В процессе технологической тепловой обработки пищевых продуктов часто наблюдается изменение их органолептических характеристик (окраски, вкуса и аромата) вследствие образования окрашенных веществ в результате реакции так называемого процесса меланоидинообразования, взаимодействия редуцирующих сахаров и свободных аминокислот, реакции неферментативного потемнения, впервые описанной французским ученым Майяром в 1912 г. Данная реакция может проходить в продуктах животного и растительного происхождения, поскольку все они содержат определенное количество редуцирующих сахаров и свободных аминокислот или они образуются в ходе технологического процесса [1-6].
Процесс меланоидинообразования оказывает определенное влияние на потребительские свойства и качество пищевых продуктов, так как наряду с улучшением органолептических показателей [7-10] и образованием веществ, обладающих антиоксидантными свойствами [11-13], при этом наблюдается накопление токсичных веществ [14-16], снижение пищевой ценности вследствие расходования аминокислот. В связи с этим исследование данного химического превращения является важным аспектом создания инновационных пищевых продуктов.
Цель работы - моделирование реакции меланоидинообразования in vitro на примере взаимодействия гидролизата белка куриного яйца и глюкозы для определения изменения содержания аминокислот в зависимости от условий протекания данной реакции.
Материал и методы
Объектом исследования стал гидролизат белка куриного яйца, который получали следующим образом. Белок куриного яйца отделяли от желтка, отбирали 4 пробы по 0,2 г белка. К каждой пробе добавляли по 4 см3 6 н раствора HCl и проводили кислотный гидролиз в течение 24 ч при 80 °С. Далее каждую пробу разбавляли дистиллированной водой в мерной колбе объемом 100 см3. Затем гидролизат нейтрализовали 10 н раствором NaOH до рН 7, доводили объем до 100 см3. Отбирали 2 см3 гидролизата и фильтровали его через мембранный фильтр; далее определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) исходное (начальное) содержание аминокислот.
По 30 см3 гидролизата отбирали в 3 конические колбы объемом 50 см3 для 3 опытов по одному из параметров моделируемой реакции: температуре (50, 70 и 90 °С) и времени (10, 30 и 50 мин). В каждую пробу к гидролизату добавляли по 4,5 г глюкозы для получения 15% раствора глюкозы в гидролизате. Далее проводили реакцию меланоидинообразования при рН 7. При исследовании воздействия температуры на реакцию меланоидинообразования реакция продолжалась 30 мин, а при исследовании влияния времени ее проводили при 70 °С. После завершения реакции исследуемые растворы охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через мембранный фильтр в виалы объемом по 2 см3. Подготовленные таким образом пробы анализировали методом ВЭЖХ.
Определение количества аминокислот производили с помощью ВЭЖХ [17] с предколоночной дериватиза-цией с использованием о-фталевого альдегида. Система включала хроматограф Agilent 1200 ("Agilent", США), диодно-матричный детектор (DAD, G1315D) и аналитическую колонку 3,0x150 мм, 3,5 мкм (ZORBAX Eclipse-AAA). Условия проведения ВЭЖХ-анализа: температура термостатов колонки - 40 °С, расход элюента - 0,4 мл/мин, длина волны детектирования УФ -338 нм. Для количественного определения был построен калибровочный график зависимости площади пика аминокислот от их концентрации. Для этого использовали стандартные растворы смеси аминокислот с концентрациями 25, 100, 250 пмоль/мкл. Время удерживания аминокислот составило (RT), мин: аспартат (ASP) -2,5; глутамат (GLU) - 3,7; серин (SER) - 9,7; гистидин (HIS) - 11,1; глицин (GLY) - 11,6; треонин (THR) - 11,9; аргинин (ARG) - 13,1; аланин (ALA) - 13,6; тирозин (TYR) -15,2; цистин (CYS) - 17,0; валин (VAL) - 18,1; метионин (MET) - 18,4; фенилаланин (PHE) - 20,2; изолейцин (ILE) -20,5; лейцин (LEU) - 21,4; лизин (LYS) - 21,6.
Результаты и обсуждение
Общая схема образования меланоидинов представлена на рис. 1 [18-20]. Так, начальная реакция - конденсация карбонильной группы редуцирующего сахара (альдозы) со свободной аминогруппой белка или аминокислоты, с потерей молекулы воды и образованием N-замещенного глюкозамина (этап 1).
Глюкозамин нестабилен и подвергается перегруппировке Амадори с формированием 1-амино-1-дезокси-2-кетозы (кетозамина) (этап 2). Продукты перегруппировки Амадори во второй фазе могут реагировать тремя путями. Один из них - дальнейшая дегидратация (потеря двух молекул воды) с образованием редуктонов и дегидроредуктонов (этап 3). Второй путь - образование короткоцепочечных продуктов гидролиза, таких как диацетил, ацетон, пировиноградный альдегид и т.д. (этап 4), которые далее с участием аминокислот подвергаются распаду по Стреккеру до альдегидов (этап 5) и альдольной конденсации, либо при отсутствии аминных соединений реагируют с образованием аль-долей и высокомолекулярных безазотистых полимеров (этап 6). Третий путь - через Шиффовы основания и фурфурол. При этом отщепляются 3 молекулы воды (этап 3), затем протекает реакция с участием аминокислот и воды. Все продукты второй фазы реагируют далее с аминокислотами в третьей фазе с образованием азотистых полимеров и сополимеров, называемых меланоидинами, коричневого цвета (этап 7). Они имеют различный аромат: от горького (жженого, лукового, прогорклого, капустного) до приятного (солодовый, корки хлеба, карамели, кофе). Этап 8 иллюстрирует прямой путь расщепления глюкозамина, минуя стадию перегруппировки Амадори.
Стандартный меланоидин содержит гидроксильные, карбонильные и карбоксильные группировки, кратные и эфирные связи, а его молекулярная масса колеблется между двумя и тридцатью тысячами Да. Многие исследователи, изучавшие реакцию Майара на различных примерах, выделили производные фурана, пиррола, пиридина, пиразина, карболина и других гетероциклических соединений [21].
Общая схема разложения аминокислот при реакции меланоидинообразования описывается последовательностью реакций по Стреккеру (рис. 2) [18-20].
В результате проведенных исследований по моделированию реакции меланоидинообразования были выявлены следующие особенности.
Влияние продолжительности реакции на процесс меланоидинообразования неоднозначно (см. таблицу). Для SER, THR, VAL, MET, ILE, LEU с увеличением продолжительности реакции с 10 до 50 мин концентрации аминокислот практически линейно возрастали. ASP и HIS характеризуются скачкообразным изменением концентрации с максимумом при продолжительности процесса 30 мин. Минимальные концентрации следующих аминокислот: GLU, GLY, ARG, ALA, TYR, CYS, PHE и LYS были отмечены при продолжительности реакции 30 мин.
При исследовании зависимости протекания реакции меланоидинообразования от концентрации глюкозы в растворе гидролизата белка с увеличением количества глюкозы наблюдалось уменьшение концентраций аминокислот, причем для большинства аминокислот их концентрация уменьшалась плавно, практически линейно, и только для CYS имело место резкое падение содержания, а в случае TYR концентрация сначала сильно уменьшалась, затем незначительно возрастала (рис. 3).
Подобная зависимость наблюдалась при исследовании влияния температуры на протекание реакции меланоидинообразования: реакция проходила уже при температуре 30 °С, дальнейшее изменение температуры в диапазоне 50-90 °С практически не влияло на процесс меланоидинообразования (рис. 4).
При термической обработке происходит дальнейшая поликонденсация, а при температуре выше 400 °С образуются так называемые пиромеланоидиды. Меланоидины не расщепляются пищеварительными ферментами человека, и следовательно, они не усваиваются. Однако они могут образовывать комплексы с белками-ферментами, влияя на их каталитическую активность [21].
Важную роль в реакции меланоидинообразования играет термическая трансформация глюкозы. Так, глюкоза при нагревании в кислой среде до 100 °С способна превращаться в фурфурол или 5-гидроксиметилфур-фурол [21].
Известно, что 5-гидроксиметилфурфурол малоустойчив и легко разлагается с образованием муравьиной и левулиновой кислот; при его конденсации также могут образовываться гуминовые вещества. Гуминовые вещества небольшой степени конденсации растворимы в воде и окрашивают продукт в желтый цвет [21].
Наиболее значительное влияние на аминокислотный состав пробы оказывает уровень рН среды, в которой протекает реакция (рис. 5).
Так, было установлено, что в кислой среде процесс меланоидинообразования замедлялся для всех исследуемых кислот. Наибольшая устойчивость к разрушению отмечена у CYS, наименьшая - у LYS. Также установлено значительное снижение концентраций ILE, LEU и PHE, их содержание было практически на одном уровне. Другие аминокислоты, такие как MET, ALA, THR, GLY, HIS, SER, GLU, ASP, имели близкое содержание, наиболее сохранились CYS и TYR.
Кривая зависимости концентрации аминокислот от рН среды имеет максимум в нейтральной среде (рН 7) для PHE и CYS. Так же как и в кислой среде, в наибольшей степени подверглась деградации аминокислота LYS, а наиболее устойчивой оказалась CYS. Концентрация аминокислот VAL и TYR снизилась незначительно.
В щелочной среде наиболее устойчивыми оказались ILE, MET, VAL, причем максимальную устойчивость проявили аминокислоты MET и ILE при рН 12, причем для ILE наблюдалось линейное снижение концентрации при переходе из щелочной среды в кислую. Сильной деградации подверглись следующие аминокислоты: THR, HIS, GLY, SER, ASP, LYS, CYS, GLU. Относительно устойчивыми оказались LEU, PHE, ARG, TYR, ALA.
В целом исследования показали, что при прочих равных условиях эксперимента наиболее полно процесс меланоидинообразования протекал в щелочной среде при рН 12.
Анализ результатов исследований показывает, что процесс образования меланоидинов многостадиен, и на каждой стадии сахароаминной реакции могут образовываться побочные продукты. Чередующиеся кратные связи хиноидной системы стабилизируются, принимая ароматический характер гетероциклических соединений. Меланоидины способны окисляться и восстанавливаться, причем первая реакция идет быстрее второй [21].
Наблюдаемое существенное снижение концентраций аминокислот в гидролизате белка куриного яйца, по-видимому, связано с протеканием реакции меланоидинообразования и процессов термического разрушения аминокислот.
Кроме того, активность реакции меланоидинообра-зования во многих случаях зависит от особенностей строения и физико-химических свойств органических соединений (моноуглеводов и аминокислот). Многие органические соединения имеют сложную иерархичную структуру и способны "ступенчато маскировать" свое сродство к реакции меланоидинообразования, т.е. на каждом из иерархических уровней организации данные вещества имеют свою активность. При этом именно на последнем иерархическом уровне сродство к реакции меланоидинообразования наибольшее. К веществам, обладающим сложной и многоуровневой иерархичностью, можно отнести белковые молекулы.
Наблюдаемое повышение концентрации некоторых аминокислот может быть связано с частичным ресинтезом. Установлено, что аминокислоты могут образовываться при определенных условиях из простых неорганических соединений [22, 23].
Таким образом, в результате проведенных исследований по моделированию реакции меланоидинообразованиявыявлены следующие закономерности: при увеличении температуры реакции Майяра снижались концентрации GLU, SER, HIS, THR, ARG, ALA, CYS, VAL, MET, LEU, LYS. В то же время с увеличением продолжительности реакции наблюдалось увеличение концентрации SER, THR, VAL, MET, ILE, LEU. Колебания концентрации аминокислот в реакционной среде (повышение и понижение) при повышении температуры проведения реакции были характерны для ASP, GLY, TYR, PHE, ILE, а при увеличении времени проведения реакции - для ASP, GLU, HIS, GLY, ARG, ALA, TYR, CYS, PHE, LYS. Наиболее существенные изменения отмечены при изменении рН в щелочную сторону.
Исследование влияния условий проведения эксперимента показало, что в процессе меланоидинообразования происходит снижение содержания некоторых аминокислот (в том числе незаменимых) и, следовательно, снижение пищевой ценности продукта. В результате протекания этой реакции теряется от 20 до 50% свободных аминокислот, причем с возрастанием температуры и увеличением продолжительности нагревания эти потери возрастают. Полученные данные важно учитывать при разработке новых технологий пищевых продуктов с максимальным сохранением их химического состава, пищевой ценности и потребительских свойств.
Литература
1. Schamberger G.P., Labuza Th. P. Effect of green tea flavonoids on Maillard browning in UHT milk // LWT Food Sci. Technol. 2007. Vol. 40, N 8. P. 1410-1417.
2. Andrewes P. Changes in Maillard reaction products in ghee during storage // Food Chem. 2012. Vol. 135, N 3. P. 921-928.
3. Bekedam E.K., Roos E., Schols H.A., Van Boekel M.A.J.S., Smit G. Low molecular weight melanoidins in coffee brew // J. Agric. Food Chem. 2008. Vol. 56, N 11. P. 4060-4067.
4. Wellner A., Huettl Ch., Henle Th. Formation of Maillard reaction products during heat treatment of carrots // J. Agric. Food Chem. 2011. Vol. 59, N 14. P. 7992-7998.
5. Coimbra M.A., Nunes C., Cunha P. R., Guine R. Amino acid profile and Maillard compounds of sun-dried pears. Relation with the reddish brown colour of the dried fruits // Eur. Food Res. Technol. 2011. Vol. 233, N 4. P. 637-646.
6. Jing H., Yap M., Wong P.Y.Y., Kitts D.D. Comparison of physicochemical and antioxidant properties of egg-white proteins and fructose and inulin Maillard reaction products // Food Bioprocess Technol. 2011. Vol. 4, N 8. P. 1489-1496.
7. Hong J.-H., Kwon K.-Y., Kim K.-O. Sensory characteristics and consumer acceptability of beef stock containing the glutathione-xylose Maillard reaction product and/or monosodium glutamate // J. Food Sci. 2012. Vol. 77, N 6. P. S233-S239.
8. Wang R., Yang Ch., Song H. Key meat flavour compounds formation mechanism in a glutathione-xylose Maillard reaction // Food Chem. 2012. Vol. 131, N 1. P. 280-285.
9. Жаркова И.М., Кучменко Т.А., Росляков Ю.Ф. Исследование запаха хлеба их смеси ржаной и пшеничной муки, приготовленного на разных заквасках и подкислителе // Хлебопродукты. 2015. № 8. С. 47-49.
10. Lee S.M., Jo Ye-Jin, Kim Y.-S. Investigation of the aroma-active compounds formed in the Maillard reaction between glutathione and reducing sugars // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58, N 5. P. 3116-3124.
11. Alves R.C., Costa A.S.G., Jerez M., Casal S., Sineiro J., Nunez M.J. et al. Antiradical activity, phenolics profile, and hydroxymethylfurfural in espresso coffee: influence of technological factors // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58, N 23. P. 12 221-12 229.
12. Liu Y., Kitts D. D. Confirmation that the Maillard reaction is the principle contributor to the antioxidant capacity of coffee brews // Food Res. Int. 2011. Vol. 44, N 8. P. 2418-2424.
13. Lopez de Lerma N., Peinado J., Moreno J., Peinado R. A. Antioxidant activity, browning and volatile Maillard compounds in Pedro Ximenez sweet wines under accelerated oxidative aging // LWT Food Sci. Technol. 2010. Vol. 43, N 10. P. 1557-1563.
14. Carrieri G., De Bonis M.V., Pacella C., Pucciarelli A., Ruocco G. Modeling and validation of local acrylamide formation in a model food during frying // J. Food Eng. 2009. Vol. 95, N 1. P. 90-98.
15. Gokmen V., Senyuva H. Z. Study of colour and acrylamide formation in coffee, wheat flour and potato chips during heating // Food Chem. 2006. Vol. 99, N 2. P. 238-243.
16. Mestdagh F., De Wilde T., Delporte K., Van P. C., De Meulenaer B. Impact of chemical pre-treatments on the acrylamide formation and sensorial quality of potato crisps // Food Chem. 2008. Vol. 106, N 3. P. 914-922.
17. Agilent Technologies (PN: 5980-1193EN) Rapid, Accurate, Sensitive, and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acids / пер. на русский язык: В. Панкратов, Д. Янович. Минск, 2006. 10 с.
18. Полумбрик М.О., Литвяк В.В., Ловкис З.В., Ковбаса В.Н. Углеводы в пищевых продуктах. Минск : ИВЦ Минфина, 2016. 592 с.
19. Щербаков В.Г., Лобанов В.Г., Прудникова Т.Н., Минакова А.Д. Биохимия. СПб. : ГИОРД, 2003. 440 с.
20. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др. Пищевая химия / под ред. А.П. Нечаева. СПб. : ГИОРД, 2001. 592 с.
21. Давидянц С.Б. Темное царство меланоидинов // Химия и жизнь. 1980. № 3. С. 44-48.
22. Johnson A.P., Cleaves H.J., Dworkin J.P., Glavin D.P., Lazcano A., Bada J.L. The Miller volcanic spark discharge experiment // Science. 2008. Vol. 322. P. 404.
23. Bada J.L., Lazcano A. Prebiotic soup - revisiting the Miller experiment // Science. 2003. Vol. 300. P. 745-746.