Методы выделения и детекции
Традиционные микробиологические методы позволяют определить наличие Campylobacter в пищевых продуктах, они основаны на применении селективных питательных сред и специальных условий культивирования бактерий. Процедура выделения Campylobacter из образцов пищевых продуктов включает:
- предобогащение в селективном бульоне (например, бульон Престона, среда Парка и Сандерса) при 37 °С в течение 4 ч в микроаэрофильных условиях (5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота);
- обогащение в селективном бульоне Престона в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 18 ч;
- пересев на 2 агаровые среды для выделения изолированных колоний (агар Кармали, агар Престона и др.), инкубирование в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 24-72 ч.
Для повышения селективных свойств жидких и плотных питательных сред применяют антибиотики (полимиксин В, рифампицин, ванкомицин, триметоприм лактат, циклогексимид, нистатин и другие в различных комбинациях). Для обеспечения ростовых свойств, нейтрализации токсического действия кислорода и света в состав большинства сред вводят стерильную дефибринированную баранью или лошадиную кровь.
Поскольку использование крови в лабораториях, контролирующих пищевые продукты, вызывает затруднения, в настоящее время взамен этого компонента рекомендуют применять добавки на основе активированного угля, гематина, а также комбинации из сульфата железа, метабисульфита натрия и пирувата натрия. Для создания микроаэрофильных условий используют различные микроаэробно-генерирующие системы: газ-пакеты, СО2-инкубаторы. Перечень наиболее часто используемых селективных сред для выделения Campylobacter приведен в табл. 5.
Выросшие типичные или подозрительные колонии исследуют по основным морфологическим и биохимическим признакам, в том числе: окраска по Граму, подвижность, оксидазный и каталазный тесты, нитрат/нитрит редукция, гидролиз гиппурата, ферментация углеводов, чувствительность к антибиотикам, температура роста и др. (табл. 6).
Биохимическая дифференциация различных видов Campylobacter вызывает определенные затруднения в связи с общностью большинства признаков и возможным присутствием атипичных вариантов, например гиппуратнегативных или каталазоотрицательных штаммов C. jejuni [16].
Открытые в 1986 г. некультивируемые формы Campylobacter [17] являются фактором риска ввиду возможного присутствия их в пищевых продуктах и воде; тем самым возникают дополнительные затруднения в выявлении возбудителя и оценке безопасности зараженных объектов. Поскольку эти формы (VBNC) не способны расти на культуральных средах, они не могут быть обнаружены традиционными бактериологическими методами, в связи с чем возникает необходмость применения более точных методов, основанных на принципах молекулярной детекции.
Наиболее часто для детекции и типирования термотолерантных Campylobacter используют ме- тоды на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленные на выявление специфичных поверхностно экспрессируемых маркеров (липополисахаридов, антигенных детерминант, флагеллярных генов), консервативных последовательностей 16SРНК, а также генетических детерминант факторов вирулентности и токсинообразования C. jejuni (табл. 7).
Существует большое количество модификаций ПЦР-методов, предназначенных для детекции и идентификации C. jejuni, основная часть которых была разработана для исследования чистых культур кампилобактеров или клинических образцов (в том числе фекалий). Значительно меньше вариантов постановки ПЦР предназначено и используется для прямого об- наружения C. jejuni в пищевых продуктах, которые обычно содержат малые количества возбудителя и характеризуются высоким уровнем сопутствующей микрофлоры [18]. Перечень опубликованных молекулярных методов детекции термотолерантных видов Campylobacter приведен в табл. 8.
При исследовании пищевых продуктов наиболее часто применяются методы, основанные на ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) или изотермальной амплификации нуклеиновых кислот NASBA, которые обладают наибольшей чувствительностью и позволяют выявлять ДНК преимущественно жизнеспособных Campylobacter spp. Проведение ПЦР-РВ требует тщательного подбора способов пробоподготовки, включая селективное обогащение образцов в питательных бульонах, иммуномагнитную сепарацию и др.
В зависимости от выбранного целевого гена или нуклеотидной последовательности можно проводить межвидовую дифференциацию термотолерантных представителей рода Campylobacter с достаточной степенью достоверности. Наиболее специфичным для идентификации C. jejuni считают последовательность ceuE, амплификация которой позволяет обнаружить видоспецифические фрагменты ДНК у близкородственных микроорганизмов C. jejuni и С. coli.
Ниже приведено краткое описание постановки мультиплексной ПЦР и дуплексной ПЦР-РВ. Олигонуклеотидные праймеры и размеры ампликонов представлены в табл. 9.
При проведении мультиплексной ПЦР [48] используют 3 пары праймеров для детекции последовательности 16s rRNA (Campylobacter spp.), генов mapA (C. Jejuni ) и ceuE (С. coli). В состав ПЦР-смеси (30 мкл) входят 1хПЦР буфер, 1,5 мM MgCl2, 0,2 мM dNTPS, 0,6 е.а./мкл Taq-полимеразы, 0,5мкM MD16S1 и MD16S1 праймеров, 0,42мкM праймеров MDmapA1, MDmapA2, COL3 и MDCOL2, 100 нг пробы исследуемой ДНК. Амплификацию проводят в следующем режиме: 1 цикл при 95 °С -10 мин, 35 циклов: при 95 °С - 30 с, при 59 °С -90 с, при 72 °С - 1 мин и один цикл при 72 °С -10 мин. Продукты амплификации (10 мкл) анализируют методом электрофореза в 2% TBE-агарозном геле.
Дуплексная ПЦР-РВ направлена на одновременную детекцию двух генов mapA (C. jejuni) и ceuE (С.coli) с использованием TaqMan-зондов для получения флюоресцентного сигнала [49].
Смесь для ПЦР (20 мкл) включает TaqMan универсальную смесь, по 0,3 мкM каждого праймера, 0,1 мкM mapA-зондов, 0,05мкM ceuE-зондов и 100 нг исследуемой пробы ДНК. Амплификацию проводят в термоциклере ABI PRISM при следующих параметрах: 95 °С - 10 мин, 40 двухэтапных циклов 95 °С - 15 с, 60 °С - 60 с. Как и в традиционной ПЦР, включают позитивные и негативные контроли для каждой пары используемых праймеров.
Оценку результатов ПЦР проводят по нарастанию флюоресцентного сигнала в определенном диапазоне циклов амплификации.
В Российской Федерации разработана, стандартизована и внедрена в практику лабораторий методика детекции Campylobacter jejuni с использованием ПЦР-РВ, подробное описание которой приведено в Методических указаниях МУ 4.2.2872-2011 "Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией".
Основные этапы метода включают:
1. Посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Campylobacter в среде селективного обогащения. Для этого к необходимому количеству подготовленной пробы добавляют 9-кратный объем селективного бульона Престона или селективного бульона Дойла. Полученную взвесь инкубируют в течение 4 ч при 37 °С и в течение 18-24 ч при (42±1) °С. Инкубация осуществляется в микроаэрофильных условиях.
2. Экстракция ДНК. Применяются коммерчески доступные комплекты реагентов на основе методов преципитации или сорбции ДНК на силикагеле.
3. ПЦР для выявления ДНК Campylobacter spp. осуществляется с использованием наборов реагентов, обеспечивающих гибридизационно-флуоресцентную детекцию продуктов амплификации по конечной точке (вариант FEP) и в режиме реального времени (вариант FRT). Для подтверждения жизнеспособности бактериальных клеток Campylobacter методом ПЦР-FRT одновременно тестируют инокуляты пищевых продуктов, подвергавшиеся и не подвергавшиеся инкубации в селективной среде обогащения.
4. Заключение о присутствии Campylobacter spp. в исследованной массе продукта выдают при получении положительного результата ПЦР (выявлении ДНК) и подтверждения их жизнеспособности. Отставание сигнала по каналу JOE/HEX на 3 и более пороговых цикла (Ct) для образца, не подвергавшегося инкубации (Ctне инк.-Ctинк.≥3), свидетельствует о наличии в продукте жизнеспособных клеток Campylobacter.
В целом, учитывая большую значимость проблемы, представляется необходимым проведение углубленного изучения природных источников распространения Campylobacter jejuni, факторов вирулентности, патогенеза и механизмов возникновения инфекций, обусловленных этими эмерджентными патогенами. Наиболее перспективные исследования в изучении возбудителей пищевого кампилобактериоза будут основаны на применении инновационных геномных технологий, включающих методы ДНК-типирования патогенов на основе "microarray"-технологий, мультиплексных форматов ПЦР и секвенирования геномов Campylobacter spp. Это позволит сформировать расширенную базу данных о генетических регуляторных механизмах экспрессии вирулентных свойств этих микроорганизмов для разработки новых критериев безопасности и анализа степени микробиологического риска возникновения пищевого кампилобактериоза.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00015).
Литература
1. Ефимочкина Н.Р. Некоторые закономерности появления эмерджентных пищевых патогенов // Вопр. питания. 2006. № 4. С. 9-15.
2. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н. Изучение загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter // Вопр. питания. 2006. № 6. С. 38-43.
3. John T., Prescott M., Munroe L. Campylobacter jejuni enteritis in man and domestic animals // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1982. Vol. 181, N 12. P. 1524-1530.
4. Schmidt K. WHO Surveillance Programme for control of foodborne infections and intoxications in Europe. 6th Report - FAO/WHO Collaborating Centre for Research and Training in Food Hygiene and Zoonosis. Berlin, 1995.
5. Nachamkin I., Guerry P. Campylobacter infections // Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology. Wymondham, 2005. P. 285-293.
6. Levin R.E. Rapid Detection and Characterization of Foodborne Pathogens by Molecular techniques. USA : CRC Press, 2010. 592 p.
7. Humphrey T., O’Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, N 03. P. 237-257.
8. Nachamkin I. Chronic effects of Campylobacter infections // Microbes Infect. 2002. Vol. 4, N 4. P. 399-403.
9. Куликовский А.В. Эмерджентные пищевые зоонозы. М., 2004. 174 с.
10. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р. Иванов А.А. и др. Пищевые отравления и инфекции в Российской Федерации за период 1992-2001 гг.: состояние проблемы и тенденции // Гиг. и сан. 2003. № 3. С. 38-45.
11. Marchant J., Wren B., Ketley J. Exploiting genome sequence: predictions for mechanisms of Campylobacter chemotaxis // Trends Microbiol. 2002. Vol. 10, N 4. P. 155-159.
12. Young K.T., Davis L.M., Dirita V.J. Campylobacterjejuni: molecular biology and pathogenesis // Nat. Rev. Microbiol. 2007. Vol. 5, N 9. P. 665-679.
13. Kopecko D.J., Hu L., Zaal K.J. Campylobacterjejuni - microtubuledependent invasion // Trends Microbiol. 2001. Vol. 9, N 8. P. 389-396.
14. Pei Z., Burucoa C., Grignon B. et al. Mutation in the peb1A locus of Campylobacterjejuni reduces interactions with epithelial cells and intestinal colonization of mice // Infect. Immun. 1998. Vol. 66, N 3. P. 938-943.
15. Lara-Tajero M., Galan J.E. Cytolethal distending toxin: limited damage as a strategy to modulate cellular functions // TrendsMicrobiol. 2002. Vol. 10. P. 147.
16. Paulsen P., Kanzler P., Hilbert F. et al. Comparison of three methods for detecting Campylobacter spp. in chilled or frozen meat // Int. J. Food Microbiol. 2005. Vol. 103, Issue 2. P. 229-233.
17. Rollins D.M., Colwell R.R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment // Appl. Environ. Microbiol. 1986. Vol. 52, N 3. P. 531-538.
18. Булахов А.В., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Обнаружение бактерий рода Campylobacter в птицепродуктах с помощью метода полимеразной цепной реакции // Вопр. питания. 2010. Т. 79, № 3. С. 24-29.
19. Cheng Z., Griffiths M.W. Rapid Detection of Campylobacter jejuni in Chicken Rinse Water by Melting-Peak Analysis of Amplicons in RealTime Polymerase Chain Reaction // J. Food Protection. 2003. Vol. 66, N 8. P. 1343-1352.
20. Sails A.D., Fox A.J., Bolton F.J. et al. A Real-Time PCR Assay for the Detection of Campylobacter jejuni in Foods after Enrichment Culture // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, N 3. P. 1383-1390.
21. Josefsen M.H., Cook N., D’Agostino M. et al. Validation of a PCRbased method for detection of food-borne thermotolerant Campylobacters in a multicenter collaborative trial // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, N 7. P. 4379-4383.
22. Oliveira T.C.R.M., Barbut S., Griffiths M.W. Detection of Campylobacter jejuni in naturally contaminated chicken skin by melting peak analysis of amplicons in real-time PCR // Int. J. Food Microbiol. 2005. Vol. 104, Issue 1. P. 105-111.
23. Abu-Halaweh M., Bates J., Patel B.K.C. Rapid detection and differentiation of pathogenic Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by real-time PCR // Res. Microbiol. 2005. Vol. 156, N 1. P. 107-114.
24. Oliveira T.C.R.M., Barbut S., Griffiths M.W. A Robotic DNA purification protocol and real-time PCR for the detection of Campylobacter jejuni in foods // J. Food Protection. 2005. Vol. 68, N 10. P. 2131-2135.
25. Wolffs P., Norling B., Hoorfar J. et al. Quantification of Campylobacter spp. in Chicken Rinse Samples by Using Flotation prior to Real-Time PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71, N 10. P. 5759-5764.
26. Krause M., Josefsen M. H., Lund M. et al. Comparative, collaborative, and on-site validation of a TaqMan PCR method as a tool for certified production of fresh, Campylobacter-free chickens // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72, N 8. P. 5463-5468.
27. Debretsion A., Habtemariam N., Wilson S. et al. Real-time PCR assay for rapid detection and quantification of Campylobacter jejuni on chicken rinses from poultry processing plant // Mol. Cell. Probes. 2007. Vol. 21, Issue 3. P. 177-181.
28. Fukushima H., Katsube K., HataY. et al. Rapid separation and concentration of food-borne pathogens in food samples prior to quantification by viable-cell counting and real-time PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73, N 1. P. 92-100.
29. Wolffs P.F.G., Glencross K., Norling B., Griffiths M.W. Simultaneous quantification of pathogenic Campylobacter and Salmonella in chicken rinse fluid by a flotation and real-time multiplex PCR procedure // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, Issue 1. P. 50-54.
30. Hong J., Jung W.K., Kim J.M. et al. Quantification and differentiation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in raw chicken meats using a real-time PCR Method // J. Food Protection. 2007. Vol. 70, N 9. P. 2015-2022.
31. Konkel M.E., Gray S.A., Kim B.J. et al. Identification of the enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on the cadF virulence gene and its product // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37, N 3. P. 510-517.
32. Waage A.S., Vardund T., Lund V., Kapperud G. Detection of Small Numbers of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli cells in environmental water, sewage, and food samples by a seminested PCR assay // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65, N 4. P. 1636-1643.
33. Waller D.F., Ogata S.A., Quantitative immunocapture PCR assay for detection of Campylobacter jejuni in foods // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66, N 9. P. 4115-4118.
34. Thunberg R. L., Tran T.T., Walderhaug M.O. Detection of thermophilic Campylobacter spp. in blood-free enriched samples of inoculated foods by the polymerase chain reaction // J. Food Protection. 2000. Vol. 63, N 3. P. 299-303.
35. Denis M., Refregier-Petton J., Laisney M.J. et al. Campylobacter contamination in French chicken production from farm to consumers. Use of a PCR assay for detection and identification of Campylobacter jejuni and Camp. coli // J. Appl. Microbiol. 2001. Vol. 91, N 2. P. 255-267.
36. Moreno Y., Hernandez M., Ferrus M. A. et al. Direct detection of thermotolerant campylobacters in chicken products by PCR and in situ hybridization // Res. Microbiol. 2001. Vol. 152, N 6. P. 577-582.
37. Bolton F.J., Sails A.D., Fox A.J. et al. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in foods by enrichment culture and polymerase chain reaction enzyme-linked immunosorbent assay // J. Food Protection. 2002. Vol. 65, N 5. P. 760-767.
38. Hong Y., Berrang M.E., Liu T. et al. Rapid detection of Campylobacter coli, C. jejuni, and Salmonella enterica on poultry carcasses by using PCR-enzyme-linked immunosorbent assay // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, N 6. P. 3492-3499.
39. Josefsen M.H., Jacobsen N.R., Hoorfar J. Enrichment followed by quantitative PCR both for rapid detection and as a tool for quantitative risk assessment of food-borne thermotolerant Campylobacters // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, N 3. P. 3588-3592.
40. Bohaychuk V.M., Gensler G.E., King R.K. et al. Evaluation of detection methods for screening meat and poultry products for the presence of foodborne pathogens // J. Food Protection. 2005. Vol. 68, N 12. P. 2637-2647.
41. Mateo E., Carcamo J., Urquijo M. et al. Evaluation of a PCR assay for the detection and identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in retail poultry products // Res. Microbiol. 2005. Vol. 156, N 4. P. 568-574.
42. Quinones B., Parker C.T., Janda J.M. Jr. et al., Detection and genotyping of Arcobacter and Campylobacter isolates from retail chicken samples by use of DNA oligonucleotide arrays // Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73, N 11. P. 3645-3655.
43. Schmid M.W., Lehner A., Stephan R. et al. Development and application of oligonucleotide probes for in situ detection of thermotolerant Campylobacter in chicken faecal and liver samples // Int. J. Food Microbiol. 2005. Vol. 105, Issue 2. P. 245-255.
44. Uyttendaele M., Schukkink R., van Gemen B., Debevere J. Detection of Campylobacter jejuni added to foods by using a combined selective enrichment and nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) // Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61, N 4. P. 1341-1347.
45. Uyttendaele M., Bastiaansen A., Debevere J. Evaluation of the NASBA® nucleic acid amplification system for assessment of the viability of Campylobacter jejuni // Int. J. Food Microbiol. 1997. Vol. 37, Issue 1. P. 13-20.
46. Uyttendaele M., Debevere J., Lindqvist R. Evaluation of buoyant density centrifugation as a sample preparation method for NASBAELGA detection of Campylobacter jejuni in foods // Food Microbiol. 1999. Vol. 16, N 6. P. 575-582.
47. Churruca E., Girbau C., Martinez I. et al. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in chicken meat samples by realtime nucleic acid sequence-based amplification with molecular beacons // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, Is. 1. P. 85-90.
48. Denis M., Soumet C., Rivoal K. et al. Development of a m-PCR assay for simultaneous identification of Campylobacter jejuni and C. coli. // Lett. Appl. Microbiol. 1999. Vol. 29, Is. 6. P. 406-410.
49. Best E.L., Powell E.J., Swift C. et al. Applicability of a rapid duplex real-time PCR assay for speciation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli directly from culture plates // FEMS Microbiol. Lett. 2003. Vol. 229, N 2. P. 237-241.