Влияние количества жира в рационе на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков и антиоксидантной защиты у крыс

РезюмеКрысы-самцы Вистар в течение 4 нед получали полусинтетические рационы с разным содержанием жира - безжировой, 5, 10 или 30% жира (подсолнечное масло + лярд, 1:1). Увеличение доли жира в рационе сопровождалось возрастанием этоксирезоруфиндеалкилазной активности CYP1A1, метоксирезоруфиндеалкилазной активности CYP1A2, пентоксирезоруфиндеалкилазной активности CYP2B1/2 и 6β-тестостеронгидроксилазной активности CYP3A. Активность ключевых ферментов II фазы метаболизма ксенобиотиков - UDP-глюкуронозилтрансферазы (UGT1А6), общая активность глутатионтрансферазы и активность антиоксидантных ферментов печени (каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, параоксоназы-1 и гемоксигеназы-1) также возрастала с увеличением количества жира в рационах.

Ключевые слова:низкожировой рацион, высокожировой рацион, ферменты метаболизма ксенобиотиков, антиоксидантные ферменты

Вопр. питания. - 2012. - № 1. - С. 24-29.

Можно считать доказанным, что одна из важных функций липидов - их участие в регуляции рецепторопосредованных сигнальных путей и экспрессии генов в различных тканях. Идентифицированы регулируемые жирными кислотами и их метаболитами транскрипционные факторы, такие как PPAR (рецептор активации пролиферации пероксисом) и HNR 4α (гепатоцитарный ядерный рецептор 4α), являющиеся основными регуляторами энергетического гомеостаза и метаболизма липидов. В ряде исследований обнаружено, что полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) через PPARα и HNR 4α могут участвовать также в регуляции активности ферментов метаболизма ксенобиотиков (ФМК) [8, 19, 28]. Показано, что PPARα может напрямую связыватся с PPAR-респонсивным элементом (PPRE) генамишени или действовать опосредованно, активируя другие транскрипционные факторы, контролирующие экспрессию ФМК [26, 28].

Как in vitro, так и в экспериментах на животных показано, что агонисты PPARα существенно усиливают экспрессию транскрипционных факторов CAR и PXR и контролируемых ими цитохромов Р450 - CYP2B1 и CYP 3A [29, 30]. К регулируемым PPARα генам относятся гены ряда изоформ ФМК II фазы - UDP-глюкуронозилтрансферазы (UGT) и сульфотрансферазы [8, 24]. Данные, полученные преимущественно in vitro, свидетельствуют о том, что HNR 4α может быть позитивным регулятором экспрессии отдельных изоформ цитохрома Р450, сульфотрансфераз и UGT [17, 19].

Особого внимания заслуживают единичные сообщения о возможном участии PPARα и PPARγ в регуляции экспрессии генов ферментов антиоксидантной защиты клетки (глутатионтрансферазы и гемоксигеназы-1) не только напрямую, но и через транскрипционный фактор Nrf2 [24, 27], который регулирует экспрессию большинства антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, γ-глутамилцистеинсинтетазы, супероксиддисмутазаы, хинонредуктазы, гемоксигеназы-1) и многих ФМК II фазы.

Следует отметить, что, несмотря на определенный прогресс в изучении механизмов участия липидов в регуляции активности ФМК и антиоксидантных ферментов, имеющийся фактический материал о связи между активностью этих ферментов и количеством жира в рационе нельзя назвать достаточным.

Целью настоящей работы было изучение влияния количества жира в рационе крыс на активность ФМК I и II фазы и антиоксидантных ферментов, имеющих общие пути регуляции.

Материал и методы

Исследования проводили на 4-х группах крыссамцов Вистар (по 8 животных в каждой), содержавшихся на полусинтетических рационах (табл. 1). Крысы 1-й группы получали безжировой (б/ж) рацион, содержание липидов в котором (1% по весу, 3% по калорийности) обеспечивалось за счет липидов казеина, крахмала и смеси жирорастворимых витаминов. Рацион крыс 2-й группы содержал 5% жира по весу (14% по калорийности), рацион 3-й группы включал стандартное1 количество жира - 10% по весу (26% по калорийности), а рацион крыс 4-й группы был высокожировым и содержал 30% жира по весу (56% по калорийности). Жировой компонент рационов животных 2-4-й групп был представлен лярдом и подсолнечным маслом в соотношении 1:1 (табл. 1). Корм крысы получали в режиме свободного доступа в количестве 25-30 г на крысу, что соответствовало 15 г сухой смеси.

Эксперимент длился 4 нед. Наблюдение за состоянием животных и поедаемостью корма проводили ежедневно, определение массы тела - еженедельно.

В микросомах, выделенных из печени, определяли активность ферментов I фазы метаболизма ксенобиотиков - этоксирезоруфиндеалкилазную (ЭРОД) активность - CYP1A1, метоксирезоруфиндеалкилазную (МРОД) активность - CYP1A2, пентоксирезоруфиндеалкилазную (ПРОД) активность - CYP2B1/2 и 6β-тестостеронгидроксилазную (6β-ТГ) активность - CYP3A [10, 22]. Кроме того, определяли активность ключевых ферментов II фазы: в микросомах - UDP-глюкуронозилтрансферазы с п-нитрофенилом в качестве субстрата - маркера UGT1А6 [9], в цитозоле - общую активность глутатионтрансферазы с субстратом 1-хлор2,4-динитробензолом [18].

Для оценки антиоксидантного статуса крыс в плазме крови определяли общую антиоксидантную активность (АОА) с использованием тестсистемы FRAP [5], активность параоксоназы-1 [4] и содержание малонового диальдегида (МДА) [21], а в печени - активность каталазы [2], глутатионпероксидазы [12], глутатионредуктазы [12], параоксоназы-1, гемоксигеназы-1 [20] и АОА фракции цитозоля. Для изучения влияния уровня жира в рационе на резистентность микросом к индуцированному NADPH-Fe2+ перекисному окислению липидов (ПОЛ) использовали микросомы, выделенные из печени животных 1-4-й групп.

Статистическую обработку результатов проводили методом однофакторного дисперсионного анали за ANOVA с помощью компьютерной программы Statgraphics. Различия считали значимыми при р<0,05.

Таблица 1. Состав рационов, в г

Результаты и обсуждение

Результаты, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что увеличение массы тела и суточных привесов крыс напрямую зависит от уровня жира в рационе. Так, конечная масса тела животных 2-4-й групп достоверно превышала массу тела крыс 1-й группы соответственно на 15, 15 и 20%, а суточные привесы - на 26, 26 и 35%. При этом между группами не обнаружено каких-либо существенных различий в относительной массе печени.

Увеличение доли жира в рационе сопровождалось возрастанием активности изученных ФМК (табл. 3). Активность ЭРОД практически не различалась у крыс 1-й и 2-й групп, была несколько выше у крыс 3-й группы и максимальной - у крыс 4-й группы. Активность МРОД у животных 2-4-й групп была выше, чем у крыс, находящихся на безжировом рационе, соответственно на 17, 65 и 50%, а активность ПРОД - на 10, 48 и 50%. Активность 6β-ТГ была практически одинаковой у крыс 2-й и 3-й групп, хотя превышала таковую в 1-й группе, а в 4-й группе определялась на максимальном уровне. Активность ФМК II фазы также находилась в прямой зависимости от количества жира в рационе. По сравнению с крысами, получавшими безжировой рацион (1-я группа), активность UDP-глюкуронозилтрансферазы у крыс 2-й и 3-й групп была выше соответственно на 55 и 50%, и в 4-й - более чем в 2 раза. Аналогично изменялась и активность глутатионтрансферазы, которая во 2-4-й группах была выше соответственно на 40, 42 и 86%, чем в 1-й.

Анализ результатов изучения антиоксидантного статуса крыс показал отсутствие у животных 4-й группы признаков выраженного окислительного стресса, характерного для длительного содержания крыс на высокожировом рационе. Как видно из данных, представленных в табл. 4, увеличение содержания жира в рационе до 30% приводило к умеренному (на 23%) росту уровня МДА в плазме крови (по сравнению с безжировым рационом) и не влияло на ее АОА. Изменение доли жира в рационе крыс не сказывалось на активности параоксоназы-1 в плазме крови.

Не обнаружено различий в АОА цитозоля печени крыс, получавших рационы с разным содержанием жира, в то время как активность всех изученных антиоксидантных ферментов возрастала с увеличением количества жира в рационе (табл. 5). Так, у крыс 2-й, 3-й и 4-й групп активность каталазы была выше, чем в 1-й группе соответственно на 31, 48 и 31%, активность глутатионпероксидазы - на 29, 26 и 42%, глутатионредуктазы - на 21, 26 и 26%, параоксоназы-1 - на 40, 42 и 86%. Активность гемоксигеназы-1 у животных 3-й и 4-й групп достоверно превышала ее активность у крыс 1-й и 2-й групп.

Определение скорости NADPH-Fe2+-индуцированного ПОЛ микросом, выделенных из печени крыс, показало достоверное увеличение чувствительности мембран микросом к ПОЛ с увеличением количества жира в рационе - соответственно в 1-4-й группе: 0,80; 2,57; 3,49 и 4,56 нмоль МДА/мг белка.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали прямую зависимость между активностью ФМК печени крыс и количеством жира в их рационе. В большинстве работ, в которых сравнивали влияние на ФМК высокожировых и безжировых рационов, отмечалось усиление метаболизма различных субстратов цитохромов Р450 при высоком содержании жира в рационе, а последующие исследования [1, 14, 15] показали, что содержание крыс на рационах с повышенным количеством жира приводит к возрастанию активности и усилению экспрессии мРНК и/или белка разных изоформ цитохрома Р450, в том числе - CYP1A1, CYP1A2, CYP2B1, CYP3A, а также глутатионтрансферазы и UDP-глюкуронозилтрансферазы, что подтверждают полученные нами результаты (см. табл. 3). Эти данные заслуживают особого внимания, что связано с функциональными особенностями этих изоформ цитохрома Р450. Установлено, что семейство CYP3A, на долю которого приходится 30-40% всех изоформ цитохрома Р-450 в печени, отвечает за метаболизм 50-60% лекарственных средств. Основные функции CYP 1A1 и 1A2 - биотрансформация и детоксикация ксенобиотиков, но в то же время они являются основными ферментами биоактивации различных канцерогенов.

Таблица 2. Масса тела и относительная масса печени крыс, получавших рационы с разным содержанием жира

Таблица 3. Активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени крыс, получавших рационы с разным содержанием жира

Таблица 4. Содержание малонового диальдегида, антиоксидантная активность и активность параоксоназы-1 в плазме крови крыс, получавших рационы с разным содержанием жира

Таблица 5. Антиоксидантная активность и активность антиоксидантных ферментов в печени крыс, получавших рационы с разным содержанием жира

Первоначально влияние пищевого жира на мембраносвязанные ФМК объясняли только изменением свойств (жидкостности) мембран и вследствие этого содержания ПНЖК и доступности субстратов. Например, показано, что каталитический центр UGT1A6 изоформы UDP-глюкуронозилтрансферазы расположен на внутренней стороне микросомального пузырька, за липофильным барьером, изменение структуры липидного бислоя может увеличить доступ субстрата и косубстрата [25]. Кроме того, определенную роль в изменении активности ФМК может играть и изменение жирнокислотного состава мембранных фосфолипидов, так как фосфолипидное окружение во многом определяет активность цитохромов Р450, а также кинетические свойства и аллостерическую регуляцию UDP-глюкуронозилтрансферазы [3, 6, 25]. Обнаруженное нами увеличение чувствительности мембран микросом печени крыс к индуцированному ПОЛ при повышении содержания жира в рационе косвенно свидетельствует об изменении структуры микросомальных мембран и возрастании в них субстрата ПОЛ - ПНЖК.

Следует отметить, что и витамин Е, количество которого в использованных нами рационах возрастало с увеличением содержания в них подсолнечного масла, способен существенно изменять жирнокислотный профиль отдельных фосфолипидов [6]. Заслуживают внимания данные о способности α-токоферола стимулировать в культуре клеток HepG2 экспрессию CYP3A4, у мышей - Cyp3a11 (гомолог CYP3A4 у человека и CYP3A1 у крыс) и глутатионтрансферазы, у крыс - CYP3A и CYP2B [7].

В то же время в последние годы получены доказательства прямого участия ПНЖК и их метаболитов через транскрипционные факторы PPAR и HNF4α в регуляции экспрессии генов ряда ФМК. PPAR-респонсивный элемент (PPRE) обнаружен в промоторе генов CYP1A1, ряда изоформ UDPглюкуронозилтрансферазы, в том числе UGT1A6 [28]. Сайты связывания HNF4α выявлены в промоторе гена CYP3A4 [17]. Кроме того, факторы PPAR и HNF4α способны активировать другие транскрипционные факторы - CAR и PXR, а также усиливать экспрессию CAR-зависимых генов CYP3A, CYP2B, отдельных изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы [29].

Обобщая вышеизложенное, можно заключить, что пищевой жир способен влиять на активность ФМК как за счет изменения состава и свойств мембран и увеличения доступа субстратов, так и за счет активации транскрипционных факторов PPAR и HNF4α, участвующих в регуляции экспрессии ФМК.

При длительном потреблении высокожировых рационов характерно развитие окислительного стресса в результате усиления образования АФК в процессе митохондриального и пероксисомального окисления жирных кислот, активации NADPHокидазы и усиления ПОЛ за счет увеличения биодоступности ПНЖК [16, 23]. Согласно имеющимся литературным данным, у животных с ожирением или длительно получавших выокожировой рацион резко усиливаются признаки окислительного стресса: многократно возрастает содержание МДА и продуктов окисления белка в плазме крови и внутренних органах, снижается активность ферментов антиоксидантной защиты [23, 31]. В наших исследованиях активность антиоксидантных ферментов в печени крыс возрастала с увеличением содержания жира в рационе (см. табл. 5), при этом не наблюдалось выраженных признаков окислительного стресса. Это позволяет предположить, что возрастание активности ферментов является адаптивным, индуцированным умеренным усилением образования активных форм кислорода. В пользу этого предположения свидетельствуют незначительное повышение уровня МДА в плазме крови и отсутствие изменений ее параоксоназной активности (см. табл. 4), а также интегральных показателей антиоксидантного статуса - АОА плазмы крови и печени.

Особое внимание привлекает к себе параоксоназа-1 - один из ключевых ферментов антиатерогенного действия [13]. Основная функция параоксоназы-1 - антиоксидантная защита. Она разрушает окисленные эфиры холестерина и окисленные фосфолипиды в составе липопротеинов и клеточных мембран. Параоксоназа-1 синтезируется в печени, где выявляется во фракции микросом, и циркулирует в кровотоке в связанном с липопротеидами высокой плотности (ЛПВП) виде. В связи с этим можно предположить, что отсутствие корреляции между активностью параоксоназы в плазме крови и в печени (см. табл. 4 и 5) связано с нарушением синтеза и секреции ЛПВП при увеличении содержания жира в рационе [11].

В заключение следует отметить, что модулирующее действие состава рациона на активность ФМК может существенно влиять на токсичность чужеродных веществ, на фармакокинетику и распределение в организме лекарственных средств, а также на эффективность различных биологически активных веществ - компонентов функциональных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище.

Литература

1. Герич О.Х., Пентюк О.О. // Укр. биохим. журн. - 2008. - № 1. - С. 73-82.

2. Aebi H. // Methods Enzymol. - 1984. - Vol. 105. - P. 121-126.

3. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P-450 and Active Oxygen. - Taylor Francis, 1990. - 339 р.

4. Beltowski J., Jamroz-Wisniewska A., Borkowska E., et al. // Pharmacol. Res. - 2005. - Vol. 51. - P. 5 2 3 - 5 3 2 .

5. Benzie I.F.F., Strain J.J. // Anal. Biochem. - 1996. - Vol. 239. - P. 7 0 - 7 6 .

6. Brand A., Bauer N.G., Hallott A. et al. // J. Neurochem. - 2010. - Vol. 113. - P. 465-476.

7. Brigelius-Flohе R. // Genes Nutr. - 2007. - Vol. 2. - P. 24 9 - 2 5 6 .

8. Buckley D.B., Klaassen C.D. // Drug Metab. Dispos. - 2009. - Vol. 37. - P. 847-856.

9. Burchell B., Weatherill P. // Methods Enzymol. - 1981. - Vol. 77. - P. 169-177.

10. Burke M.D., Mayer R.T. // Chem. Biol. Interact. - 1983. - Vol. 45. - Р. 243-258.

11. Burlamaqui I.M., Dozhlas C.A., Valensa J.T. et al. // - Arg. Gastoenterol. - 2011. - Vol. 48. - P. 153-158.

12. Cai Q., Wei H. // Nutr. Cancer. - 1996. - Vol. 25. - P. 1-7.

13. Camps J., Marsillach J., Joven J. // World J. Gastroenterol. - 2009. - Vol. 15. - P. 1929-1933.

14. Chen H.W., Tsai C.W., Yang J.J. et al. // Br. J. Nutr. - 2003. - Vol. 89. - P. 189-200.

15. Chen H.W., Yang J.J., Tsai C.W. et al. // J. Nutr. - 2001. - Vol. 131. - P. 1438-1443.

16. Cole M. A., Murray A. J., Cochlin L. E. et al. // Basic Res. Cardiol. - 2011. - Vol. 106. - P. 447-457.

17. Gonzalez F.J. // Drug Metab. Pharmacokinet. - 2008 - Vol. 33. - P. 2 - 7.

18. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249. - P. 7140-7150. 19. Jover R., Moya M., Gomez-Lechon M.J. // Curr. Drug Metab. - 2009 - Vol. 10. - P. 508-519.

20. McNally S.J., Ross J.A., Garden O.J. et al. // Anal. Biochem. - 2004. - Vol. 332. - P. 398-400.

21. Mihara M., Uchiyama M. // Anal. Biochem. - 1978. - Vol. 86. - P. 271-278.

22. Nakajima M., Nakamura S., Tokudome S. et al. // Drug Metab. Dispos. - 1999. - Vol. 27. - Р. 1381-1391.

23. Noeman S.A., Hamooda H.E., Baalash A.A. // Diabet. Metab. Synd. - 2011. - Vol. 3. - P. 17.

24. Park E.Y., Cho I.J., Kim S.G. // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64. - P. 3 7 0 1- 3 7 13 .

25. Radominska-Pandya A., Czernik P.J., Little J.M. // Drug Metab. Rev. - 1999. - Vol. 31. - P. 817-899.

26. Rakhshandehroo M., Knoch B., Muller M. et al. // PPAR Res. - 2010. - 61208927.

27. Reddy R.C., Standiford T.J. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2010. - Vol. 182. - P. 134-135.

28. Runge-Morris M., Kocarek T. // PPAR Res. - 2009. - 728941. - 14 p.

29. Saito K., Kobayashi K., Mizuno Y. et al. // Drug Metab. Pharmacokinet. - 2010. - Vol. 25. - P. 108-111.

30. Shaban Z., Soliman M., El-Shazly S. et al. // Xenobiotica. - 2005. - Vol. 35. - P. 51-68.

31. Son M.J., Rico C.W., Nam S.H. et al. // J. Clin. Biochem. Nutr. - 2010. - Vol. 46. - P. 150-156.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»