Сравнительная характеристика интенсивности окислительной модификации белков молочных смесей, предназначенных для детского питания

• Высокогорский Валерий Евгеньевич
• Розенфельд Юлия Геннадьевна
• Стрельчик Наталья Валерьевна
• Подольникова Юлия Александровна

Резюме

При производстве адаптированных молочных смесей, предназначенных для детского питания, в основном используется коровье молоко. Однако его белковый состав значительно отличается от протеома грудного молока. Помимо того, различные технологические факторы существенно влияют на свойства и структуру белков, на подверженность окислительным процессам. В данной статье использован способ комплексной оценки продуктов окислительной модификации белков для характеристики общего уровня карбонильных соединений с анализом соотношения альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ), что повышает возможность определения степени выраженности повреждений белков.

Цель исследования - сравнить уровень показателей окислительной модификации белков адаптированных молочных смесей, предназначенных для детского питания.

Материал и методы. Материалом исследования служили 4 смеси молочные сухие адаптированные, а также ультрапастеризованное коровье молоко. Интенсивность окислительной модификации белков молока определяли спектрофотометрически по реакции карбонильных соединений с динитрофенилгидразином (ДНФГ).

Результаты. При спонтанном окислении в детских молочных смесях общая площадь карбонильных производных белков (S_омб) увеличена по сравнению с показателями ультрапастеризованного коровьего молока. При этом наибольшее изменение произошло в отношении показателей АДНФГ (S_АДНФГ), уровень которых в 3 смесях увеличился на 48,6-59,4%. Содержание кетоновых производных (S_КДНФГ) не отличалось существенно в исследуемых молочных смесях от показателей молока. Уровень карбонильных производных белков молочных смесей, предназначенных для детского питания, еще в большей степени повышен при индукции окисления добавлением в инкубационную среду ионов железа и пероксида водорода. Содержание как общих, так и различных фракций карбонильных соединений превосходило соответствующие показатели коровьего молока в 2,0-2,6 раза.

Заключение. Результаты исследования свидетельствуют о большей подверженности окислительным повреждениям белков адаптированных молочных смесей, предназначенных для детского питания, по сравнению с коровьим молоком.

Ключевые слова:окислительная модификация белков; карбонильные соединения; спонтанное окисление; металл-катализируемое окисление; детские молочные смеси

Белки - важнейшие макронутриенты грудного молока, они не только служат источником эссенциальных аминокислот, но и выполняют широкий комплекс физиологических функций. В женском молоке содержится около 300 различных белков, но общее содержание белка значительно меньше, чем в коровьем молоке, и ни один белок женского молока не идентичен белкам коровьего молока [1]. Следует отметить, что 18 белков грудного молока идентичны протеинам сыворотки крови и в отличие от коровьего молока большую часть зрелого женского молока составляют сывороточные белки, а не казеины. По сравнению с белками коровьего молока казеины грудного молока имеют меньшую молекулярную массу, а это способствует их лучшему расщеплению и усвоению в желудочно-кишечном тракте.

Поскольку женское грудное молоко значительно отличается от молока остальных млекопитающих, включая коров и коз, при производстве молочные смеси для питания детей раннего возраста обогащают иммуноглобулинами, лактоферрином, лактопероксидазой и другими противовоспалительными белками [2]. Тем не менее содержание биоактивных белков в молочных смесях для питания детей раннего возраста меньше в сравнении с грудным молоком, что может быть обусловлено денатурацией белка и образованием агрегатов в результате необходимой термической обработки [3]. При повышенной температуре становится доступной свободная сульфгидрильная группа β-лактоглобулина, которая связывается с казеинами и образуется дисульфидный комплекс. Образование сложных белковых агрегатов происходит не только за счет дисульфидных связей, но и путем гидрофобных взаимодействий. Эти агрегаты включают сывороточный альбумин, лактоферрин и лактопероксидазу. Термическая обработка вызывает неферментативную реакцию Майяра (лактозилирования), ковалентные и нековалентные взаимодействия, дезаминирование и окисление [2, 4, 5].

В качестве общих маркеров окислительных повреждений белков в клетках, тканях, а также в пищевых продуктах общепризнан уровень карбонильных производных белков [6, 7]. В зависимости от механизма их происхождения выделяют 2 типа: первичные карбонилы, образующиеся в результате непосредственного окислительного повреждения структуры белка активными формами кислорода, и вторичные карбонилы, которые образуются после окисления непредельных жирных кислот и включаются в белки посредством ковалентных связей [8, 9]. Применение современных масс-спектрометрических методов позволило подтвердить важную роль в образовании карбонильных производных белков реакции Майяра и гликирования [10-12]. При нагревании лактоза взаимодействует с аминогруппами, что приводит к образованию лактулозиллизина ("заблокированного лизина") и уменьшению уровня свободных остатков лизина, одной из незаменимых аминокислот, что снижает биологическую ценность молока.

В последнее время считается, что наличие в продукте редуцирующих углеводов (лактозы) играет в образовании карбонилов белков не менее важную роль, чем окисление с участием активных форм кислорода [11, 13, 14]. Подтверждены значительные химические нарушения структуры α-лактальбумина, обусловленные реакционноспособными дикарбонилами [15]. Роль углеводного компонента в образовании карбонильных производных белков особенно актуальна в производстве молочных смесей, предназначенных для детского питания, так как в них повышена концентрация лактозы. В то же время функции гликированных молочных белков изменены и нарушена их усвояемость [14].

Для определения общего количества карбонильных производных белков биологического материала, включая пищевые системы (мясные, молочные продукты), широко применяется спектрофотометрический метод с использованием 2,4-динитрофенилгидразина [16-18]. С помощью этого метода определено содержание карбонильных производных белков молочных продуктов: молока, йогурта, сыра фета [19, 20]. Однако общепризнано, что этот методический прием недостаточно специфичен, на результаты образования гидразонов влияет воздействие диальдегида и других карбонилов липидного происхождения, связанных с белками [19]. В значительной степени повышение специфичности достигается при использовании хроматографических методов для определения отдельных конкретных карбонильных производных белков. Использование способа комплексной оценки продуктов окислительной модификации белков (ОМБ) (М.А. Фомина и соавт., 2014) для оценки общего уровня карбонильных соединений с анализом соотношения альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) повышает возможности определения степени выраженности и стадии повреждений белков [21].

Цель исследования - сравнить уровень показателей ОМБ адаптированных молочных смесей, предназначенных для питания детей раннего возраста.

Материал и методы

Исследованы 4 смеси молочные сухие адаптированные: NAN expert pro (Нестле Дойчланд АГ) - смесь 1, "Малютка" (АО "ДП "Истра-Нутриция") - смесь 2, Nutrilon 2 Premium (Nutricia) - смесь 3, "Беллакт (Bellakt 0-12)" (Волковысское, ОАО "Беллакт") - смесь 4, а также образцы ультрапастеризованного коровьего молока ("Тёма", ОАО "Юнимилк", РФ). Проанализировано по 6 образцов каждой смеси и ультрапастеризованного молока.

Содержание карбонильных производных белков оценивали по методу A.Z. Reznick, L. Parker в модификации Е.Е. Дубининой и соавт. [22], основанному на реакции взаимодействия карбонильных производных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Спектры поглощения АДНФГ и КДНФГ регистрировали на спектрофотометре UNICO 2800 (United Products & Instruments, США). Интенсивность металл-катализированного окисления белков определяли после инкубации 0,2 мл исследуемого материала с 0,01 мл 10 мМ раствора FeSO₄ и 0,5 мл 0,3 мМ H₂O₂ в течение 15 мин при 37 °С. Содержание АДНФГ определяли по оптической плотности в ультрафиолетовой части спектра при длинах волн 230, 254, 270, 280, 356 нм, а уровень КДНФГ - при 363 и 370 нм; в области видимого спектра АДНФГ - при 428 и 430 нм, а КДНФГ - при 434, 520, 534 нм. При использовании способа комплексной оценки содержания продуктов ОМБ М.А. Фоминой и соавт. по полученным значениям экстинкций рассчитывали площадь под кривой, выраженной в условных единицах на 1 г белка [23]. Уровень карбонильных производных рассчитывали на концентрацию белка в молоке и молочных смесях и выражали в условных единицах на 1 г белка. Содержание белка определяли методом Кьельдаля по ГОСТ 34454-2018.

Резервно-адаптационной потенциал рассчитывали как отношение общей площади под кривой карбонильных производных белков при спонтанном окислении к металл-катализируемому по реакции Фентона, принимая значения индуцируемого показателя общей площади за 100% [23].

Статистическую значимость различий оценивали с помощью критерия Стьюдента. Критический уровень значимости различий при проверке статистических гипотез был принят на уровне р=0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования спонтанной ОМБ демонстрируют увеличение общей площади карбонильных производных белков (S_омб) адаптированных молочных смесей: в 3 смесях - на 45,3-54,7% и в смеси № 3 - на 14,1% - по сравнению с показателями ультрапастеризованного коровьего молока (табл. 1).

Повышенное содержание базисного уровня карбонильных производных белков наблюдается в основном за счет увеличения содержания АДНФГ (на 50-60% в 3 смесях) и прежде всего в ультрафиолетовой области спектра (S_АДНФГuv). В отличие от альдегидных производных белков общая площадь кетоновых гидразонов (S_КДНФГ) существенно не отличается в исследуемых молочных смесях от показателей молока, некоторое повышение (на 20%) отмечено только в смеси № 4. Увеличение кетон-динитрофенилгидразонов во всех адаптированных молочных смесях наблюдали только в видимой области спектра. Анализируя изменения показателей спонтанного окисления, следует отметить, что наименьший подъем уровня карбонильных соединений наблюдался в молочной смеси № 3. Различия в изменениях площади карбонильных производных дифенилгидразонов в исследуемых образцах привели к нарушению их соотношения - увеличению процентного содержания АДНФГ в смесях № 1 и 2 и доли КДНФГ в смеси № 3.

Интенсивность спонтанной ОМБ отражает базальный уровень окисленных белков, и, соответственно, повышенное содержание карбонильных производных в адаптированных молочных смесях свидетельствует об увеличении уровня модифицированных белков.

В более значительной степени активизировались процессы ОМБ при индукции окислительных процессов добавлением в инкубационную среду ионов железа и пероксида водорода. Как общее содержание, так и уровни различных фракций карбонильных соединений превосходили показатели коровьего молока в 2,0-2,6 раза (табл. 2). Повышается содержание как альдегидных, так и кетонных производных белков молочных смесей. Причем, как и при спонтанном окислении, в меньшей степени наблюдался подъем альдегидных производных белков молочной смеси № 3, а кетонных производных - в смеси № 1, что отразилось в снижении процентного содержания АДНФГ в смеси № 3 и содержания КДНФГ в смеси № 1 в сравнении с показателями ультрапастеризованного молока.

Рост уровня ОМБ сопровождался некоторым увеличением резервно-адаптационного потенциала. Параллельное определение спонтанного и индуцированного окисления по реакции Фентона позволяет полнее оценить антиокислительный потенциал материала [23]. Значения этого показателя повышены во всех смесях, но наибольшие значения выявлены в адаптированных смесях № 3 и 4.

Результаты исследования свидетельствуют о повышенной подверженности окислительным повреждениям белков адаптированных молочных смесей, предназначенных для детского питания, в сравнении с ультрапастеризованным коровьим молоком, которое часто служит исходным материалом для производства молочных смесей. Повышенный уровень карбонильных соединений может быть результатом не только высокотемпературного воздействия, но и других дополнительных технологических факторов производства смесей - удаления воды путем концентрирования испарением и распылительной сушки при производстве порошка и т.д. Такие воздействия увеличивают интенсивность окислительно-индуцированных изменений молочных белков, которые приводят к фрагментации белка или агрегации путем образования ковалентных сшивок или гидрофобных взаимодействий, к нарушению конформации белка [24, 25].

Несмотря на то что адаптированные и частично адаптированные молочные смеси, предназначенные для питания детей раннего возраста, обогащены витаминами Е, А, С и другими антиоксидантами, что частично компенсирует их потери антиокислительных свойств, по данным N.M. Lugonja и соавт. (2014), антиокислительная активность молочных смесей, предназначенных для детей до 1 года, составляет только 80-70% по сравнению с грудным молоком [26].

На интенсивность образования карбонильных соединений может повлиять изменение белкового спектра молочного продукта, так как при производстве молочных смесей не только снижается концентрация белка, но также добавляются сывороточные белки [28].

Заключение

Сохранение качества белков молочных продуктов и особенно адаптированных молочных смесей, предназначенных для детского питания, безусловно, имеет важнейшее значение для производителей и потребителей. Результаты проведенного исследования подтвердили данные Z.С. Chen и соавт. (2019), полученные при анализе 3 образцов смесей коммерческих компаний, представленных на рынке Дании [24].

Увеличение уровня карбонильных производных белков является маркером повышения активности окислительной деструкции белковых молекул, которая может заключаться в различных посттрансляционных изменениях. Карбонильные производные белков - альдегиды или кетоны - отличаются высокой реакционной способностью в биологических системах и пищевых продуктах [19]. Они легко окисляются с образованием карбоновых кислот, взаимодействуют с другими биомолекулами, участвуют в образовании белковых агрегатов. Эти химические модификации могут проявиться в потере функциональности белка и его усвояемости.

Если кратковременная пастеризация вызывает разрыв дисульфидных связей и увеличение доступных тиогрупп, что способствует повышению антиокислительной активности продукта, то целый ряд дополнительных факторов, действующих при производстве молочных смесей, приводит к активации окислительных повреждений белковых молекул.

Используемый в работе методический подход позволил установить особенности ОМБ молочных смесей - увеличение уровня карбонильных производных белков в основном за счет АДНФГ при спонтанном окислении. Содержание кетоновых производных существенно не меняется. Установленные различия в уровне карбонильных производных белков в разных молочных смесях подтверждают предположение о возможности использования их количественного определения для оценки качества молочного продукта. Характеристика содержания карбонилов белков важна для определения влияния длительности и условий хранения сухих смесей на молочной основе.

Литература

1. Мачнева И.В., Афонина С.Н., Карнаухова И.В., Лебедева Е.Н. Современный взгляд на протеом грудного молока // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2020. Т. 18, № 1. С. 5-10. DOI: https://doi.org/10.25298/2221-8785-2020-18-1-5-10

2. Ye Y., Engholm-Keller K., Fang Y., Nielsen K.F., Jorda A., Lund M.N. et al. UHT treatment and storage of liquid infant formula affects protein digestion and release of bioactive peptides // Food Funct. 2022. Vol. 13, N 1. Р. 344-355. DOI: https://doi.org/10.1039/D1FO02619D

3. Chatterton D.E.W., Nguyen D.N., Bering S.B., Sangild P.T. Anti-inflammatory mechanisms of bioactive milk proteins in the intestine

of newborns // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2013. Vol. 45, N 8. P. 1730-1747. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biocel.2013.04.028

4. Aalaei K.I., Sjoholm I., Rayner M., Teixeira C., Tareke E. Early and advanced stages of Maillard reaction in infant formulas: analysis of available lysine and carboxymethyl-lysine // PLoS One. 2019. Vol. 14, N 7. Article ID e0220138. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220138

5. Teodorowicz M., Neerven van J., Savelkoul H. Food processing: the influence of the Maillard reaction on immunogenicity and allergenicity of food proteins // Nutrients. 2017. Vol. 9, N 8. P. 835. DOI: https://doi.org/10.3390/nu9080835

6. Estevez M. Protein carbonyls in meat systems: a review // Meat Sci. 2011. Vol. 89, N 3. P. 259-279. DOI: https://doi.org/10.1016/j.meatsci.2011.04.025

7. Hellwig M. Analysis of protein oxidation in food and feed products // J. Agric. Food Chem. 2020. Vol. 68, N 46. P. 12 870-12 885. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c00711

8. Estevez M., Padilla P., Carvalho L., Martin L., Carrapiso A., Delgado J. Malondialdehyde interferes with the formation and detection of primary carbonyls in oxidized proteins // Redox Biol. 2019. Vol. 26. Article ID 101277. DOI: https://doi.org/10.1016/j.redox.2019.101277

9. Akagawa M. Protein carbonylation: molecular mechanisms, biological implications, and analytical approaches // Free Radic. Res. 2021. Vol. 55, N 4. P. 307-320. DOI: https://doi.org/10.1080/10715762.2020.1851027

10. Trnkova L., Dršata J., Boušová I. Oxidation as an important factor of protein damage: Implications for Maillard reaction // J. Biosci. 2015. Vol. 40. P. 419-439. DOI: https://doi.org/10.1007/s12038-015-9523-7

11. Luna C., Arjona A., Dueñas C., Estevez M. Allysine and α-aminoadipic acid as markers of the glyco-oxidative damage to human serum albumin under pathological glucose concentrations // Antioxidants. 2021. Vol. 10, N 3. P. 474. DOI: https://doi.org/10.3390/antiox10030474

12. Будкевич Р.О., Емельянов С.А., Храмцов А.Г., Евдокимов И.А. Реакция Майяра как путь образования наночастиц // Молочная промышленность. 2010. № 1. С. 55-56. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=13045616

13. Bastos D.M., Monaro E., Siguemoto E., Sefora M. Maillard reaction products in processed foods: pros and cons // Food Industrial Processes - Methods and Equipment. London : INTECH Open Access Publisher, 2012. P. 281-300. DOI: https://doi.org/10.5772/31925

14. Luna C., Estévez M. Formation of allysine in β-lactoglobulin and myofibrillar proteins by glyoxal and methylglyoxal: impact on water-holding capacity and in vitro digestibility // Food Chem. 2019. Vol. 271. P. 87-93. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem. 2018. 07.167

15. Wu Y., Dong L., Wu Y., Wu D., Zhang Y., Wang S. Effect of methylglyoxal on the alteration in structure and digestibility of α‐lactalbumin and the formation of advanced glycation end products under simulated thermal processing // Food Sci. Nutr. 2021. Vol. 9, N 4. Р. 2299-2307. DOI: https://doi.org/10.1002/fsn3.2211

16. Hellwig M. Analysis of protein oxidation in food and feed products // J. Agric. Food Chem. 2020. Vol. 68, N 46. P. 12 870-12 885. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c00711

17. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Санкт-Петербург : Медицинская пресса, 2006. 397 с. ISBN 5-85474-072-9. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=19495143

18. Соколова М.А., Высокогорский В.Е., Розенфельд Ю.Г., Антонов О.В., Комарова А.А., Подольникова Ю.А. Интенсивность процессов окислительной модификации белков женского и коровьего молока // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 4. С. 83-89. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-4-83-89

19. Estévez M., Diaz-Velasco S., Martínez R. Protein carbonylation in food and nutrition: a concise update // Amino Acids. 2022. Vol. 54, N 4. P. 559-573. DOI: https://doi.org/10.1007/s00726-021-03085-6

20. Kalaitsidis K., Sidiropoulou E., Tsiftsoglou O., Mourtzinos I., Moschakis T., Basdagianni Z. et al. Effects of cornus and its mixture with oregano and thyme essential oils on dairy sheep performance and milk, yoghurt and cheese quality under heat stress // Animals. 2021. Vol. 11, N 4. P. 1063. DOI: https://doi.org/10.3390/ani11041063

21. Патент № 2524667 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/52. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях: № 2013102618/15 : заявл. 21.01.2013 : опубл. 27.07.2014 / М.А. Фомина, Ю.В. Абаленихина, Н.В. Фомина, А.А. Терентьев; заявитель Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации. - EDN FKTULI.

22. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов Г.Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии. 1995. Т. 41, № 1. С. 24-26. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=32750262

23. Фомина М.А., Абаленихина Ю.В. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях: методические рекомендации. Рязань: РИО РязГМУ, 2014. 60 с. URL https://elibrary.ru/item.asp?id=37451035

24. Chen Z., Leinisch F., Greco I., Zhang W., Shu N., Chuang C.Y. et al. Characterisation and quantification of protein oxidative modifications and amino acid racemisation in powdered infant milk formula // Free Radic. Res. 2019. Vol. 53, N 1. P. 68-81. DOI: https://doi.org/10.1080/10715762.2018.1554250

25. Chen Y., Callanan M.J., Shanahan C., Tobin J., Gamon L.F., Davies M.J. et al. The use of membrane filtration to increase native whey proteins in infant formula // Dairy Prod. 2021. Vol. 2, N 4. P. 515-529. DOI: https://doi.org/10.3390/dairy2040041

26. Lugonja N.M., Stanković D.M., Spasić S.D., Roglić G.M., Manojlović D.D., Vrvić M. Comparative electrochemical determination of total antioxidant activity in infant formula with breast milk // Food Anal. Methods. 2014. Vol. 7, N 2. P. 337-344. DOI: https://doi.org/10.1007/s12161-013-9631-7

27. Carver J.D. Advances in nutritional modifications of infant formulas // Am. J. Clin. Nutr. 2003. Vol. 77, N 6. P. 1550S-1554S. DOI: https://doi.org/10.1093/ajcn/77.6.1550S

28. Fenelon M.A., Khimki R.M., Buggy A., McCarthy N., Murphy E.G. Whey proteins in infant formula // Whey Proteins / eds H.C. Deeth, N. Bansal. Academic Press, 2019. P. 439-494. ISBN 9780128121245. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-812124-5.00013-8

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)