Вариабельность протеома плазмы крови у здоровых людей (сообщение 1)

РезюмеПоследнее десятилетие характеризовалось интенсивным развитием протеомных технологий, которые открыли новые перспективы для быстрого широкомасштабного скрининга биологических образцов с целью поиска биохимических показателей при тех или иных заболеваниях или состояниях. Однако чтобы адекватно оценить возможность применения белка в качестве биомаркера, необходимо знать, насколько сильно варьирует его концентрация у здоровых людей. В данной работе исследовали пределы концентрации белковых компонентов плазмы у здоровых людей.

Ключевые слова:протеом, белок, вариабельность, плазма крови, двумерный электрофорез, массспектрометрическая идентификация

Под протеомикой понимают ка идентификацию белков в различных исследуемых объектах (пищевых продуктах, внутренних органах, тканях человека и животных), так и их функциональные изменения. Состав протеома (в отличие от генома) не остается постоянным, а меняется под воздействием внешних и внутренних факторов.

Следовательно, при изучении изменений протеома под воздействием различных факторов (включая алиментарно-зависимые) можно выявить основные признаки (маркеры), указывающие на характер и интенсивность таких воздействий. Эти признаки (маркеры), если они будут выявлены в отношении алиментарно-зависимых факторов, помогут в определении пищевого статуса организма, а также связанного с ним состояния здоровья.

Подобные работы ведутся в различных исследовательских учреждениях всего мира. Это, в частности, позволило установить, что диета, богатая соевыми продуктами, обладает кардиопротекторным эффектом, который обусловлен как изофлавонами сои, так и соевыми белками [5]. Обнаружена также антисклеротическая активность генистеина [6], а в экспериментах, посвященных изучению влияния цинка, у лабораторных животных (крысы) выявлено существенное изменение концентрации циклооксигеназы-2 [3].

В последнее десятилетие благодаря появлению высокопроизводительных инструментальных методов исследования изменения протеома под воздействием различных факторов ведутся все интенсивнее. Сегодня каждое такое исследование предполагает наличие контрольных объектов, по сравнению с которыми и наблюдаются изменения протеома, что в значительной мере затрудняет и удорожает исследования.

Однако протеом абсолютно здорового человека стремится, как известно, к своему идеальному варианту, что обусловливает возможность выявления некоего "эталонного протеома", т.е. среднего протеома, характерного для абсолютно здорового человека. Это создает предпосылки для создания базы, содержащей данные о нормальном строении протеома (с наличием его вариабельности) у здоровых людей. Существование подобной базы данных, очевидно, существенно снизило бы затраты на проведение исследований по поиску белков-маркеров при различных заболеваниях человека и необходимость в использовании контрольной группы.

Наиболее интересным объектом для подобных исследований является плазма крови, так как кровь отражает гомеостаз всего организма и, следовательно, несет в себе белковый след процессов, происходящих во всех тканях и органах [2, 7].

Целью данной работы было изучение нормальной вариабельности протеома плазмы крови у здоровых людей с занесением полученных результатов в общедоступную базу данных.

Материал и методы

На основании заключений врачебно-экспертной комиссии Института медико-биологических проблем РАН в группу обследуемых было включено 30 здоровых добровольцев в возрасте 25-45 лет. У обследуемых брали 30 мл крови натощак из локтевой вены. Непосредственно после взятия методом центрифугирования отделяли плазму и хранили ее при температуре -80 °С.

Как известно, основной сложностью работы с плазмой крови является очень широкий диапазон концентраций содержащихся в ней белков [8], в основном альбуминов и иммуноглобулинов (Ig), на долю которых приходится более 90% всех белков в плазме крови. Присутствуя в столь высокой концентрации, эти мажорные (преобладающие) белки мешают проводить детектирование менее представленных в плазме крови белков, которые, однако, являются более диагностически значимыми (табл. 1, 2).

Для преодоления этой трудности мы использовали 4 методики [7] очистки плазмы крови от присутствующих в ней белков (табл. 3):

- методика получения термостабильной фракции плазмы;

- проведение иммуноаффинной хроматографии на колонках, несущих антитела к 6 мажорным белкам плазмы крови [1, 10];

- проведение аффинной хроматографии с G-сефарозой для удаления Ig и экстракцию альбумина 42% раствором этанола [4];

- обработка плазмы с помощью специальных гранул, несущих на поверхности библиотеку различных пептидов, направленная на выравнивание концентраций различных белков плазмы.

Из опробованных методик для дальнейших исследований были выбраны очистка на G-сефарозе, а также очистка на гранулах ProteoMiner (Bio-Rad, США) как позволяющие получить наиболее воспроизводимые и качественные электрофореграммы.

Для разделения белков и их количественного определения проводили двумерный электрофорез в полиакриламидном геле с разделением белков по изоэлектрической точке с помощью системы изоэлектрической фокусировки PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad, США). Было проанализировано 15 образцов плазмы крови, подвергнутых очистке на G-сефарозе, и 15 образцов плазмы крови, подвергнутых очистке от мажорных белков на гранулах ProteoMiner. Обработку протеомных карт проводили с использованием программы Melanie III (GeneBio, Швейцария).

После получения электрофореграмм с помощью масс-спектрометрии выполняли идентификацию их белков. Для этого брали белковые пятна с достаточно высокой интенсивностью. Белковые пятна вырезали из геля и после трипсинолиза белка снимали масс-спектры белков на масс-спектрометре MALDI MS Autoflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, Германия); ионизацию получали путем облучения твердотельным лазером.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Office Excel 2003, USA.

Таблица 1. Список белков, идентифицированных на протеомных картах, полученных с использованием "очистки" плазмы крови от мажорных белков на G-сефарозе

Таблица 2. Список белков, идентифицированных на протеомных картах, полученных с использованием "очистки" плазмы крови на гранулах ProteoMiner

Таблица 3. Сравнение разных методик очистки плазмы крови от мажорных белков

Рис. 1. Электрофореграмма цельной необработанной плазмы

Результаты и обсуждение

Примеры электрофореграмм, полученных методом двумерного электрофореза плазмы крови, до и после очистки представлены соответственно на рис. 1 и 2 (а, б). Среднее количество белковых пятен, детектируемых на гелях при проведении двумерного электрофореза, составило: при использовании при использовании G-сефарозы - 316±32 пятна, гранул ProteoMiner - 104±17 пятен. Таким образом, использование G-сефарозы позволило детектировать значительно большее количество белковых пятен. При обработке результатов двумерного электрофореза для анализа межиндивидуальной вариабельности были отобраны только те пятна, которые встречаются не менее чем в 80% образцов геля. Список наиболее информативных белков, идентифицированных на протеомных картах, представлен в табл. 1 (с использованием очистки плазмы крови от мажорных белков на G-сефарозе) и табл. 2 (с использованием очистки плазмы крови на гранулах ProteoMiner). Полученные результаты внесены в доступную базу данных по протеому плазмы крови здоровых людей [9].

Таким образом, на основании полученных результатов была создана база данных о нормальной вариабельности протеома плазмы крови у здоровых людей. Данную базу можно использовать в качестве протеома сравнения в исследованиях по поиску белковых маркеров при различных заболеваниях человека, в том числе и алиментарнозависимых. Это позволит существенно сократить необходимые затраты на использование в исследованиях контрольных групп*.( Данная работа осуществлена за счет средств, полученных по государственному контракту от 21 мая 2009 г. № 02.512.12.2048 по теме: "Популяционная протеомика плазмы крови здоровых доноров", шифр "2009-02-1.2-04-47-013" Федерального агентства по науке и инновациям.)

Рис. 2. Примеры электрофореграмм, полученных после "очистки" плазмы крови на G-сефарозе (а) и гранулах ProteoMiner (б)

Литература

1. Ernoult E., Bourreau A., Gamelin E. et al. // J. Biomed. Biotechnol. - 2010. - Article ID 927917.

2. Goufman E.I., Moshkovskii S. A., Tikhonova O. V. et al. // J. Biochemistry (Mosc.). - 2006. - Vol. 71, N 4. - P. 354-360.

3. Fuchs D., Pascual-Teresa S., Rimbach G. et al. // Eur. J. Nutr. - 2005. - Vol. 44, N 2. - P. 95-104.

4. Fuchs D., Vafeiadou K., Hall W.L. et al. // Am. J Clin. Nutr. - 2007. - Vol. 86, N 5. - P. 1369-1375.

5. Fong L.Y., Zhang L., Jiang Y. et al. // J. Natl Cancer Inst. - 2005. - Vol. 97, N 1. - P. 40-50.

6. Haab B.B., Geierstanger B.H., Michailidis G. et al. // J. Proteomics. - 2005. - Vol. 5, N 13. - P. 3278-3291.

7. Zolotarjova N., Martosella J., Nicol G. et al. // J. Proteomics. - 2005. - Vol. 5, N 13. - P. 3304-3313.

8. Echan L.A., Tang H.Y., Ali-Khan N. et al. // J. Proteomics. - 2005. - Vol. 5, N 13. - P. 3292-3303.

9. Huang L., Harvie G., Feitelson J. S. et al. // J. Proteomics. - 2005. - Vol. 5, N 13. - P. 3314-3328.

10. Fu Q., Bovenkamp D. E., Van Eyk J. E. // J. Methods Mol. Biol. - 2007. - Vol. 357. - P. 365-371.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»