Плоды лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.] - вьющейся листопадной лианы семейства лимонниковые (Schizandraceae) - являются богатым источником биологически активных веществ (БАВ). Наряду с использованием плодов лимонника (Fructus Schizandrae) в качестве лекарственного растительного сырья их также употребляют в пищу в виде соков, пюре, варенья, джемов и настоек. Сок лимонника применяют для винного букетирования. В качестве вкусоароматического ингредиента плоды лимонника добавляют в чай. Сушеные плоды и экстракты лимонника используют при производстве специализированных пищевых продуктов, в том числе для питания спортсменов.
В результате ряда фитохимических исследований из плодов лимонника были выделены и идентифицированы различные БАВ, такие как лигнаны, полисахариды, флавоноиды, в частности антоцианины, эфирные масла, органические кислоты, витамины [1]. Основной и наиболее характеристической группой БАВ для растений семейства лимонниковые являются лигнаны. В растениях рода лимонник присутствуют 5 классов лигнанов: дибензоциклооктадиеновые (тип А), спиробензофураноидные дибензоциклооктадиеновые (тип В), 4-арилтетралино-вые (тип С), 2,3-диметил-1,4-диарилбутановые (тип D) и 2,5-диарилтетрагидрофурановые (тип Е) [2]. Однако наибольшей биологической активностью обладают дибензоцикооктадиеновые лигнаны (рис. 1), которые в свою очередь могут подразделяться на 2 типа в зависимости от стереоструктуры: R- или S-бифенильной конфигурации. Кроме того, циклооктеновые кольца этих лигнанов представлены в виде конформаций твист-ванна-кресло или твист-ванна. Множество хиральных особенностей и стереоизомеров приводит к образованию очень сложных структур соединений данного типа.
Фармакологические исследования показали, что экстракты и настойки лимонника оказывают гепатопротекторное, антиоксидантное, нейропротекторное, неспецифическое общеукрепляющее (адаптогенное) действие, повышают остроту зрения, особенно ночного [1-3]. В случае использования плодов лимонника китайского значимый вклад в биологическую активность вносят антоцианины, наличие которых также является одним из критериев подлинности [4].
Цель данной работы - определение содержания и состава основных дибензоциклооктадиеновых лигнанов и антоцианинов плодов лимонника китайского.
Материал и методы
Изучено 10 образцов плодов лимонника китайского, произрастающих в Московской области и Дальневосточном регионе (табл. 1).
Профиль лигнанов и антоцианинов в лимоннике исследовали c использованием системы жидкостной хроматографии Agilent 1100 ("Agilent Technologies", США), оснащенной дегазатором, бинарным насосом, термостатом колонок, термостатируемым автосамплером, спектрофотометрическим диодно-матричным детектором (ДМД) и времяпролетным масс-селективным детектором Agilent 6210 LC/MS-TOF (ВЭЖХ-МС-TOF). Суммарное содержание антоцианинов определяли с помощью спектрофотометра Shimadzu 1800 ("Shimadzu", Япония) с диапазоном длин волн 190-1100 нм.
Для определения содержания и состава лигнанов была разработана оригинальная ВЭЖХ-методика с ДМД и МС. Условия ВЭЖХ: колонка ProteCol C18 НРН125 250x4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза: 0,1% раствор муравьиной кислоты (А), ацетонитрил (В); линейный градиент: 0 мин - 50% В, 50 мин - 95% В, 51-60 мин - 50% В; скорость потока растворителя 0,5 см3/мин, температура колонки 25 °С, температура автосамплера 20 °С, объем вводимой пробы 10 мм3; детектирование при λ=254 нм и λ=235 нм. Спектры снимали в диапазоне от 190 до 400 нм. Параметры масс-спектрометрии: напряжение на капилляре - 3,5 кВ, поток газа-осушителя (азот) - 9 дм3/мин, температура - 325 °С, давление на распылителе - 0,27 МПа, сканирование масс - в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне от 100 до 1500 m/z.
Подготовка проб: около 3,0 г измельченных замороженных плодов лимонника или около 1,0 г измельченных сушеных плодов лимонника помещали в круглодонную колбу объемом 100 см3, добавляли 80 см3 70% этанола и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. Затем обрабатывали на ультразвуковой (УЗ) бане Codyson CD-4820 ("Shenzhen Codyson Electrical Co., Ltd.", Китай) при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждали до комнатной температуры, перемещали в мерную колбу объемом 100 см3, доводили объем 70% этанолом. 1,5-2 см3 извлечения помещали в центрифужную пробирку и центрифугировали на центрифуге Eppendorf Centrifuge 5424 ("Eppendorf", Германия) при 15 000 об./мин в течение 10 мин.
Количественную оценку содержания лигнанов в плодах лимонника осуществляли методом внешнего стандарта.
Стандартный раствор схизандрина (схизандрол А, ≥98,0%, "ZHONGXIN INNOVA®", Китай) (0,98 мг/см3) готовили в метаноле, помещая на 3 мин в УЗ-баню. Рабочие растворы получали путем разбавления в 2, 10, 100 и 1000 раз. Все растворы хранили в холодильнике при температуре +4 °С.
Суммарное содержание мономерных антоцианинов определяли рН-дифференциальным методом, подготовку проб осуществляли по методике, описанной ранее [5]. Профиль антоцианинов определяли по разработанной нами ранее методике [6].
Результаты и обсуждение
Лигнаны
В исследованных образцах обнаружено более 20 индивидуальных лигнанов, среди которых выделяют 11 основных и наиболее характеристичных лигнанов (рис. 2), по содержанию которых фармакопейный вид лимонника Schizandra chinensis (Turcz.) Baill. (Bei-Wuweizi, северный лимонник) можно отличить от нефармакопейного вида Schizandra sphenanthera Rehd. et Wils. (Nan-Wuweizi, южный лимонник) [7, 8].
Типичные хроматограммы извлечения из плодов лимонника китайского изображены на рис. 3.
Номера пиков 11 основных лигнанов и ангелоилгомизина О на хроматограмме соответствуют их номерам в табл. 2 и на рис. 3.
Времена удерживания, УФ-максимумы и результаты масс-спектрометрического анализа 11 основных лигнанов лимонника представлены в табл. 2.
Были определены некоторые валидационные характеристики разработанной методики определения лигнанов.
Линейность. В подобранных хроматографических условиях были трижды введены рабочие растворы схизандрина в 5 концентрациях. Калибровочная кривая концентрации схизандрина (мг/см3) от площади пика (мА) имела линейный характер (у=23592х+42,195; RI=0,9999).
Правильность и прецизионность. Для оценки правильности и внутрилабораторной прецизионности методики были проанализированы стандартные растворы схизандрина с низкой (0,0098 мг/см3), средней (0,098 мг/см3) и высокой (0,490 мг/см3) концентрациями и рассчитано относительное стандартное отклонение (RSD). Правильность определяли по результатам 6 параллельных измерений рабочих растворов схизандрина. Среднее значение было использовано для расчета RSD. Промежуточная прецизионность определялась повторным анализом тех же растворов один раз в день в течение 5 дней.
Относительное стандартное отклонение повторяемости для низкой концентрации составило 0,53%, для средней - 0,33%, для высокой - 0,15%. Относительное стандартное отклонение промежуточной прецизионности для низкой концентрации было 0,51%, для средней - 0,30%, для высокой - 0,25%.
Результаты исследования содержания схизандрина представлены в табл. 3. Ошибка определения по результатам 3 параллельных исследований для всех лигнанов не превышала 7,2%.
В сушеных плодах лимонника (образцы № 2-10) преобладал схизандрин (25,7-37,2% от суммы лигнанов), количество которого варьировало от 3,59 до 6,22 мг/г (см. табл. 3). В свежезамороженных плодах лимонника в качестве основного лигнана был найден ангелоилгомизин О - 1,05 мг/г (24,7% от суммы лигнанов), а содержание схизандрина составило 0,99 мг/г (18,0% от суммы лигнанов). Во всех образцах, кроме № 2 и 3, обнаружено относительно высокое содержание схизандрина В (14,8-24,2% от суммы лигнанов) - 1,05-3,34 мг/г. Все образцы, за исключением образца № 2, отличаются достаточно высоким количеством гомизина А - от 0,39 мг/г в свежих плодах до 0,79-1,98 мг/г в сушеных (4,7-12,9% от суммы лигнанов). К другим мажорным лигнанам относятся схизандрин А, схизандрин С и ангелоилгомизин Н. Схизандрин А был найден в исследованных образцах в количестве 0,26-1,76 мг/г (4,7-9,3% от суммы лигнанов). Относительно высокое содержание схизандрина С отмечено в образцах № 3 и 8-10 -1,11-1,20 мг/г (6,8-8,6% от суммы лигнанов). Наиболее высоким содержанием ангелоилгомизина Н отличались образцы № 5-10 - 0,81-1,09 мг/г (4,6-6,8% от суммы лигнанов).
В умеренных количествах в образцах лимонника обнаружены γ-схизандрин, схизантерин В и гомизин J. В замороженных плодах выявлено 0,24 мг/г γ-схизанд-рина, в сушеных - 0,45-0,77 мг/г. Содержание схизантерина В варьировало от 0,18 мг/г в образце № 1 до 0,43-0,72 мг/г в образцах № 2-10. Количество гоми-зина J в образце № 1 составило 0,10 мг/г, в сушеных образцах - 0,24-0,55 мг/г.
Меньше других основных лигнанов в исследуемых образцах было схизантерина А и гомизина G - 0,05-0,24 и 0,14-0,30 мг/г соответственно.
Суммарное содержание лигнанов в свежих плодах составило 5,50 или 550 мг/100 г, в сушеных - 12,5018,95 мг/г.
Антоцианины
Впервые был определен профиль индивидуальных антоцианинов плодов лимонника китайского, произрастающих в Московской области, Хабаровском и Приморском краях. Типичная хроматограмма антоцианинов лимонника изображена на рис. 4. Результаты ВЭЖХ-ДМД-МС антоцианинов лимонника представлены в табл. 4.
Профиль антоцианинов в образцах лимонника отражен в табл. 5. Исследуемые образцы имели одинаковый профиль антоцианинов с выраженным преобладанием цианидин-3-ксилозилрутинозида (78,5-87,5% от общего содержания антоциановых пигментов) и в замороженных, и в сушеных плодах. Среди минорных антоцианинов идентифицированы 3-латирозид-5-глюкозиды, 3,5-диглю-козиды, 3-латирозид-5-ксилозиды, и 3-латирозиды цианидина, а также 3-рутинозиды цианидина и пеларгонидина.
Суммарное содержание антоцианинов в свежезамороженных плодах лимонника (образец № 1) составило 0,21 мг/г, что соответствует их содержанию в плодах лимонника китайского, заготовленного в Китае, -0,15-0,23 мг/г [9, 10], в высушенных плодах - от 0,35 до 0,72 мг/г.
Заключение
Полученные данные о количестве и профиле лигнанов и антоцианинов могут быть использованы при хемотаксономической идентификации и стандартизации плодов лимонника китайского, а также для оценки биологической ценности лимонника в качестве сырья для производства специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-36-00041).
Литература
1. Hwang D.Y. Chapter 20. Therapeutic effects of lignans and blend isolated from Schisandra chinesis on hepatic carcinoma // Recent Advances in Theories and Practice of Chinese Medicine / ed. H. Kuang. 2012. P. 389-402.
2. Panossian A., Wikman G. Pharmacology of Schisandra chinensis Bail.: an overview of Russian research and uses in medicine // J. Ethnopharmacol. 2008. Vol. 118. P. 183-212.
3. Szopa A., Ekiert R., Ekiert H. Current knowledge of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (Chinese magnolia vine) as a medicinal plant species: a review on the bioactive components, pharmacological properties, analytical and biotechnological studies // Phytochem. Rev. 2017. Vol. 16. P. 195-218.
4. Jo S.-H., Ha K.-S., Moon K.-S. et al. In vitro and in vivo anti-hyper-glycemic effects of omija (Schizandra chinensis) fruit // Int. J. Mol. Sci. 2011. Vol. 12. P. 1359-1370.
5. Перова И.Б., Жогова А.А., Черкашин А.В., Эллер К.И., Раменская Г.В., Самылина И.А. Биологически активные вещества плодов калины обыкновенной // Хим.-фарм. журн. 2014. Т. 48, № 5. С. 32-39.
6. Перова И.Б., Жогова А.А., Полякова А.В., Эллер К.И., Раменская Г.В., Самылина И.А. Биологически активные вещества кизила (Cornus mas L.) // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 86-93.
7. American Herbal Pharmacopoeia. Schisandra Berry, Shisandra Chinensis. Analytical, Quality Control, and Therapeutic Monograph / ed. R. Upton. Santa Crus, 1999. P. 1-23.
8. Lu Y., Chen D.-F. Analysis of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera // J. Chromatogr. A. 2009. Vol. 1216. P. 1980-1990.
9. Ma C., Yang L., Yang F. et al. Content and color stability of anthocyanins isolated from Schisandra chinensis fruit // Int. J. Mol. Sci. 2012. Vol. 13. P. 14 294-14 310.
10. Wu X., Yu X., Jing H. Optimization of phenolic antioxidant extraction from Wuweizi (Schisandra chinensis) pulp using random-centroid optimazation methodology // Int. J. Mol. Sci. 2011. Vol. 12. P. 6255-6266.