Методы контроля за пищевой продукцией нового вида, полученной из насекомых: протокол ПЦР-анализа для выявления и идентификации насекомых Hermetia Illucens на основе зонда и праймерной системы HEI-COI

Резюме

Разработка в опережающем режиме методов идентификации сырьевого состава пищевой продукции нового вида, полученной из съедобных насекомых, необходима для обеспечения контроля за ее оборотом в рамках выполнения требований действующего законодательства.

Цель исследования - разработка и апробация протокола моноплексного TaqMan-ПЦР-анализа (метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по технологии TaqMan) для обнаружения и идентификации таксон-специфичной ДНК насекомого Hermetia Illucens в составе продовольственного сырья и пищевой продукции.

Материал и методы. Исследования выполнены с использованием образцов, содержащих целевую последовательность ДНК (высушенные цельные личинки H. Illucens, а также H. Illucens в форме жмыха и порошкообразного содержимого капсулы), и заведомо не содержащих данную целевую последовательность ДНК (другие виды насекомых, млекопитающие, растения, микроорганизмы, а также многокомпонентные пищевые продукты: мясные, молочные и растительные). Экстракцию и очистку ДНК проводили CTAB-методами [коммерческие наборы "Сорб-ГМО-Б" (НПК Синтол, Россия) и DNeasy mericon Food Kit (QIAGEN, Германия)]. Для амплификации целевой последовательности - фрагмента митохондриального гена субъединицы I цитохром с-оксидазы - использовали праймеры и зонд: Hei-COI-F (CCTGAGCTGGTATAGTGGGAAC); Hei-COI-R (AATTTGGTCATCTCCAATTAAAGC); Hei-COI-P (FAM-CGAGCCGAATTAGGTCATCCAGG-BHQ-1). Оптимизацию условий ПЦР проводили на амплификаторах CFX96TM Real-Time PCR System (Bio-Rad, США) и Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) путем эмпирического подбора концентраций праймеров и зонда, температурно-временного режима амплификации. В рамках валидации метода оценивали специфичность, предел обнаружения.

Результаты и обсуждение. Оптимизированная реакционная смесь содержит 2,5-кратный ПЦР-буфер Б [KCl, ТрисHCl (pH 8,8), 6,25 мМ MgCl2], SynTaq ДНК-полимеразу, dNTP, глицерол, Tween 20, праймеры - по 550 нM, зонд - 100 нM. Температурно-временной профиль реакции: 95 °С - 180 с (95 °С - 15 с, 57 °С - 60 с), 40 циклов. Предел обнаружения метода составил 0,19 нг ДНК H. Illucens на реакцию. Специфичность праймерной системы и зонда экспериментально подтверждена в исследованиях с ДНК ряда других насекомых, а также животных, растений и микроорганизмов.

Заключение. Разработан протокол моноплексного ПЦР-анализа для выявления и идентификации Hermetia Illucens в продовольственном сырье и пищевой продукции. Валидность метода подтверждена лабораторными исследованиями, что позволяет рекомендовать его для использования в рамках надзора за обращением сырья, полученного из Hermetia Illucens.

Ключевые слова:молекулярно-генетические методы; контроль за пищевой продукцией нового вида; съедобные насекомые; Hermetia Illucens; митохондриальный ген субъединицы I цитохром с-оксидазы

Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена при финансировании Российского научного фонда (проект № 20-16-00083).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Садыкова Э.О., Тышко Н.В., сбор и обработка материала - Садыкова Э.О., Шестакова С.И., Требух М.Д., Никитин Н.С., статистическая обработка - Садыкова Э.О., написание текста - Садыкова Э.О., Тышко Н.В., редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.

Благодарности. Авторы искренне благодарят бакалавра Московского политехнического университета Рябинину У.О. и научного сотрудника лаборатории энзимологии питания ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" Трусова Н.В. за помощь, оказанную при выполнении исследований.

Для цитирования: Садыкова Э.О., Тышко Н.В., Никитин Н.С., Требух М.Д., Шестакова С.И. Методы контроля за пищевой продукцией нового вида, полученной из насекомых: протокол ПЦР-анализа для выявления и идентификации насекомых Hermetia Illucens на основе зонда и праймерной системы HEI-COI // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 1. С. 36-44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-36-44

Перспектива использования нетрадиционных источников продовольственного сырья, не имеющих длительной истории пищевого применения на территории РФ, определяет необходимость формирования системы комплексной оценки безопасности пищевой продукции нового вида, а также системы контроля за ее оборотом на продовольственном рынке [1, 2]. Многолетний мировой и отечественный опыт в области мониторинга за генно-инженерно-модифицированной пищевой продукцией доказал целесообразность использования метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в качестве основного при разработке системы контроля за пищевой продукцией нового вида, полученной с использованием насекомых. ПЦР-РВ по технологии TaqMan является надежным молекулярно-генетическим инструментом направленного поиска целевых последовательностей ДНК (ДНК-мишеней), его характеризуют высокая специфичность, чувствительность и воспроизводимость. TaqMan-ПЦР применима для анализа таких сложных матриц, как многокомпонентные технологически обработанные пищевые продукты, при условии наличия в образце единичных копий ДНК [3].

Технология TaqMan-ПЦР [4] основана на флюоресцентной детекции специфичных продуктов амплификации и предполагает использование при постановке реакции, помимо прямого и обратного праймеров, еще и флюоресцентно-меченого разрушаемого зонда, специфичного целевому участку ДНК, а также применения Taq-полимеразы, обладающей 5’-экзонуклеазной активностью. К 5’-концу зонда присоединен флюорофор, испускающий излучение, а к 3’-концу - гаситель флюоресценции, поглощающий испускаемое флюорофором излучение (рис. 1). При наличии ДНК-мишени в исследуемом образце происходит гибридизация зонда и ДНК-мишени с последующим разрушением зонда Taq-полимеразой. В результате пространственного разобщения флюорофора и гасителя, испускаемое флюорофором излучение уже не поглощается гасителем, таким образом, по мере накопления специфических продуктов ПЦР-РВ регистрируется усиление сигнала флюоресценции, свидетельствующее о присутствии ДНК-мишени.

Принимая во внимание необходимость обеспечения контроля за оборотом продукции нового вида, полученной из насекомых, и отсутствие валидированных ПЦР-методов ее выявления в продовольственном сырье, целью данного исследования были разработка и апробация протокола моноплексного TaqMan-ПЦР-анализа для обнаружения и идентификации таксон-специфичной ДНК насекомого Hermetia Illucens в составе пищевой продукции.

Материал и методы

Дизайн исследования включал подбор эффективного метода экстракции ДНК; подбор целевых последовательностей ДНК (ДНК-мишени), специфичных праймеров и зонда для выявления и идентификации ДНК H. Illucens; оптимизацию условий амплификации (концентрации праймеров и зонда; температурно-временного режима амплификации); валидацию метода (оценку специфичности, предела обнаружения).

Формирование выборки ДНК-матриц для постановки ПЦР в эксперименте по подбору эффективного метода экстракции ДНК H. Illucens предполагало включение образцов, подвергшихся технологической обработке, моделирующей деградацию ДНК-мишени: высушенных цельных личинок H. Illucens, а также измельченных - в форме жмыха и порошкообразного содержимого капсулы. При оптимизации условий амплификации использовали панель образцов ДНК H. Illucens, полученных путем серийного разведения (1:5, 1:25 и 1:125). Оценку специфичности праймерной системы и зонда выполняли с использованием образцов, содержащих целевую последовательность ДНК (положительный контрольный образец - H. Illucens) и не имеющих таковую (отрицательный контрольный образец - другие виды насекомых, млекопитающие, растения, микроорганизмы, а также многокомпонентные пищевые продукты: мясные, молочные и растительные). Для определения предела обнаружения метода применяли тестовые растворы ДНК, полученные путем серийного разведения (1:5, 1:25, 1:125, 1:625 и 1:3125) ДНК H. Illucens.

В рамках подбора метода экстракции проводили сравнительную оценку концентрации и качества ДНК H. Illucens, экстрагированной наборами для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов "Сорб-ГМО-Б" (НПК Синтол, Россия) и DNeasy mericon Food Kit (QIAGEN, Германия). ДНК выделяли в соответствии с инструкцией изготовителя. Концентрацию и качество ДНК определяли при помощи спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, США): оптическую плотность (А) измеряли при длинах волн 260 и 280 нм (максимум поглощения нуклеиновых кислот и большинства белков соответственно). Условно чистыми считали растворы ДНК, в которых соотношение A260/A280 составляло ~1,8-2,0.

На основании расширенного анализа литературы по таксон-специфичным ПЦР-методам оптимальной ДНК-мишенью для детекции и идентификации H. Illucens был признан фрагмент митохондриального гена субъединицы I цитохром с-оксидазы (cytochrome c oxidase subunit I gene, COI) [5-10]. Целевая последовательность была амплифицирована с использованием пары праймеров и зонда (табл. 1), описанных ранее в работе [7]. Праймеры и флюоресцентно-меченый зонд синтезированы НПК Синтол (Россия). В качестве флюорофора и гасителя флюоресценции зонда применена донорно-акцепторная пара FAM-BHQ1.

Для проведения ПЦР использовали реакционную смесь "ПЦР-микс" (кат. № М-428) (НПК Синтол, Россия), амплификацию проводили на приборах CFX96 (Bio-Rad, США) и Rotor Gene Q (QIAGEN, Германия). Продукты ПЦР анализировали путем их детекции в режиме реального времени. Обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения CFX ManagerTM Software, версия 1.6 и Rotor-Gene 6000, версия 1.8.17.5. Приемлемыми критериями эффективности амплификации принимали: угол наклона стандартной кривой (M) от -3,6 до -3,1; коэффициент корреляции (R2) ≥0,98. В качестве критериев сравнительной оценки результатов амплификации также использовали форму кривой флюоресценции и величину порогового цикла (threshold cycle, CT).

Результаты и обсуждение

Подходы к анализу видового состава пищевой продукции основаны на уникальности нуклеотидной последовательности ДНК, поэтому разработка метода ПЦР предполагает поиск оптимальной ДНК-мишени, специфичной для определенного вида организмов. Мишенью может быть участок генома, который достаточно консервативен, чтобы оставаться неизменным у всех представителей одного вида, и одновременно достаточно вариабелен, чтобы разные виды, даже близкие, отличались друг от друга. Перспективность использования гена COI в качестве таксон-специфической молекулярной мишени при идентификации насекомых показана рядом исследований [5, 11-14]. Праймерные системы-кандидаты и зонд для гена-мишени COI были подобраны на основании анализа публикаций [5-10] и проверены in silico с помощью сервиса National Center for Biotechnology Information (NCBI) - BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с целью оценки вероятности неспецифического связывания праймеров с неспецифической ДНК-матрицей и оценки рисков амплификации нецелевых продуктов ПЦР [15, 16]. По результатам BLAST-анализа оптимальной была признана пара праймеров и зонд Hei-COI, характеризующиеся сравнительно высокой степенью комплементарности к сайту-мишени и низкой степенью гомологии к другим нуклеотидным последовательностям (рис. 2).

Таким образом, подтверждена пригодность зонда и праймерной системы Hei-COI для амплификации ДНК H. Illucens, что позволяет использовать их для постановки таксон-специфичной ПЦР-РВ в рамках реализации задач исследования.

Подбор эффективного метода экстракции ДНК критически важен для достижения необходимой точности и воспроизводимости результатов ПЦР-РВ и должен обеспечивать выделение ДНК, пригодной для проведения анализа (матрица должна содержать достаточное количество ДНК, очищена от примесей и ингибиторов ПЦР) [17]. Методом выбора при исследовании сложных многокомпонентных образцов, таких как пищевые продукты, является метод экстракции ДНК с цетилтриметиламмония бромидом (cetyl trimethylammonium bromide, СТАВ-метод), в связи с чем специализированные наборы на основе СТАВ получили широкое распространение. В рамках данной работы был проведен сравнительный анализ качества растворов ДНК, выделенной с использованием СТАB-содержащих наборов "Сорб-ГМО-Б" (НПК Синтол, Россия) и DNeasy mericon Food Kit (QIAGEN, Германия) из высушенных цельных личинок H. Illucens, а также из жмыха и порошкообразного содержимого капсул.

Оба набора обеспечивали выделение достаточного количества ДНК (концентрация ДНК составляла более 70 нг/мкл), соотношение А260280 для каждого набора находилось в пределах 1,85-2,09 и соответствовало условным критериям чистой ДНК. Величины пороговых циклов ПЦР-РВ с ДНК, выделенной и тем и другим способом, свидетельствуют о сопоставимости и приемлемости полученных результатов (CT ~12).

Таким образом, оба набора позволяют получить пригодный для постановки ПЦР-РВ раствор ДНК и могут быть использованы на этапе пробоподготовки.

Условия амплификации целевой последовательности ДНК определяются целым рядом факторов, касающихся аналитических характеристик праймерных систем, зондов и реакционных смесей, а также технических характеристик используемого амплификатора и пр. Именно поэтому дальнейшая работа в рамках создания протокола ПЦР-анализа для обнаружения и идентификации ДНК H. Illucens сводилась к оптимизации условий амплификации, определяющих эффективность реакции (концентрации праймеров и зонда; температурно-временного режима амплификации).

Принимая во внимание, что чрезмерное повышение концентрации праймеров ведет к образованию неспецифических продуктов, снижение - к уменьшению накопления продуктов амплификации, а увеличение температуры отжига праймеров и зонда позволяет повысить специфичность реакции, оптимизацию концентраций прямого и обратного праймеров проводили, варьируя их соотношение в реакционной смеси в диапазоне от 550 до 650 нM с шагом 50 нM, концентрацию зонда - в диапазоне от 100 до 150 нM с шагом 25 нM. О протекании реакции судили по архитектуре кривой флюоресценции, эффективности реакции (E), углу наклона кривой (М) и коэффициенту корреляции (R2). При использовании прямого праймера/обратного праймера/зонда в концентрациях 550/550/100 нМ отмечены S-образная архитектура кривой флюоресценции, минимальная величина порогового цикла, эффективность реакции (E=91%), угол наклона кривой (М=-3,6), коэффициент корреляции (R2=0,99), соответствующие приемлемым параметрам реакции (табл. 2, рис. 3).

Подобранный эмпирическим путем состав реакционной смеси представлен в табл. 3.

Оптимальную температуру отжига праймеров и зондов подбирали методом градиентной ПЦР с температурой отжига в диапазоне 51-61 °C со ступенчатым повышением на 1 °C (рис. 4), остальные температурно-временные условия устанавливали согласно инструкции ПЦР-микса. Приемлемые параметры реакции [S-образная архитектура кривой флюоресценции, минимальная величина порогового цикла, эффективность реакции (E=97%), угол наклона кривой (М=-3,4), коэффициент корреляции (R2=0,99)] наблюдались при температуре отжига 57 °C (см. рис. 4). Подобранный эмпирическим путем температурно-временной режим амплификации представлен в табл. 4.

Обеспечение качества аналитических измерений возможно при условии применения валидированных методов с установленными метрологическими характеристиками, поэтому на завершающем этапе исследований была проведена оценка специфичности метода и предела его обнаружения.

Оценка специфичности праймеров и зонда методом ПЦР-РВ в отношении ряда нецелевых таксонов показала отсутствие перекрестных реакций с насекомыми (Tenebrio molitor, Locusta migratoria, Zophobas morio), животными (Sus scrofa, Gallus gallus, Salmo salar), растениями (Solanum tuberosum, Pisum sativum L.), микроорганизмами (L. casei и L. rhamnosus) и наличие специфической амплификации с H. Illucens (табл. 5). Результаты исследования образцов пищевых продуктов - мясных (колбасные изделия), молочных (йогурт, запеканка из творога) и растительных (хлебобулочные изделия) также свидетельствовали о достаточном уровне специфичности. Таким образом, подтверждена способность разработанного метода однозначно идентифицировать H. Illucens, что свидетельствует о его высокой специфичности.

Предел обнаружения оценивали методом ПЦР-РВ с использованием образцов ДНК, выделенной из H. Illucens, полученных методом 5-кратного серийного разведения в 4-кратной повторности (табл. 6).

Приемлемость полученных результатов оценивали по углу наклона кривой (M=-3,6) коэффициенту корреляции (R2=0,99), эффективности реакции E=94%). Предел обнаружения метода составил 0,19 нг ДНК H. Illucens на реакцию. Таким образом, разработанный метод обладает высокой чувствительностью, позволяя надежно выявлять и идентифицировать целевую ДНК в образцах с низкой концентрацией ДНК H. Illucens.

Заключение

В рамках разработки методов молекулярно-генетического анализа пищевой продукции нового вида, полученной из насекомых, подобраны оптимальные методы пробоподготовки, создан и апробирован протокол моноплексного TaqMan-ПЦР-анализа на базе зонда и праймерной системы Hei-COI для обнаружения и идентификации таксон-специфичной ДНК насекомого H. Illucens в составе продовольственного сырья и пищевой продукции. Разработанный таксон-специфичный метод характеризуется высокой аналитической надежностью. Специфичность экспериментально подтверждена в исследованиях с ДНК ряда насекомых, животных, растений и микроорганизмов. Предел обнаружения метода составил 0,19 нг ДНК H. Illucens на реакцию. Валидность метода подтверждена лабораторными исследованиями, что позволяет рекомендовать его для использования в рамках надзора за обращением сырья, полученного из H. Illucens.

Литература

1. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Никитин Н.С., Требух М.Д., Шестакова С.И., Пашорина В.А. и др. Комплексные исследования биологической ценности белка личинки Hermetia illucens // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 5. С. 49-58. DOI: 10.33029/0042-8833-2021-90-5-49-58

2. Садыкова Э.О., Шумакова А.А., Шестакова СИ., Тышко Н.В. Пищевая и биологическая ценность биомассы личинок Hermetia illucens // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 2. С. 73-82. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-2-73-82

3. Salihah N.T., Hossain M.M., Lubis H., Ahmed M.U. Trends and advances in food analysis by real-time polymerase chain reaction // J. Food Sci. Technol. 2016. Vol. 53, N 5. P. 2196-2209. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-016-2205-0

4. Bell S., Butler J. First-generation forensic DNA // Understanding Forensic DNA. Cambridge : Cambridge University Press, 2022. P. 35-49. DOI: https://doi.org/10.1017/9781009043311.005

5. Бастраков А.И., Ушакова Н.А. Свойства личинок мухи Hermetia illucens при искусственном разведении // Евразийский союз ученых. 2014. № 8. C. 105-107.

6. Hebert P.D., Ratnasingham S., De Waard J.R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergence, among closely related species // Proc. Biol. Sci. 2003. Vol. 270, suppl. 1. P. 96-99. DOI: https://doi.org/10.1098/rsbl.2003.0025

7. Zagon J., Rienzo V., Potkura J., Lampen A., Braeuning A. A real-time PCR method for the detection of black soldier fly (Hermetia illucens) in feedstuff // Food Control. 2018. Vol. 91. P. 440-448. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.04.032

8. Stahls G., Meier R., Sandrock C., Hauser M., Šašić Zorić L., Laiho E. et al. The puzzling mitochondrial phylogeography of the black soldier fly (Hermetia illucens), the commercially most important insect protein species // BMC Evol. Biol. 2020. Vol. 20, N 1. P. 60. DOI: https://doi.org/10.1186/s12862-020-01627-2

9. Khamis F.M., Ombura F.L., Akutse K.S., Subramanian S., Mohamed S.A., Fiaboe K.K.M. et al. Insights in the global genetics and gut microbiome of black soldier fly, Hermetia illucens: implications for animal feed safety control // Front. Microbiol. 2020. Vol. 11. P. 1538. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01538

10. Ferdousi L., Sultana N., Helal M.A. Momtaz N. Molecular identification and life cycle of Black Soldier fly (Hermetia illucens) in laboratory // Bangladesh J. Zool. 2021. Vol. 48, N 2. P. 429-440. DOI: https://doi.org/10.3329/bjz.v48i2.52381

11. Воронова Н.В., Буга С.В., Курченко В.П. Последовательность гена субъединицы I цитохромоксидазы с в молекулярной таксономии животных: принципы, результаты и проблемы использования // Труды Белорусского государственного университета. 2012. Т. 7, ч. 1-2. С. 22-42.

12. Daniso E., Melpignano P., Tulli F. An OLED-based genosensor for the detection of Hermetia illucens in feeds // Food Control. 2020. Vol. 113. Article ID 107179. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2020.107179

13. Garino C., Zagon J., Nesic K. Novel real-time PCR protocol for the detection of house cricket (Acheta domesticus) in feed // Anim. Feed Sci. Technol. 2021. Vol. 280. Article ID 115057. DOI: https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2021.115057

14. Garino C., Winter R., Broll H., Winkel M., Braeuning A., Reich F. et al. Development and validation of a novel real-time PCR protocol for the detection of buffalo worm (Alphitobius diaperinus) in food // Food Control. 2022. Vol. 140. Article ID 109138. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2022.109138

15. Чемерис Д.А., Кирьянова О.Ю., Губайдуллин И.М., Чемерис А.В. Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции (краткий обзор компьютерных программ и баз данных) // Биомика. 2016. Т. 8, № 3. С. 215-238.

16. Гарафутдинов Р.Р., Баймиев Ан.Х., Малеев Г.В. Алексеев Я.И., Зубов В.В., Чемерис Д.А. и др. Разнообразие праймеров для ПЦР и принципы их подбора // Биомика. 2019. Т. 11, № 1. С. 23-70. DOI: https://doi.org/10.31301/2221-6197.bmcs.2019-04

17. Петров Д.Г., Макарова Е.Д., Гермаш Н.Н., Антифеев И.Е. Методы выделения и очистки ДНК из лизатов клеток (обзор) // Научное приборостроение. 2019. Т. 29, № 4. С. 28-50. DOI: https://doi.org/10.18358/np-29-4-i2850

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»