структурами с выступами на одном из полюсов. Такие включения состоят из фрагментов эндоплазматического ретикулума, жировых глобул, пузырьков Гольджи и мицелл казеина [16]. Для таких структур в англоязычной литературе можно встретить специальный термин "sunbursts" [103]. Здесь нужно отметить, что существуют работы, в которых исследователи указывают на отсутствие ЦПВ в молоке [15]. Интересно отметить, что ЦПВ женского грудного молока ближе к таковым козьего как по количеству, так и по составу.
Апокриновый и мерокриновый типы секреции молока. Принимая во внимание указанное выше различие по количеству и качеству СК и ЦПВ в молоке козы и коровы, ряд исследователей в 1970-х гг. предположили, что тип секреции молока у этих животных может отличаться, в частности для козы характерен апокриновый тип секреции [101], а для коровы - мерокриновый [103]. Для большего понимания и наглядности этих процессов на рис. 2 в схематичном виде представлены апокриновый и мерокриновый типы секреции.
&hide_Cookie=yes)
Одна из наиболее часто цитируемых работ по этой теме - работа, опубликованная учеными из института ARC Institute of Animal Physiology (Англия) в журнале "Nature" в 1970 г. [101]. В этой работе Вудинг и соавт. (Wooding F.B., 1970) построили свою гипотезу в пользу определенного типа секреции молока у испытуемых животных (в том числе коз) на основании анализа ЦПВ в молоке.
К сожалению, авторы более поздних работ не приводят убедительных научных данных, подтверждающих или опровергающих ключевые выводы, сделанные Вудингом в 1970-х гг. [1, 3, 37, 72].
Это может быть объяснено сложностями, с которыми сталкиваются исследователи, изучая механизм секреции молока. Существуют методические трудности как в селективном выделении апикальной части мембран секреторных клеток при их исследовании, так и в выборе методов и методик исследований или типов лабораторного оборудования для изучения механизма(ов) секреции. Кроме того, научный интерес к козьему молоку появился позднее, вследствие чего по ряду позиций образовался информационный вакуум, который не устранен и по сию пору. Что касается изучения механизма(ов) секреции молока у человека, то здесь на первый план выступают трудности этического характера и ограничения для получения здоровой ткани молочной железы. В дополнение к этому в большинстве опубликованных работ грудное молоко для анализов получили из банка грудного молока, что, по сути, означает нестандартный забор образцов.
Такое молоко может собираться в разное время суток, до или после приема пищи, на разных стадиях лактации и т.д. Все это должно существенно влиять на чистоту проводимых экспериментов.
Также большое влияние на качество образцов грудного молока может оказывать такой важный параметр, как условия хранения молока, которые сопряжены с количеством циклов замораживанияоттаивания, временными сроками хранения или пастеризацией молока [11].
Значимой доказательной базой механизма(ов) секреции молока могли бы стать данные о молекулярном регулировании секреции молока в организме животных и человека. Особенно важны разработка и использование неинвазивных методов анализа экспрессии генов в эпителиальных клетках молочной железы.
Применение таких современных методов, как молекулярное клонирование, методы анализа со специфическими антителами, анализ аминокислотных последовательностей белков, массспектрометрия или исследования в области количественного анализа экспрессии белков в клетках (протеомика), в рамках изучения механизмов секреции отдельных нутриентов молока также позволило бы лучше понимать эти процессы.
Молоко представляет собой водную суспензию различных веществ (полидисперсную систему), прежде всего белков, жиров, углеводов, витаминов и минеральных веществ, которые сначала синтезируются de novo в секреторных клетках и (или) поступают из кровотока (например, ряд жирных кислот) и только потом попадают в просвет секреторного отдела молочных желез (рис. 3). Синтезируемые de novo или приходящие из кровотока вещества, смешиваясь во внеклеточном пространстве между собой, формируют молоко. Известно, что различные компоненты молока могут поступать в просвет секреторного отдела молочных желез по-разному.
&hide_Cookie=yes)
Жиры и белки экскретируются по типу экзоцитоза [19, 22, 61], лактоза и ряд других низкомолекулярных веществ - при помощи диффузии или активного транспорта [62].
Д. Шеннан и соавт. (Shennan D.B., 2000) указали на 4 типа секреции, которые характерны для эпителиальных клеток молочных желез: трансмембранная секреция в апикальной и (или) базолатеральной мембране клеток (вода и ионы), трансцитоз (иммуноглобулины, гормоны или альбумин), экзоцитоз (теоретически все растворенные в водной фазе клеток вещества) и, отдельно, секреция липидов [87]. Пятый тип секреции - так называемый парацеллюлярный (параклеточный) транспорт через "запирающие" межклеточные контакты, при котором возможен перенос в том числе и макромолекул, - наблюдается в основном в период беременности или при воспалении груди/вымени (маститах) [87].
Экзоцитоз - хорошо регулируемый процесс, при котором большинство секретирующих клеток способны выделять различные вещества ответ на специфические сигналы. Также известен и конститутивный экзоцитоз, представляющий собой непрерывное выделение различных веществ из клеток с определенной скоростью.
В экспериментах Р. Бургон (Burgoyne R.D., 1998) показал, что белки молока обычно секретируются по обоим типам экзоцитоза [19].
Такой вид секреции, как трансцитоз, скорее характерен для некоторых видов белковых макромолекул, в частности для иммуноглобулина А, который переносится через эпителиальный барьер в просвет секреторного отдела молочных желез именно по этому механизму.
Таким образом, использование термина "секреция" (применительно к молоку в целом) следует считать не совсем корректным. Одновременное наличие различных видов переноса веществ позволяет выделять преимущественный тип секреции и дает возможность говорить о конкретном механизме cекреции отдельных веществ, которые входят в состав молока.
Жировые глобулы молока
Как известно, энергетическая ценность молока как сельскохозяйственных животных, так и человека зависит в основном от жировой составляющей молока. Молочный жир является одним из наиболее важных нутриентов для новорожденных детей, поскольку содержит приблизительно 55% общей энергии молока [64]. Также известно, что жир в молоке некоторых видов морских млекопитающих, таких, как кит, дельфин и морской котик, может занимать более 60% от общего объема молока [61]. По данным литературы, для сельскохозяйственных животных наивысшая энергетическая ценность определена как 5932 кДж/кг для овечьего молока [75], средняя - 3169-3730 кДж/кг для коровьего молока [9] и 3018 кДж/кг для козьего молока [75].
Из доступных данных можно сделать вывод, что ослиное молоко с энергетической ценностью от 1842 до 2051 кДж/кг является одним из самых низкокалорийных среди всех сельскохозяйственных молочных животных [48]. Для сравнения: человеческое молоко имеет энергетическую ценность, по разным оценкам, от 2407 до 2843 кДж/кг на 1 л [25, 85].
Современная концепция синтеза жира молока начала зарождаться в 1950-х гг. с подробного описания физиологии лактации у коз. Работа под редакцией Поджака и соавт. (Popjak G., 1951) считается одной из первых, в которой изучен липогенез de novo (т.е. синтез короткоцепочечных жирных кислот) с включением меченного [14C]-ацетата [72].
Как известно, липидная фракция молока весьма неоднородна. Большая часть всех липидов козьего молока - это триглицериды (TГ), которые в основном представлены в виде жировых глобул молока (ЖГМ) (Голландский исследователь Антони ван Левенгук был первым, кто наблюдал жировые глобулы молока под микроскопом в 1674 г. [58].). В молоке выделяют следующие фракции свободных липидов: 96,8% - триглицериды, 2,2% - диацилглицерины и 0,9% - моноацилглицерины. Связанные липиды состоят в основном из двух фракций: 46,8% - нейтральные липиды и 53,2% - полярные липиды [23, 74, 99]. В молоке жвачных животных определяют до 400 различных жирных кислот, причем многие из них определяются в следовых количествах [41, 53].
Установлено, что ТГЦ синтезируются на наружной поверхности мембран гладкой эндоплазматической сети (ГЭС) секреторных клеток молочных желез (СКМЖ) из веществ-предшественников, в основном из жирных кислот и глицерина. Синтезируемые на ГЭС жировые микроглобулы ( В научной литературе жировыми микроглобулами молока считаются частицы жира размером <0,5 мкм [14].) до момента попадания в цитоплазму СКМЖ могут сливаться между собой, образовывая глобулы более крупных размеров. В англоязычной литературе такой процесс называется droplet-droplet fusion [29, 31]. Размер таких глобул в секреторной клетке может варьировать от 0,2 до 8 мкм [61, 70].
В англоязычной литературе такие частицы известны под названием сytoplasmic lipid droplets, или CLD [54, 61, 96]. Высвобождаясь с поверхности ГЭС, жировые глобулы устремляются к апикальному полюсу, обращенному к внешней среде СКМЖ. Механизмы, с помощью которых ЖГМ продвигаются к апикальной части мембраны, встраиваются и затем высвобождаются из апикальной части мембраны СКМЖ, недостаточно изучены. Однако не исключено участие в этом процессе микротрубочек и других элементов цитоскелета [67]. Установлено, что ЖГМ способны высвобождаться из апикальной части СКМЖ на любом участке, включая вершины микроворсинок.
В экспериментах in vitro Т. Кинан (Keenan T.W., 1974) показал, что ЖГМ могут сливаться друг с другом в присутствии кальция, ганглиозидов и белковых компонентов [55].
Было показано, что после инфузии колхицина внутрь вымени козы отмечалось существенное снижение секреции составных компонентов молока [51]. Полагают, что секреция ЖГМ может контролироваться либо через взаимодействие белка бутирофилина на плазматической мембране СКМЖ с одноименным белком, входящим в состав мембраны ЖГМ [83], либо посредством связывания бутирофилина ЖГМ с бутирофилинксантиноксидоредуктазным комплексом в апикальной части СКМЖ [52]. В эксперименте на мышах выявлена важная роль гена, кодирующего фермент, участвующий в синтезе липидов [89].
Например, инактивация гена, кодирующего диацилглицеринацилтрансферазу, которая катализирует ацил-КоА-зависимые реакции этерификации в биосинтезе ТГ, приводит к прекращению процесса лактации у мышей. Кроме того, предполагается, что одиночный нуклеотидный полиморфизм гена альфа-S1-казеина козы CSN1S1 и его "нулевые" аллельные варианты проявляются в переформатировании всей внутриклеточной секреции и транспорта ЖГМ [21], а также биосинтеза определенных олигосахаридов [65] или жирных кислот [24, 86]. Выявлено, что гормоны пролактин и окситоцин влияют как на выход ЖГМ из клеток, так и на формирование окончательного размера глобул [70].
Наиболее противоречивые данные описывают конечный этап - попадание ЖГМ в просвет секреторного отдела молочной железы. Ряд исследователей, рассуждая о возможном механизме высвобождения ЖГМ, говорят об апокриновом или мерокриновом типе секреции [103], об апикальном механизме [61], о процессе почкования (англ. budding process) [13], процессе пузырения или отделения (англ. shedding, blebbing) [64] или о процессе отщепления (англ. pinched off) [83].
Таким образом, несмотря на то что общее представление о синтезе и секреции ЖГМ сформировано достаточно давно, все еще мало известно о многих молекулярных механизмах, участвующих в образовании ЖГМ, внутриклеточном транспорте ЖГМ и их механизме(ах) секреции.
На рис. 4 отражена общепринятая точка зрения на механизм(ы) образования, транспорта и секреции ЖГМ. Здесь нужно подчеркнуть, что существует и альтернативная гипотеза, впервые предложенная Вудингом (Wooding F.B., 1971), согласно которой в транспорте ЖГМ участвуют секреторные везикулы цитоплазмы, которые, обволакивая ЖГМ, способны облегченно сливаться с апикальной частью мембраны СКМЖ (см. рис. 4). После слияния с мембраной СКМЖ образовавшиеся вакуоли, содержащие казеиновые мицеллы и ЖГМ, способны высвобождаться наружу по типу псевдоэкзоцитоза [102]. Для детального ознакомления с наиболее цитируемой литературой по данному вопросу мы рекомендуем следующих авторов: Aoki, 1994 [6]; Bargmann, 1959 [12]; Franke, 1981 [42]; Heid, 2005 [52]; Keenan, 1988 [56]; Mather, 1983, 1998 [61-62]; Patton, 1988 [77]; Wooding, 1970, 1971, 1977 [103-105].
&hide_Cookie=yes)
Интересно отметить, что по форме поверхности зрелые ЖГМ представлены двумя типами: (1) равномерно округлой или овальной формы и (2) несимметричной формы, с выпуклым образованием на одном из полюсов. Выпуклое образование на полюсе второго типа ЖГМ в англоязычной литературе имеет специальный термин "сytoplasmic сrescents" (см. рис. 4) [35, 102]. В сytoplasmic сrescents часть цитоплазмы секреторных клеток заключена между листком мембраны ЖГМ и поверхностью глобулы. При этом объем сrescents может варьировать от небольшой полости, заполненной матриксом цитоплазмы, до полости, по объему равной или даже превосходящей объем основного образования ЖГМ. При помощи метода электронной микроскопии в сrescents были обнаружены все основные органеллы и фрагменты мембран СКМЖ. Несмотря на то что сrescents обнаруживаются на ЖГМ разных видов молочных животных и человека, их процентное соотношение к общему количеству ЖГМ может быть разным: менее 1% в коровьем молоке [44], от 1 до 5% в козьем молоке [68] и от 3 до 8% в грудном молоке [44, 77].
Помимо полиморфизма форм ЖГМ существуют выраженные различия в размерах ЖГМ у разных видов молочных животных и человека.
Одни из самых больших ЖГМ выявлены в буйволином молоке, средний диаметр их примерно 9 мкм (8,7 мкм). Коровье молоко по размеру ЖГМ занимает промежуточное положение со средним диаметром 3,95 мкм. Глобулы наименьших размеров выявлены в верблюжьем (2,99 мкм) и козьем (3,19 мкм) молоке [10].
Следует учитывать, что размер ЖГМ даже у одного животного не является однозначной величиной и может варьировать в достаточно широких пределах. Как правило, в молоке можно выделить несколько фракций ЖГМ, значимо отличающихся по размерам. В табл. 1 приведены распределение по размерам фракций (%) и средний диаметр (мкм) жировых глобул коровьего и козьего молока.
&hide_Cookie=yes)
Как видно из таблицы, более 73% от всех ЖГМ в козьем молоке варьируют в диапазоне 0,1-4 мкм, при этом более 25% всех ЖГМ занимают глобулы диаметром 0,1-1 мкм. И наоборот, глобулы размером 0,1-1 мкм в коровьем молоке не обнаруживаются. Для сравнения: ЖГМ у человека имеют в целом бимодальное распределение по размеру с диаметром самых мелких глобул не более 0,4 мкм, а самых больших - 3 мкм. Установлена обратная корреляция между размером ЖГМ и способностью липолитических ферментов участвовать в их расщеплении. Жировые глобулы козьего молока занимают площадь поверхности 21,778 см2/мл, тогда как в коровьем молоке - 17,117 см2/мл. Следовательно, более высокодисперсная по жиру смесь, такая как козье молоко, с более высокой площадью поверхности ЖГМ для доступа липолитических ферментов наиболее легкоусвояема для человека [32, 94].