Влияние молочнокислых микроорганизмов и дрожжей на продукцию энтеротоксинов стафилококков

РезюмеИсследовано влияние 10 молочнокислых культур на рост и продукцию стафилококковых энтеротоксинов типа А и В (СЭА и СЭВ) при совместном выращивании. Показано, что молочнокислые бактерии уменьшают синтез СЭА в 5,7 раза, а СЭВ - 1,56 раза по сравнению с контролем. Все исследуемые культуры оказывали ингибирующее действие на продукцию СЭА и СЭВ. Установлено, что молочнокислые бактерии уменьшали рост стафилококков в 1,48 раза. Наиболее эффективными ингибиторами продукции СЭА и СЭВ оказались штаммы Lactobacillus сasei, Lactobacillus acidophilus 317/402.

Ключевые слова:молочнокислые микроорганизмы, дрожжи, стафилококковые энтеротоксины

Как известно, пищевые интоксикации стафилококковой этиологии обусловлены воздействием на организм не живых микробных клеток, а стафилококковых энтеротоксинов (СЭ). Известен 21 тип СЭ [7], они иммунологически различны. Наибольшее значение из них в возникновении пищевых интоксикаций имеют типы А, В, С, D [9]. Считается, что для синтеза 100-200 нг СЭ, т.е. количества, способного вызвать симптомы пищевого отравления у человека, достаточно наличия в продуктах 5Ч105 колониеобразующих единиц (КОЕ)/г Staphylococcus (S.) aureus [7]. Следует подчеркнуть, что термическая обработка продуктов убивает стафилококки, но не разрушает СЭ. Кроме того, СЭ расцениваются как патогенетический фактор при различных патологических состояниях [5], возникающий в результате колонизации энтеротоксинпродуцирующими стафилококками кишечника, кожных покровов, дыхательных путей человека.

Количество продуцируемых штаммами СЭ как в пищевых продуктах, так и в организме человека зависит от влияния многих факторов - состава питательных субстратов, температуры, рН, наличия других микроорганизмов [6, 11]. Показано, что молочнокислые бактерии рода Lactococcus ингибировали рост стафилококков и образование СЭ в продуктах благодаря образованию ими антимикробных веществ полипептидной природы, а также в результате снижения рН среды [11, 12]. В частности, установлено, что рост S. aureus замедляют молочная и пировиноградная кислоты, причем молочная кислота ингибирует образование СЭ типов А, B, С и D, которые, как известно, играют наиболее важную роль при пищевых отравлениях [10]. Однако данных о том, какое влияние на энтеротоксигенность стафилококков могут оказывать молочнокислые микроорганизмы других видов (в первую очередь используемые при производстве кисломолочных продуктов и биологически активных добавок к пище), недостаточно. Отсутствуют данные о влиянии на экспрессию факторов патогенности у стафилококков и других биотехнологических микроорганизмов, распространенных сегодня в качестве компонентов биологически активных добавок (БАД) к пище, таких, например, как дрожжи (пивные, винные), используемых после термообработки и в виде автолизатов. Нет сведений и о влиянии на продукцию СЭ стафилококками нативных дрожжей Saccharomyces boulardii, которые широко применяются для коррекции дисбактериозов кишечника [4].

Целью данной работы являлось изучение влияния молочнокислых бактерий в монокультурах и ассоциациях, а также живых и термически обработанных дрожжей на продукцию СЭ типов А(СЭА) и В (СЭВ).

Материал и методы

Испытывали суспензии культур живых молочнокислых бактерий, выделенных из кисломолочных продуктов и заквасок, рода Lactobacillus (7 штаммов), и консорциумов, включающих: 1) Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides; 2) Lactobacillus paracasei, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii; 3) Lactococcus lactis, Lactococcus lactis cremoris.

Также были использованы дрожжи, которые применяются при производстве вина или БАД к пище - Saccharomycetales (Pichia anomala, современное наименование Wickerhamomyces anomalus, - 7 штаммов, Saccharomyces сerevisiae - 1 штамм и Saccharomyces boulardii - 1 штамм) и Debariomycetales (Pichia guilliermondii, современное наименование Meyerozyma guilliermondii, - 5 штаммов), выделенных из пищевых продуктов. Взвеси дрожжевых штаммов исследовали в нативном (живом) виде и после термической обработки при 100 °С в течение 15 мин.

Способность подавлять продукцию СЭ исследовали с помощью модельной микробиологической системы, состоящей из жидкой питательной среды с ферментативным гидролизатом казеина (с содержанием аминного азота 200 мг/%), обычно используемой для накопления СЭ стафилококками, и штаммов-продуцентов СЭА (S. aureus FRI-722) и СЭВ (S. aureus S6-715H).

Перед культивированием в среду добавляли 1,0% сердечно-мозговой вытяжки, устанавливали рН 7,2, разливали по 4,5 см3 в пробирки емкостью 50 см3, затем в каждую пробирку вносили по 0,5 мл суточной культуры стафилококков, содержащей 107 КОЕ/см3. Непосредственно после инокуляции S. aureus в систему добавляли молочнокислые бактерии или дрожжи. Посевная доза для всех тест-штаммов составляла 0,5 см3 с концентрацией 5Ч107 КОЕ/см3. С помощью стерильной 1 н NaOH рН в системе корректировали до значения 7,2. Культуру стафилококков выращивали на шуттель-аппарате при непрерывном встряхивании 120 об./мин в течение 24 ч при 37 °С. Сразу после культивирования взвесь стафилококков из каждой пробирки подвергали 10-кратному разведению, для чего использовали стерильный 0,001 н фосфатный буфер (ФБР) с рН 7,2. Потом тщательно перемешивали, производили высевы на чашки Петри со средой Baird-Parker с теллуритом калия по 50 мкл из разведения 106-108 и растирали культуру стерильным шпателем по всей поверхности. Чашки затем помещали в термостат при 37 °С на 24 ч, после чего подсчитывали колонии стафилококков.

Для определения содержания СЭ микробные клетки из пробирок удаляли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость прогревали в течение 15 мин при 100 °С, после чего определяли наличие СЭ иммуноферментным методом согласно МУК № 4.2.2429-08 [8] с использованием иммуноферментных тест-систем, разработанных нами ранее [1, 2]. Контролем служили референс-штаммы - продуценты СЭ типов А и В, культивируемые при тех же условиях, что и опытные образцы, но без добавления молочнокислых бактерий и дрожжей. Отрицательным контролем служил субстратный буфер. Концентрацию СЭ учитывали с использованием планшетного спектрофотометра. Оптическую плотность образцов и отрицательного контроля измеряли при длине волны 492 нм. Положительными считали значения оптической плотности образцов, в 2 раза превышавшие оптическую плотность отрицательного контроля.

Влияние дрожжей и молочнокислых микроорганизмов на продукцию СЭ считали стимулирующим, если продукция СЭ в опыте была выше, чем в контроле, и ингибирующим - если количество продуцируемого СЭ в опыте было ниже, чем в контроле.

Фосфолипазную активность учитывали с использованием среды Baird-Parker по образованию просветления вокруг колоний, определяя отношение количества клеток, обладающих фосфолипазной активностью, к общему количеству выросших клеток стафилококка (%). Плазмокоагулазную активность культур стафилококков (выборочно) находили традиционным методом с использованием кроличьей плазмы. В пробах также измеряли рН после культивирования. Статистические расчеты результатов опытов проводили по указанному в работе [3] методу.

Результаты и обсуждение

Данные о влиянии молочнокислых бактерий на рост стафилококков и продукцию СЭА и СЭВ представлены в табл. 1. Видно, что при совместном культивировании стафилококков с молочнокислыми бактериями (опытная группа) уменьшался рост количества стафилококков в 1,48 раза по сравнению с контрольной культурой S. aureus, выращенной без использования молочнокислых бактерий. При этом последние уменьшали синтез СЭ типа А в 5,7 раза по сравнению с контролем, причем рН среды опытных образцов была такой же, как и контрольных.

Количество колоний стафилококков, продуцирующих фосфолипазу, уменьшалось до 75% по сравнению с контролем. Наиболее выраженное ингибирующее действие на продукцию СЭА оказывали штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus sp. (29, Б4, Б5, Б6), L. casei, L. acidophilus 317/402, менее эффективными были L. acidophilus, L. lactis, L. lactis subsp. diacetylactis, L. lactis subsp. cremoris, L. mesenteroides, L. paracasei, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii.

При изучении влияния молочнокислых микроорганизмов на стафилококки, продуцирующие СЭВ, показано, что по сравнению с таковым в контроле число клеток в культуре стафилококков существенно не изменялось. В то же время синтез СЭВ уменьшался в 1,6 раза. При этом рН культуральной жидкости существенно не изменялся по сравнению с контролем. Следует отметить, что молочнокислые микроорганизмы не влияли на фосфолипазную активность клеток стафилококков, продуцирующих СЭВ.

Нами показано, что наибольшее выраженное ингибирующее действие на продукцию стафилококками СЭВ оказывали штаммы молочнокислых бактерий L. sp. (21), L. casei, Lactobacillus acidophilus 317/402, менее эффективное - L. sp. (29, Б4, Б5, Б6), L. acidophilus, L. lactis cremoris, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus paracasei, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Lactococcus lactis, L. lactis cremoris.

При исследовании влияния нативных дрожжей на продукцию СЭА показано (табл. 2), что количество микробных клеток в опыте существенно не изменялось по сравнению с таковым в контроле (S. aureus без дрожжей), а средний титр СЭА уменьшался в 1,2 раза. Однако отдельные активные продуценты (S. boulardii, S. cerevisiae) обеспечивали увеличение количества СЭА в 1,5-2 раза. рН опытных образцов после культивирования существенно не отличался от рН контроля, а фосфолипазная активность по сравнению с контрольными образцами снижалась до 43,5%.

При исследовании влияния нативных дрожжей на продукцию СЭВ показано, что они увеличивают синтез СЭВ в 1,4 раза по сравнению с контролем (см. табл. 2) и не влияют на величину рН, которая в опытных и контрольных образцах была одинаковой. В свою очередь, фосфолипазная активность исследуемых культур стафилококков составляла 100%. И, наконец, следует отметить, что при совместном культивировании стафилококков и нативных дрожжей P. guilliermondii A1, P. anomala 9а, P. guilliermondii Н1, P. anomala А2, S. boulardii продукция СЭВ по сравнению с контролем увеличивалась в 2 раза.

Изучение влияния термообработанных дрожжей на продукцию СЭ типа А продемонстрировало увеличение роста стафилококков 1,12 раза, при этом средний титр СЭА был в 1,42 раза меньше, чем в контроле. Однако, так же как и в случае с живыми дрожжами, взвеси отдельных штаммов, как S. boulardii и S. cerevisiae, повышали образование СЭА в 1,5-2 раза по сравнению с контролем (табл. 3).

Таблица 1. Показатели роста и функциональных свойств токсинообразующих S. aureus при совместном выращивании с молочнокислыми бактериями

Таблица 2. Показатели роста и функциональных свойств токсинообразующих S. aureus при совместном выращивании с нативными дрожжами

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что исследуемые штаммы молочнокислых бактерий обладают различной способностью ингибировать рост и продукцию СЭА и СЭВ. При этом выявлено, что одни и те же штаммы молочнокислых бактерий ингибируют синтез СЭА и СЭВ не одинаково. Образование СЭА подавляется в большей степени, чем образование СЭВ, при этом установлено, что наибольшей способностью ингибировать продукцию стафилококковых СЭА и СЭВ обладает штамм L. acidophilus 317/402.

Полученные результаты по ингибирующему действию L. acidophilus 317/402 на продукцию СЭА и СЭВ дают основание рекомендовать широко использовать этот штамм для коррекции дисбактериоза кишечника и снижения синтеза СЭ (при наличии в кишечнике энтеротоксигенных штаммов стафилококков). Нами было показано, что при добавлении в питательную среду молочнокислых бактерий и нативных дрожжей или дрожжей, подвергнутых термической обработке, происходил сдвиг рН в щелочную сторону. Только штамм L. acidophilus 317/402 сдвигал рН среды в кислую зону, что, по-видимому, может быть связано с образованием органических кислот, которые оказывают ингибирующее действие на рост стафилококков и продукцию СЭ.

Таким образом, показано, что молочнокислые бактерии обладают способностью снижать синтез стафилококками энтеротоксина типов А и В [11], причем наиболее эффективным ингибитором подавления образования СЭ и СЭ являлся штамм L. acidophilus 317/402. Показано также, что нативные и термически обработанные дрожжи способствуют увеличению синтеза СЭ типа В в 2 раза по сравнению с контролем. Также следует подчеркнуть, что у штаммов стафилококков, продуцирующих СЭА, при совместном культивировании с дрожжами P. anomala A1 (нативными и термообработанными), а также со взвесью термообработанных S. cerevisiae через 2 ч с момента культивирования происходит увеличение плазмокоагулазной активности. Другие виды нативных и термообработанных дрожжей такого значительного стимулирования плазмокогулазной активности не вызывают.

В заключение следует отметить, что полученные нами сведения о воздействии различных микроорганизмов и взвеси микробных клеток дрожжей на продукцию патогенных микроорганизмов могут иметь большое значение при создании биологически активных добавок к пище и препаратов, используемых для коррекции дисбактериоза кишечника.

Таблица 3. Показатели роста и функциональных свойств токсинообразующих S. aureus при совместном выращивании с термически обработанными дрожжами

Литература

1. Акатов А.К., Флуер Ф.С., Михеева Г.В. и др. ВФС 42-235, ВС 89, 1989.

2. Акатов А.К., Флуер Ф.С., Михеева Г.В. и др. ВФС 42-236, ВС 89, 1989.

3. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Мед. лит., 1962. - 115 с.

4. Белоусова Е.Л. // Леч. врач. - 2009. - № 5. - С. 78-79.

5. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. - Екатеринбург: Уро РАН, 2000. - 238 с.

6. Мюллер Г. Литц П., Мюнх Г.Д. Микробиология пищевых продуктов растительного происхождения: Пер. с нем. - М.: Пищ. пром-сть, 1977. - 343 с.

7. Флуер Ф.С. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 1. - С. 66-73.

8. Тутельян В.А., Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р. и др. Метод. указания. - М., 2008. - МУК 4.2.2429-08. - 56 с.

9. Bergdoll M.S. Enterotoxins // Staphylococci and Staphylococcal Infections / Eds C.S.F. Easmon, C. Adlam. - London: Academic Press, 1983. - Vol. 2. - Р. 560-598.

10. Domenech A., Hernandez F.J., Orden J.A. et al. // Z. Lebensm. Unters Forsch. - 1992. - Vol. 194, N 2. - P. 124-128.

11. Hamama A.E., Hanouri N.E., Ayadi M. // Int. J. Dairy J. - 2002. - N 12. - P. 933-938.

12. Loir Y.L., Baron F., Gautier M. // Genet. Mol. Res. - 2003. - Vol. 2, N 1. - P. 63-76.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»