Исследование биологической ценности in vivo концентрата белка амаранта и его модуля с белком куриного яйца

• Сидорова Юлия Сергеевна
• Петров Никита Александрович
• Колобанов Алексей Иванович
• Палеева Мария Александровна
• Зорин Сергей Николаевич
• Мазо Владимир Кимович

Резюме

Амарант (Amaranthus L.), как и другие псевдозерновые культуры [киноа (Chenopodium quinoa Willd.), чиа (Salvia hispanica L.) и гречиха (Fagopyrum sp.)], является перспективным источником пищевого белка. В зависимости от подвида и сорта содержание белка в зерне амаранта оценивается от 13,1 до 21,5%, а его аминокислотный скор варьирует в значительном интервале и может быть лимитирован.

Цель исследования - получение концентрата белка из зерна амаранта (Amaranthus L.) сорта "Воронежский", его обогащение белком куриного яйца, определение аминокислотного скора полученного белкового модуля, экспериментальная оценка in vivo его истинной усвояемости и биологической ценности.

Материал и методы. Концентрат белка амаранта получали из зерна по технологической схеме, включающей его ферментативную обработку, щелочную экстракцию, кислотное осаждение белков, микрофильтрацию и лиофилизацию. Определен аминокислотный состав и аминокислотный скор концентрата. Белковый модуль получен смешением концентрата белка амаранта и яичного белка в весовых соотношениях 58:42. Истинная усвояемость и биологическая ценность белкового модуля определена in vivo в эксперименте на 32 крысах-самцах линии Вистар, разделенных на 2 группы: 1-я (контрольная; n=16, масса тела - 118,7±3,1 г) и 2-я (основная; n=16, масса тела - 119,5±3,0 г). Животные 1-й и 2-й групп получали в качестве источника белка белок куриного яйца и белковый модуль соответственно. В течение 15 сут эксперимента определены индивидуальные показатели поедаемости корма и прироста массы тела каждого животного. С 14-х по 15-е сутки проводили учет поедаемости корма и сбор фекалий. Содержание азота в корме и в фекалиях определяли по методу Кьельдаля индивидуально для каждой крысы. На основе полученных данных определяли истинную усвояемость белка с учетом эндогенных потерь.

Результаты. Полученный концентрат белка амаранта содержал 70,4±0,6% белка, 17,0±1,0% жира, 9,8±0,8% углеводов, 1,8±0,2% золы; 1,4±0,1% составила его влажность. Не выявлено достоверных различий в потреблении корма и в приросте массы тела между животными обеих групп. Расчетное значение истинной усвояемости белка куриного яйца для 1-й (контрольной) группы составило 98,8±0,1%, белкового модуля для 2-й (основной) группы - 99,0±0,1%, различия между группами недостоверны.

Заключение. Результаты аминокислотного анализа и исследование in vivo истинной усвояемости белкового модуля (композиции белок амаранта/белок куриного яйца) свидетельствуют об отсутствии лимитирования относительно аминокислотной шкалы "идеального" белка (ФАО/ВОЗ, 2007) и высокой истинной усвояемости. Биологическая ценность белкового модуля, рассчитанная с использованием cкорректированного аминокислотного коэффициента усвояемости белка, составила 99,0±0,1%, что подтверждает перспективы его включения в составы специализированной пищевой продукции.

Ключевые слова:амарант; концентрат белка; белковый модуль; аминокислотный скор; истинная усвояемость; биологическая ценность

Амарант (Amaranthus L.), как и другие псевдозерновые культуры [киноа (Chenopodium quinoa Willd.), чиа (Salvia hispanica L.) и гречиха (Fagopyrum sp.)], является перспективным источником пищевого белка [1, 2]. Растение высокоустойчиво к экологическим стрессам, быстро адаптируется к среде обитания и различным климатическим условиям [3-5]. В съедобной части зерна амаранта содержание углеводов, белков и жиров более чем в 2 раза выше, чем в пшенице, и, соответственно, значительно выше его удельная энергетическая ценность [6]. В зависимости от подвидов и сортов амаранта содержание белка в его зерне оценивается от 13,1 до 21,5%, а аминокислотный скор (определяемый соотношением незаменимых аминокислот) может варьировать в значительном интервале [7]. Методы экстракции белков из обезжиренной муки псевдозерновых культур основаны на их солюбилизации разбавленной щелочью с последующим изоэлектрическим осаждением разбавленной кислотой [8]. Как отмечалось нами ранее [9], белки амаранта, лимитированные по содержанию определенных эссенциальных аминокислот, можно эффективно взаимообогащать другим белком, комплементарным по аминокислотному составу. Корректная оценка биологической ценности индивидуального белка или белковой композиции, согласно рекомендациям Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций/Всемирной организации здравоохранения (ФАО/ВОЗ), предполагает количественное определение их истинной усвояемости in vivo с использованием при расчете так называемого cкорректированного аминокислотного коэффициента усвояемости белка (the protein digestibility-corrected amino acid score, PDCAAS), равного аминокислотному скору, умноженному на истинную усвояемость.

Широко ведутся разработки специализированных пищевых продуктов с добавлением в традиционную рецептуру муки амаранта, концентратов или гидролизатов белка амаранта с заявляемыми гипотензивными свойствами (печенье, макароны) [10, 11]. Важная отличительная особенность белка амаранта - отсутствие глютена, что позволяет использовать его в составе продуктов для питания лиц, страдающих целиакией. Соответственно, в последнее десятилетие активно развиваются технологии безглютеновых продуктов на основе амарантовой муки [12]. Ассортимент в основном представлен макаронными изделиями (вермишель, спагетти и др.) [13-16], продуктами хлебопекарного производства (хлеб [17], печенье [18, 19]) и снеками [20, 21]. Макаронные изделия получают с включением в состав 10-30% амарантовой муки [13-16].

В Российской Федерации ассортимент диетических продуктов на основе зерна амаранта практически отсутствует и ограничивается амарантовой мукой. Более того, при разработке и позиционировании специализированной пищевой продукции, содержащей в своем составе муку зерна амаранта, в подавляющем большинстве нет экспериментального обоснования ее целевого назначения, соответствующего современным требованиям доказательной медицины.

Цель данного исследования - получить концентрат белка зерна амаранта, обогатить его белком куриного яйца, определить аминокислотный скор полученного белкового модуля, экспериментально оценить in vivo его истинную усвояемость и биологическую ценность.

Материал и методы

Для получения белкового концентрата из зерна амаранта (Amaranthus L.) сорта "Воронежский" (предварительно размолотого и просеянного через сито 0,355 мм) предложена и реализована технологическая схема переработки зерна, включающая его ферментативную обработку, щелочную экстракцию, кислотное осаждение белков, микрофильтрацию в тангенциальном потоке и лиофилизацию [22]. Для ферментативной обработки зерна, проводимой в течение 2 ч при постоянном перемешивании, использовали смесь 2 ферментных препаратов: 1,2 г целловиридина Г20Х (активность 3000 ед/г) и 1,2 мл прозима 4G (активность 15 000 ед/см³) из расчета на 1 кг размолотого зерна.

Содержание белка определяли методом Кьельдаля согласно ГОСТ 26889-86 "Продукты пищевые и вкусовые. Общие указания по определению содержания азота методом Кьельдаля" (коэффициент пересчета 6,25), содержание золы определяли согласно ГОСТ 15113.8-77 "Концентраты пищевые. Методы определения золы". Для определения содержания жира проводили его экстракцию следующим образом: к навеске массой 2-3 г тщательно гомогенизированного образца, помещенной во флакон объемом 50 см³, приливали 30 см³ смеси хлороформ/метанол (2:1 по объему) (оба квалификации ХЧ). Флаконы закрывали и взбалтывали в течение 1,5 ч на орбитальном шейкере (Biosan OS-10, Латвия). Затем приливали 10 см³ воды, очищенной в системе MilliQ, перемешивали и центрифугировали 5 мин при 1800 g. Хлороформный слой отбирали в предварительно взвешенные круглодонные колбы. К пробам снова приливали 20 см³ хлороформа, перемешивали, центрифугировали и отбирали в те же колбы. Объединенные экстракты упаривали на вакуумном ротационном испарителе (Heidolph Hei-Vap Advantage, Германия) при 75 об/мин, 50 °С. Липофильную фракцию сушили 5-10 мин при 80 °С (сушильный шкаф Binder FED 53, Германия) и охлаждали до комнатной температуры, а затем взвешивали. Влажность образцов определяли с помощью анализатора влажности Mettler Toledo MJ33 (Mettler Toledo, США). Содержание углеводов определяли по разности от общего состава.

Аминокислотный состав полученного концентрата белка из зерна амаранта определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе (Hitachi, Япония). Подготовку образцов проводили по методу Мура и Стейна [23]. Обезвоженный ацетоном и обезжиренный серным эфиром материал гидролизовали 6 н раствором HCl (24 ч, 105 °С). Гидролизат упаривали на водяной бане до сухого остатка и растворяли в 0,02 н HCl. Для количественного определения триптофана использовали метод щелочного гидролиза с последующим проведением цветной реакции с п-диметиламинобензальдегидом и измерением развивающейся окраски на спектрофотометре при 610 нм.

Коррекцию аминокислотного состава полученного концентрата белка амаранта проводили путем его обогащения белком куриного яйца исходя из выявления лимитирующей аминокислоты при анализе аминокислотного состава. Белковый модуль был получен методом сухого смешивания концентрата белка амаранта и яичного белка в соотношениях по массе 58:42.

Истинную усвояемость и биологическую ценность белкового модуля определяли in vivo. Эксперимент проводили на 32 растущих крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 80±5 г, полученных из питомника лабораторных животных филиал "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Исследования на животных выполнены в соответствии с требованиями, изложенными в ГОСТ 33647-2015 "Принципы надлежащей лабораторной практики" и ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами" и одобрены Локальным этическим комитетом ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (протокол № 11 от 15.12.2021). В течение 7 сут карантина осуществляли ежедневный осмотр внешнего состояния животных. В эксперимент были взяты животные без внешних признаков отклонений здоровья. Животных рандомизированно распределяли по группам: 1-я (контрольная; n=16, масса тела - 118,7±3,1 г) и 2-я (основная; n=16, масса тела - 119,5±3,0 г). Животных содержали по 1 особи в клетках из поликарбоната при 12/12-часовом режиме освещенности и температуре 20-24 °С. Животные обеих групп получали полноценный изокалорийный (377±3 ккал/100 г сухого корма) и изоазотистый (20±2% белка по калорийности) полусинтетический рацион. В рационе животных 1-й (контрольной) группы в качестве источника белка использовали белок куриного яйца. В рационе крыс 2-й (опытной) группы яичный белок был полностью заменен на белковый модуль. Составы рационов, минеральной и витаминной смесей представлены в табл. 1.

Воду и корм животные получали ad libitum. Через 1 сут на протяжении всего эксперимента контролировали потребление корма (с учетом его влажности), 2 раза в неделю производили взвешивание животных. С 14-х по 15-е сутки, в так называемый обменный период, крыс помещали в обменные клетки и, помимо перечисленных показателей, по методу Кьельдаля определяли количество азота в корме и фекалиях, предварительно высушенных на воздухе. На 15-е сутки животных выводили из эксперимента.

Метод расчета истинной усвояемости (true digestibility, D_tr) основан на определении доли истинно абсорбированного в желудочно-кишечном тракте крысы азота (A_tr), выраженной в процентах от азота, потребленного животным с пищей (I). Количество азота, выделяемого с калом в течение 1 сут крысой, находящейся на безбелковом рационе, принимали равным 0,023 г [25].

Истинную усвояемость белка рассчитывали индивидуально для каждой крысы по формуле:

где D_tr - истинная усвояемость (в %); I - общее количество азота, потребленного крысой с пищей в течение "балансового" периода (в граммах) в сутки; F - количество азота, экскретированного с калом крысой в течение "балансового" периода (в граммах) в сутки; F_k - количество экскретированного азота с калом (в граммах) крысой сходной массы тела, получавшей безбелковый рацион (эндогенные потери азота с калом) в сутки; A_tr - истинное количество азота, абсорбированного в желудочно-кишечном тракте крысы в течение "балансового" периода (в граммах) в сутки.

Скорректированный аминокислотный скор с учетом усвояемости белка (PDCAAS), равный аминокислотному скору исследуемого белка относительно шкалы ФАО/ВОЗ, умноженному на истинную усвояемость, рассчитывали по формуле:

где D_tr - истинная усвояемость (в %); АС - аминокислотный скор (в %).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20 (IBM, США). Вычисляли среднее значение (М) и стандартную ошибку среднего (m), данные представлены как M±m. Анализ различий между группами выполняли с использованием t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна-Уитни. При уровне значимости p<0,05 различия считали статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Полученный концентрат белка амаранта содержал 70,4±0,6% белка, 17,0±1,0% жира, 9,8±0,8% углеводов, 1,8±0,2% золы, 1,4±0,1% составила его влажность.

Анализ аминокислотного состава полученного концентрата белка амаранта (табл. 2) свидетельствует о том, что первой лимитирующей аминокислотой является лизин. Соответствующая коррекция аминокислотного состава была осуществлена путем обогащения концентрата белка амаранта белком куриного яйца. Наименьшее процентное отношение добавленного яичного белка к концентрату белка амаранта, при котором достигается аминокислотный скор белкового модуля, равный 1,0, составило 42% от массы всей смеси. Сравнительная характеристика аминокислотного скора концентрата белка амаранта, яичного белка и полученного белкового модуля представлена в табл. 2.

Содержание белка, определенное методом Кьельдаля, в рационе с яичным белком составило 21,4%, в рационе с белковым модулем - 22,2%.

Средняя величина поедаемости корма для 1-й группы в экспериментальный период составила 17,1±0,7 г/сут на крысу, для 2-й группы - 18,6±0,7 г/сут на крысу. Не выявлено достоверных различий в потреблении корма и приросте массы тела (см. рисунок) между животными обеих групп (p≥0,05).

В табл. 3 приведены цифровые показатели азотистого баланса, полученные в обменном периоде эксперимента, и значения истинной усвояемости.

В обменный период (т.е. в течение 1 сут) потребление животными основной группы корма, соответственно, и белка было статистически значимо выше по сравнению с потреблением корма и белка животными контрольной группы. Следует отметить, что предельно высокая истинная усвояемость яичного белка достоверно не снизилась при его практически 50% замещении белком амаранта, что подтверждает высокую эффективность использованного в работе методического подхода с целью получения белкового модуля высокой биологической ценности.

Заключение

Результаты аминокислотного анализа и исследования in vivo белкового модуля (композиции белок амаранта/белок куриного яйца) свидетельствуют об отсутствии его лимитирования относительно аминокислотной шкалы "идеального" белка (ФАО/ВОЗ, 2007 г.) и о высокой истинной усвояемости. Биологическая ценность белкового модуля, рассчитанная с использованием PDCAAS, составляет 99,0±0,1%, что подтверждает перспективы его включения в составы специализированной пищевой продукции.

Литература

1. Batista A.P., Portugal C.A., Sousa I., Crespo J.G., Raymundo A. Accessing gelling ability of vegetable proteins using rheological and fluorescence techniques // Int. J. Biol. Macromol. 2005. Vol. 36, N 3. P. 135-143. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2005.04.003

2. Zhu F. Amaranth proteins and peptides: biological properties and food uses // Food Res. Int. 2023. Vol. 164. Article ID 112405. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodres.2022.112405

3. Joshi D.C., Sood S., Hosahatti R., Kant L., Pattanayak A., Kumar A. et al. From zero to hero: the past, present and future of grain amaranth breeding // Theor. Appl. Genet. 2018. Vol. 131, N 9. P. 1807-1823. DOI: https://doi.org/10.1007/s00122-018-3138-y

4. Joshi D.C., Chaudhari G.V., Sood S., Kant L., Pattanayak A., Zhang K. et al. Revisiting the versatile buckwheat: reinvigorating genetic gains through integrated breeding and genomics approach // Planta. 2019. Vol. 250, N 3. P. 783-801. DOI: https://doi.org/10.1007/s00425-018-03080-4

5. Baraniak J., Kania-Dobrowolska M. The dual nature of amaranth-functional food and potential medicine // Foods. 2022. Vol. 11, N 4. P. 618. DOI: https://doi.org/10.3390/foods11040618

6. Tang Y., Tsao R. Phytochemicals in quinoa and amaranth grains and their antioxidant, anti-inflammatory, and potential health beneficial effects: a review // Mol. Nutr. Food Res. 2017. Vol. 61, N 7. Article ID 1600767. DOI: https://doi.org/10.1002/mnfr.201600767

7. Day L. Proteins from land plants - potential resources for human nutrition and food security // Trends Food Sci. Technol. 2013. Vol. 32, N 1. P. 25-42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2013.05.005

8. Rodrigues I.M., Coelho J.F., Carvalho M.G.V. Isolation and valorisation of vegetable proteins from oilseed plants: methods, limitations and potential // J. Food Eng. 2012. Vol. 109, N 3. P. 337-346. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2011.10.027

9. Сидорова Ю.С., Бирюлина Н.А., Зилова И.С., Мазо В.К. Белки зерна амаранта: перспективы использования в специализированной пищевой продукции // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 3. С. 96-106. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-3-96-106

10. Sabbione A.C., Suárez S., Añón M.C., Scilingo A. Amaranth functional cookies exert potential antithrombotic and antihypertensive activities // Int. J. Food Sci. Technol. 2019. Vol. 54. P. 1506-1513. DOI: https://doi.org/10.1111/ijfs.13930

11. Valdez-Meza E.E., Raymundo A., Figueroa-Salcido O.G., Ramírez-Torres G.I., Fradinho P., Oliveira S. et al. Pasta enrichment with an amaranth hydrolysate affects the overall acceptability while maintaining antihypertensive properties // Foods. 2019. Vol. 8, N 8. P. 282. DOI: https://doi.org/10.3390/foods8080282

12. Azizi S., Azizi M.H. Evaluation of producing gluten-free bread by utilizing amaranth and lipase and protease enzymes // J. Food Sci. Technol. 2023. Vol. 60, N 8. P. 2213-2222. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-023-05748-6

13. Fiorda F.A., Soares Júnior M.S., da Silva F.A., Souto L.R.F., Grosmann M.V.E. Amaranth flour, cassava starch and cassava bagasse in the production of gluten-free pasta: technological and sensory aspects // Int. J. Food Sci. Technol. 2013. Vol. 48. P. 1977-1984. DOI: https://doi.org/10.1111/ijfs.12179-Q1

14. Bastos G.M., Soares Júnior M.S., Caliari M., de Araujo Pereira A.L., de Morais C.C., Campos M.R.H. Physical and sensory quality of gluten-free spaghetti processed from amaranth flour and potato pulp // LWT Food Sci. Technol. (Lebensmittel-Wissenschaft-Technol.). 2016. Vol. 65. P. 128-136. DOI: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2015.07.067

15. Makdoud S., Rosentrater K.A. Development and testing of gluten-free pasta based on rice, quinoa and amaranth flours // J. Food Res. 2017. Vol. 6, N 4. P. 91-110. DOI: https://doi.org/10.5539/jfr.v6n4p91

16. Lux Née Bantleon T., Spillmann F., Reimold F., Erdös A., Lochny A., Flöter E. Physical quality of gluten-free doughs and fresh pasta made of amaranth // Food Sci. Nutr. 2023. Vol. 11, N 6. P. 3213-3223. DOI: https://doi.org/10.1002/fsn3.3301

17. Calderón de la Barca A.M., Mercado-Gómez L.E., Heredia-Sanoval N.G., Luna-Alcocer V., Porras Loaiza P.M.A., González-Ríos H. et al. Highly nutritional bread with partial replacement of wheat by amaranth and orange sweet potato // Foods. 2022. Vol. 11, N 10. P. 1473. DOI: https://doi.org/10.3390/foods11101473

18. Avila-Nava A., Alarcón-Telésforo S.L., Talamantes-Gómez J.M., Corona L., Gutiérrez-Solis A.L., Lugo R. et al. Development of a functional cookie formulated with chaya (Cnidoscolus aconitifolius (Mill.) (I.M. Johnst) and amaranth (Amaranthus cruentus) // Molecules. 2022. Vol. 27, N 21. P. 7397. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules27217397

19. Estivi L., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Brandolini A., Hidalgo A. Antioxidants of Amaranth, quinoa and buckwheat wholemeals and heat-damage development in pseudocereal-enriched einkorn water biscuits // Molecules. 2022. Vol. 27, N 21. P. 7541. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules27217541

20. Singh A., Kumari A., Chauhan A.K. Formulation and evaluation of novel functional snack bar with amaranth, rolled oat, and unripened banana peel powder // J. Food Sci. Technol. 2022. Vol. 59, N 9. P. 3511-3521. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-021-05344-6

21. Domínguez-Hernández E., Gutiérrez-Uribe J.A., Domínguez-Hernández M.E., Loarca-Piña G.F., Gaytán-Martínez M. In search of better snacks: ohmic-heating nixtamalized flour and amaranth addition increase the nutraceutical and nutritional potential of vegetable-enriched tortilla chips // J. Sci. Food Agric. 2023. Vol. 103, N 6. P. 2773-2785. DOI: https://doi.org/10.1002/jsfa.12424

22. Sidorova Y.S., Petrov N.A., Perova I.B., Kolobanov A.I., Zorin S.N. Physical and chemical characterization and bioavailability evaluation in vivo of amaranth protein concentrate // Foods. 2023. Vol. 12, N 8. P. 1728. DOI: https://doi.org/10.3390/foods12081728

23. Rutherfurd S.M., Gilani G.S. Amino acid analysis // Curr. Protoc. Protein Sci. 2009. Chap. 11. P. 11.9.1-11.9.37. DOI: https://doi.org/10.1002/0471140864.ps1109s58

24. Reeves P.G. Components of the AIN-93 diets as improvements in the AIN-76A diet // J. Nutr. 1997. Vol. 127, N 5. Suppl. P. 838S-841S. DOI: https://doi.org/10.1093/jn/127.5.838S

25. Высоцкий В.Г., Мамаева Е.М. К оценке эндогенных потерь азота у белых крыс различного возраста // Вопросы питания. 1979. № 3. С. 48-53.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)