Модифицированный метод получения фикоцианинового концентрата биомассы Arthrospira platensis

• Бирюлина Надежда Александровна
• Зорин Сергей Николаевич
• Никитюк Дмитрий Борисович
• Мазо Владимир Кимович

Резюме

Биомасса цианобактерий Arthrospira platensis (A. platensis) является источником биологически активных соединений, таких как хлорофиллы, каротиноиды и в первую очередь фикобилипротеины: С-фикоцианин и аллофикоцианин. Широкий спектр биологической активности, проявляемый экстрактами с высоким содержанием фикоцианинов, определяет перспективы их использования в качестве биологически активных добавок к пище и ингредиентов специализированных пищевых продуктов. Для пищевых целей степень чистоты концентратов фикоцианинов, определяемая соотношением оптических плотностей их водных растворов при 2 длинах волн, а именно D₆₂₀/D₂₈₀, должна быть выше 0,7. Большинство методов получения концентратов фикоцианинов включают трудоемкие стадии фракционного сульфатно-аммонийного осаждения белка из экстрактов биомассы A. platensis и последующее удаление солевого раствора. Использование мембранной технологии, в частности микрофильтрации, позволяет в значительной степени интенсифицировать и упростить процесс получения концентратов фикоцианинов.

Цель исследования - модификация метода получения концентрата фикоцианинов A. platensis с высокой степенью чистоты путем замены стадии сульфатно-аммонийного осаждения белка ультрафильтрацией экстракта с последующей микрофильтрацией.

Материал и методы. В качестве исходного сырья использовали образец сухой биомассы A. platensis. Экстракцию биомассы A. platensis проводили при температуре +40 °С в течение 3 ч, образовавшуюся суспензию центрифугировали, супернатант отделяли от осадка. Полученный экстракт подвергали ультрафильтрации (мембрана с диаметром пор 30 кДа) и удаляли пермеат, содержащий низкомолекулярные примеси. Ретентат подвергали микрофильтрации (мембрана с размерами пор 0,2 мкм), концентрировали обратным осмосом и лиофильно высушивали.

Результаты. Содержание С-фикоцианина и аллофикоцианина в сухом концентрате составило 42,0±1,3 и 7,0±0,3% соответственно, степень чистоты 1,98.

Заключение. Модифицирована схема получения концентрата фикоцианинов A. platensis. Получен концентрат с высокой степенью чистоты, позволяющей использовать его в составе пищевой продукции.

Ключевые слова:биомасса Arthrospira platensis; экстракция; С-фикоцианин; аллофикоцианин; ультрафильтрация; микрофильтрация; концентрат

Биомасса цианобактерий Arthrospira platensis является источником биологически активных соединений, таких как хлорофиллы, каротиноиды и в первую очередь фикобилипротеины: С-фикоцианин (С-ФКЦ) и аллофикоцианин (А-ФКЦ) [1-4]. Неудовлетворительные органолептические свойства биомассы A. platensis (выраженный горький вкус) существенно ограничивают ее применение в составе пищевых продуктов. В настоящее время решением этой проблемы является широкое использование для пищевых целей концентратов фикоцианинов A. platensis, безопасность которых установлена токсикологическими исследованиями [5]. Биологическая активность, проявляемая экстрактами с высоким содержанием фикоцианинов, определяет перспективы их использования в качестве ингредиентов специализированных пищевых продуктов (СПП) [6-8]. Методы получения препаратов и концентратов фикоцианинов различной степени чистоты были представлены нами ранее в кратком обзоре [9]. Для пищевых целей степень чистоты концентратов фикоцианина, определяемая соотношением оптических плотностей их водных растворов при 2 длинах волн, а именно D₆₂₀/D₂₈₀, должна быть выше 0,7 [10, 11]. Первый этап выделения фикоцианинов - экстракция - связан с нарушением целостности клеточных стенок биомассы A. platensis. Механические методы включают ультразвуковую обработку, гомогенизацию, высокое давление, экстракцию с помощью стеклянных шариков и др. [12-14]. Также находят применение химический осмос, повторное замораживание-оттаивание, ферментативная обработка [15-18]. В подавляющем большинстве исследований для получения концентратов фикоцианинов из биомассы A. platensis экстракцию сочетают с последующими фракционными сульфатно-аммонийными осаждениями белка [19-21]. Такой методический подход был использован в нашей предыдущей работе [9], посвященной получению концентрата фикоцианина из биомассы A. platensis для возможного использования в пищевых целях. При сульфатно-аммонийном осаждении белка, широко применяемом в лабораторной практике, требуется проведение трудоемкого обессоливания, получаемого в виде осадка белкового препарата, и последующая элиминация значительного объема раствора сульфата аммония. Современные методические подходы с использованием мембранной технологии, такие как нано-, ультра- и микрофильтрация, позволяют в значительной степени интенсифицировать и упростить процесс получения белковых концентратов.

Цель исследования - модификация метода получения концентрата фикоцианинов A. platensis с высокой степенью чистоты путем замены стадии сульфатно-аммонийного осаждения белка ультрафильтрацией экстракта с последующей микрофильтрацией.

Материал и методы

Объектом исследования был предоставленный научно-производственным объединением "Биосоляр МГУ" образец сухой биомассы A. platensis, полученной культивированием в закрытой теплице при искусственном освещении, собранной, сконцентрированной, промытой и лиофильно высушенной.

Образец лиофильно высушенного концентрата фикоцианинов (далее - концентрат 1), полученный ранее в нашей работе [9] по схеме, представленной на рис. 1А, использовали как образец для сравнения. На рис. 1Б представлена модифицированная схема получения концентрата фикоцианинов A. platensis (далее - концентрат 2).

Как следует из представленных схем, на первом этапе получения концентратов 1 и 2 биомассу A. platensis предварительно измельчали в лабораторном блендере (WARING, США) до порошкообразного состояния с размерами частиц <0,5 мм. Экстракцию 80 г биомассы A. platensis с 800 см³ 0,1 М калий-фосфатного буфера pH 7,0, предварительно нагретого в термостате до +40 °С, проводили в течение 3 ч при температуре +40 °С на водяной бане при постоянном перемешивании. Образовавшуюся суспензию центрифугировали (центрифуга Beckman J-6B, США) при 4000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант отделяли от осадка методом декантирования, повторно экстрагировали осадок по аналогичной схеме и экстракты объединяли. Модификация метода при получении концентрата 2 (рис. 1Б) состояла в том, что была исключена стадия осаждения белка сульфатом аммония и объединенный экстракт непосредственно подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке через мембрану с диаметром пор 30 кДа на установке для микро- и ультрафильтрации на базе фильтродержателя АСФ-018 ("Владисарт", РФ). Удаляли пермеат, содержащий низкомолекулярные примеси, и обессоливали на этой же мембране отобранный ретентат. Для дополнительной очистки ретентата от оставшихся в его составе высокомолекулярных примесей проводили микрофильтрацию в тангенциальном потоке через мембрану с размерами пор 0,2 мкм на той же установке. Отобранный микрофильтрат концентрировали обратным осмосом на установке с фильтром рулонным мембранным УРФ-1812 ("Владисарт", РФ) и лиофильно высушивали (лиофильная сушка ЛС-500, "Проинтех", РФ), получая конечный продукт - концентрат 2.

В экстракте A. platensis, ретентате и концентратах 1 и 2 количественно оценивали содержание С-ФКЦ и А-ФКЦ, определяя оптическую плотность (ОП) при длинах волн 620 и 655 нм и используя для расчета формулы 1 и 2 [22]:

где V - объем объединенного экстракта, см³; m - масса навески, мг; k - массовая доля воды в пробе; l - длина оптического пути, см.

Степень чистоты экстракта, ретентата и концентратов 1 и 2 рассчитывали по соотношению удельных оптических плотностей их растворов при длинах волн 620 и 280 нм (D₆₂₀/D₂₈₀).

С использованием эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления характеризовали молекулярно-массовое распределение белковых и пептидных фракций в экстракте, ретентате и концентрате 2. Анализ проводили на колонке TSK GEL 2000 SW_lx (0.8×30 см Toyo Soda, Япония), откалиброванной по стандартным водорастворимым глобулярным белкам (SERVA, Германия). Предварительно 1,0% водный раствор экстракта, ретентата и концентрата 2 центрифугировали в течение 15 мин при 15 000 об/мин (центрифуга IKA G-L, Германия) и наносили на колонку в количестве 100 мкм³. В качестве элюента использовали 0,2 М раствор NaCl - c добавлением азида натрия, скорость элюирования 0,25 см³/мин. ОП элюируемого раствора определяли при длинах волн 280 и 620 нм, используя спектрофотометрический однолучевой проточный детектор UV/VIS-151 (GILSON, США).

Массовую долю белка в экстракте, ретентате и концентратах 1 и 2 определяли по ГОСТ 26889-86 "Продукты пищевые и вкусовые. Общие указания по определению содержания азота методом Кьельдаля".

Каждый эксперимент был выполнен в 8 повторностях. Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета IBM SPSS Statistics 20 (IBM, США). Для всех показателей, представленных в таблице, вычисляли среднее значение (М) и стандартную ошибку среднего (m). Статистические различия оценивали с использованием критерия Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Белково-пептидные профили промежуточных продуктов и концентрата 2, полученных по предложенной модифицированной схеме (рис. 2А-В), и концентрата 1, полученного по технологии, включавшей стадию сульфатно-аммонийного осаждения белка из экстракта А. platensis (рис. 2Г), представлены соответствующими хроматограммами. Сравнительный анализ хроматограмм на рис. 2А и Б показал, что в результате ультрафильтрации экстракта происходит частичная элиминация балластных низкомолекулярных фракций (<12 кДа) и их содержание в отобранном ретентате снижается в 5,7 раза. Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что при использовании модифицированной схемы в ретентате содержание белка повышается в 1,7 раза, а суммарное содержание фикоцианинов - в 2,8 раза. Последующая микрофильтрация ретентата практически полностью удалила высокомолекулярные примеси из его состава (см. рис. 2Б и В), дополнительно повысила содержание общего белка и суммарное содержание фикоцианинов в конечном продукте соответственно в 1,2 и 1,6 раза. Степень чистоты ретентата в результате микрофильтрации увеличилась в 1,8 раза. В таблице приведены данные по сравнительной характеристике концентратов 2 и 1. Суммарное содержание фикоцианинов в концентрате 2 в 1,2 раза выше по сравнению с концентратом 1. В 1,8 раза повышена чистота концентрата 2, при получении которого была исключена трудоемкая стадия сульфатно-аммонийного осаждения.

Таким образом, полученные результаты подтвердили эффективность предложенной схемы модификации процесса. Сульфатно-аммонийное осаждение белков из экстрактов А. platensis позволяет примерно в 2 раза повысить на этой стадии степень чистоты получаемого промежуточного продукта [21, 23, 24]. Последующая ультрафильтрация, как при получении концентрата 1, используется, чтобы перевести осажденный белок в растворимое состояние, удаляя сульфат аммония из раствора. В модифицированной схеме ультрафильтрация непосредственно экстракта А. platensis заменяет стадию сульфатно-аммонийного осаждения, в 1,8 раза повышая чистоту продукта. Последующая микрофильтрация, как отмечено выше, дополнительно еще в 1,8 раза повышает чистоту концентрата 2.

Заключение

Модифицирован и апробирован способ концентрирования и очистки фикоцианинов из биомассы А. platensis. Получен концентрат с высоким содержанием фикоцианинов и степенью чистоты, позволяющей использовать его в составе пищевой продукции.

Литература

1. Kerna N., Nwokorie U., Ortigas M., Chawla S., Pruitt K., Flores J. et al. Spirulina miscellany: medicinal benefits and adverse effects of Spirulina // EC Nutrition. 2022. Vol. 17. P. 25-36. DOI: https://doi.org/10.31080/ecnu.2022.17.01013

2. Lafarga T., Fernández-Sevilla J., González-López C., Acién-Fernández F. Spirulina for the food and functional food industries // Food Res. Int. 2020. Vol. 137. Article ID 109356. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodres.2020.109356

3. Wollina U., Voicu C., Gianfaldoni S., Lotti T., França K., Tchernev G. Arthrospira platensis - potential in dermatology and beyond // Open Access Maced. J. Med. Sci. 2018. Vol. 6, N 1. P. 176-180. DOI: https://doi.org/10.3889/oamjms.2018.033

4. Finamore A., Palmery M., Bensehaila S., Peluso I. Antioxidant, immunomodulating, and microbial-modulating activities of the sustainable and ecofriendly Spirulina // Oxid. Med. Cell. Longev. 2017. Vol. 69. P. 157-171. DOI: https://doi.org/10.1155/2017/3247528

5. Бирюлина Н.А., Мазо В.К., Багрянцева О.В. Фикоцианины Arthrospira platensis: перспективы использования в специализированной пищевой продукции (краткий обзор) // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 6. С. 30-36. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-30-36

6. Wu Q., Liu L., Miron A., Klimova B., Wan D., Kuca K. The antioxidant, immunomodulatory, and anti-inflammatory activities of Spirulina: an overview // Arch. Toxicol. 2016. Vol. 90, N 8. P. 1817-1840. DOI: https://doi.org/10.1007/s00204-016-1744-5

7. Pagels F., Guedes A., Amaro H., Kijjoa A., Vasconcelos V. Phycobiliproteins from cyanobacteria: chemistry and biotechnological applications // Biotechnol. Adv. 2019. Vol. 37, N 3. P. 422-443. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.02.010

8. Мазо В.К., Бирюлина Н.А., Сидорова Ю.С. Arthrospira platensis: антиоксидантные, гипогликемические и гиполипидемические эффекты in vitro и in vivo (краткий обзор) // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 4. С. 19-25. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-4-19-25

9. Бирюлина Н.А., Зорин С.Н., Мазо В.К. Концентраты фикоцианинов из биомассы Аrthrospira platensis: технология и характеристика состава // Актуальная биотехнология. 2022. № 1. С. 187-189. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=50113924

10. Güroy B., Karadal O., Mantoğlu S., Cebeci O. Effects of different drying methods on C-phycocyanin content of Spirulina platensis powder // EgeJFAS (Ege Journal of Fisheries and Aquatic Sciences). 2017. Vol. 34, N 2. P. 129-132. DOI: https://doi.org/10.12714/egejfas.2017.34.2.02

11. Evaluation of Certain Food Additives: Eighty-Sixth Report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Geneva : World Health Organization and Food and Agriculture Organizationof the United Nations, 2019. (WHO Technical Report Series; No. 1014)

12. Vali Aftari R., Rezaei K., Mortazavi A., Bandani A. The optimized concentration and purity of spirulina platensis C-Phycocyanin: a comparative study on microwave-assisted and ultrasound-assisted extraction methods // J. Food Process. Preserv. 2015. Vol. 39. N 6. P. 3080-3091. DOI: https://doi.org/10.1111/jfpp.12573

13. Li Y., Zhang Z., Paciulli M., Abbaspourrad A. Extraction of phycocyanin-A natural blue colorant from dried spirulina biomass: influence of processing parameters and extraction techniques // J. Food Sci. 2020. Vol. 85, N 3. P. 727-735. DOI: https://doi.org/10.1111/1750-3841.14842

14. Martínez J., Luengo E., Saldaña G., Álvarez I., Raso J. C-phycocyanin extraction assisted by pulsed electric field from Artrosphira platensis // Food Res. Int. 2017. Vol. 99, N 3. P. 1042-1047. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodres.2016.09.029

15. Saran S., Puri N., Jasuja N., Kumar M., Sharma G. Optimization, purification and characterization of Phycocyanin from Spirulina platensis // Int. J. Appl. Agric. 2016. Vol. 2, N 3. P. 15-21.

16. Sala L., Moraes C., Kalil S. Cell pretreatment with ethylenediaminetetraacetic acid for selective extraction of C-phycocyanin with food grade purity // Biotechnol. Progress. 2018. Vol. 34, N 5. P. 1261-1268. DOI: https://doi.org/10.1002/btpr.2713

17. Pott R.W. The release of the blue biological pigment C-phycocyanin through calcium-aided cytolysis of live Spirulina sp. // Color. Technol. 2018. Vol. 135, N 1. P. 17-21. DOI: https://doi.org/10.1111/COTE.12373

18. Manirafasha E., Murwanashyaka T., Ndikubwimana T., Yue Q., Zeng X., Jing K. et al. Ammonium chloride: a novel effective and inexpensive salt solution for phycocyanin extraction from Arthrospira Spirulina platensis // J. Appl. Phycol. 2017. Vol. 29, N 3. P. 1261-1270. DOI: https://doi.org/10.1007/s10811-016-0989-y

19. Tavanandi H., Mittal R., Chandrasekhar J. Simple and efficient method for extraction of C-Phycocyanin from dry biomass of Arthospira platensis // Algal Res. 2018. Vol. 31. P. 239-251. DOI: https://doi.org/10.1016/j.algal.2018.02.008

20. Ilter I., Akyıl S., Demirel Z., Koç M., Conk-Dalay M., Kaymak-Ertekin F. Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using different techniques // J. Food Compos. Anal. 2018. Vol. 70. P. 78-88. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jfca.2018.04.007

21. Zhang F.Y., Yu J.W., Zhang L., Sheng J.M., Yuan M.Y., Lu Y.N. et al. UV-Vis spectrum characteristics of phycocyanin purification in water from Chao lake // J. Clin. Otorhinolaryngol. 2017. Vol. 37, N 3. P. 806-810. DOI: https://doi.org/10.3964/j.issn.10000593(2017)03-0806-05

22. Геворгиз Р.Г., Нехорошев М.В. Количественное определение массовой доли С фикоцианина и аллофикоцианина в сухой биомассе Spirulina (Arthrospira) platensis North. Geitl. Холодная экстракция / РАН, Институт морских биологических исследований им. А.О. Ковалевского. Севастополь, 2017. 21 с. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=44165791

23. Yan S., Zhu L., Su H., Zhang X., Chen X., Zhou B. et al. Single-step chromatography for simultaneous purification of C-phycocyanin and allophycocyanin with high purity and recovery from Spirulina (Arthrospira) platensis // J. Appl. Phycol. 2011. Vol. 23. P. 1-6. DOI: https://doi.org/10.1007/s10811-010-9525-7

24. Khazi M.I., Demirel Z., Liaqat F., Dalay M.C. Analytical grade purification of phycocyanin from cyanobacteria // Methods Mol. Biol. 2020. Vol. 1980. P. 173-179. DOI: https://doi.org/10.1007/7651_2018_202

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)