Антиоксидантная и мембранотропная активность розмариновой кислоты

Резюме

Метаболические повреждения и воспалительные заболевания тесно связаны с резким возрастанием содержания в организме активных форм кислорода (АФК) и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).В связи с этим для эффективной борьбы с окислительным стрессом активно используют природные антиоксиданты полифенольной природы. В настоящей работе мы провели оценку антиоксидантного потенциала розмариновой кислоты (РК), которая широко распространена среди растений и обладает полезным спектром биологической активности. Показано, что РК заметно превосходит известные антиоксиданты в тестах по антиоксидантной активности в системах Hb-H2O2 - люминол и 2,2’-азобис (2-метилпропионамидин) дигидрохлорид-люминол, а также по ингибированию перекисного окисления линолевой кислоты. По уровню антиоксидантной активности исследуемые вещества могут быть выстроены в следующий ряд: РК > дигидрокверцетин > тролокс > аскорбиновая кислота. Молекулы РК локализуются, главным образом, в области полярных групп липидного бислоя, но без значимого влияния на его структурно-функциональные свойства: РК не вызывает достоверного изменения проницаемости плоских бислойных мембран в диапазоне доз от 0,5 до 10 мкг/мл.Для полного предотвращения ПОЛ достаточно спонтанного включения 1 моль% РК в липидный бислой. Таким образом, в основе антиоксидантного действия РК лежит ее способность ингибировать стадию инициации свободно-радикальных реакций ПОЛ, во многом обусловленную образованием АФК. В этой связи РК как мощный и эффективный ингибитор образования АФК и ПОЛ имеет большие перспективы для широкого использования не только в медицине, но и в пищевой промышленности для сохранения качества скоропортящихся продуктов питания.

Ключевые слова:природные полифенолы, розмариновая кислота, антиоксиданты, активные формы кислорода, перекисное окисление липидов

Вопр. питания. - 2014. - № 3. - С. 25-31.

Розмариновая кислота (РК), химическая структура которой приведена на рис. 1, представляет собой фенолпропаноид, распространенный во многих видах высших растений [6]. Она обладает разнообразной биологической активностью [4, 5, 13, 18, 21] и проявляет ярко выраженные противовоспалительные свойства [9, 16, 19, 20]. Указанные свойства РК имеют положительное значение, особенно при развитии окислительного стресса в различных биологических системах, который определяют как процесс избыточного формирования активных форм кислорода (АФК) [1, 3]. В механизмах повреждения и защиты при окислительном стрессе важную роль играет процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ). При чрезмерном накоплении продуктов ПОЛ в организме развиваются повреждения мембранных липидов, липопротеидов и белков, инактивация ферментов, что приводит к нарушениям структурно-функциональной организации клеточных мембран [5-8, 15].

Клиническая практика испытывает дефицит в арсенале гидрофильных перехватчиков АФК как ингибиторов свободнорадикальных реакций (СРР). В связи с этим последнее время проводится широкий поиск новых ингибиторов и тестирование их свойств. Примером одного из таких ингибиторов является РК [5, 15, 18]. Основной подход для изучения механизма действия подобных агентов - использование различных модельных систем окисления [12], позволяющих определить эффективность перехвата тем или иным ингибитором СРР какого-либо определенного радикала.

Цель работы - изучение с помощью различных модельных систем антиоксидантной активности РК в сравнении с тролоксом, аскорбиновой кислотой и дигидрокверцетином, а также оценка влияния РК на проводимость модельных липидных мембран.

Материал и методы

В работе использовали: РК (М.м. 260,3), 2,2’азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид (ААРН) и гемоглобин (Нb) ("Sigma-Aldrich", США), люминол (ЛМ) и тролокс ("Fluka", Германия); дигидрокверцетин (ОАО "Диод", РФ); KH2PO 4 , KOH и диметилсульфоксид (ДМСО) ("Химмед", РФ).

Розмариновую кислоту растворяли в фосфатном буфере [50 мМ КН 2 РО 4 , 100 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 7,4] в концентрации 0,01 мг/мл. Тролокс и дигидрокверцетин сначала растворяли в этаноле в концентрации 10 мМ, затем полученный раствор разводили фосфатным буфером до концентрации 100 мкМ и использовали в работе. Все растворы готовили непосредственно перед экспериментом.

Антиоксидантные свойства РК изучали с помощью 2 хемилюминесцентных модельных систем окисления: гомогенной системы, состоящей из гемоглобина, пероксида водорода и люминола (Нb-Н 2 О 2 -ЛМ) [7], и гомогенной системы, состоящей из азосоединения ААРН и ЛМ (ААРН-ЛМ) [7].

Для измерения хемилюминесценции (ХЛ), сопровождающей окисление ЛМ в системе Нb-Н2 О2-ЛМ, в кювету хемилюминометра последовательно добавляли фосфатный буфер до конечного объема 5 мл, 0,3 мкмоль Нb, 10 мкмоль ЛМ и определенный объем исследуемого объекта. Окисление ЛМ инициировали введением 52 мкмоль пероксида водорода. Исследуемые вещества добавляли перед введением Н2О2 [7, 12].

Антиоксидантную активность препаратов в системе ААРН-ЛМ также определяли по окислению ЛМ, инициированному двумя пероксильными радикалами, которые генерируются с постоянной скоростью водорастворимым азосоединением ААРН (5 мг/мл), что сопровождается ХЛ [7, 12]. Хемилюминесцентные измерения проводили с помощью хемилюминометра "ХЛМ-3" ("Бикап", Россия). Кинетику ХЛ регистрировали и обрабатывали с помощью интерфейса MacLab/2e (ADInstruments, Австралия), связанного с компьютером Macintosh LC II. В данных исследованиях тролокс был использован в качестве эталонного антиоксиданта, а аскорбиновая кислота и дигидрокверцетин соответственно взяты в качестве известных стандартных антиоксидантов.

На основании полученных кинетических кривых находили значения латентного периода в контроле (t 0 ) и для различных концентраций тролокса, дигидрокверцитина, аскорбиновой кислоты и РК (t). После этого строили калибровочную зависимость латентного периода от концентрации тролокса по следующему линейному уравнению:

t/t0 = 1+KT x CT

где t/t0 - изменение латентного периода; K T - константа изменения латентного периода для тролокса; C T - концентрация тролокса.

Затем аналогичную зависимость находили для исследуемого препарата:

t/t0 = 1+KX x CX

где t/t0 - изменение латентного периода ХЛ; K X - константа изменения латентного периода для исследуемого вещества; C X - концентрация исследуемого вещества.

Все исследованные препараты имели хорошую линейную зависимость полученного уравнения (2) (коэффициент линейной корреляции 0,98-099).

В этом случае можно записать:

KX x CX = KT x CT

Используя уравнение (3) и рассчитанные по линейным уравнениям значения констант K X и K T , определяли величину антиоксидантной активности (АОА) препарата как отношение концентрации тролокса к концентрации исследуемого препарата в модельной системе:

AOA = C T / CX = KX / K T

Чем больше величина АОА у исследуемого препарата, тем эффективнее он перехватывает радикалы-инициаторы в данной модельной системе.

При перекисном окислении линолевой кислоты ингибирующее действие на этот процесс исследуемых веществ оценивали железо-тиоцианатным методом, абсорбцию красного цвета измеряли при 500 нм через 24 ч, когда она достигла максимального значения [7, 12].

Действие РК на электрическую проводимость плоских бислойных липидных мембран (БЛМ) оценивали традиционно, как описано ранее [2, 7]. Для формирования БЛМ использовали раствор азолектина в декане (25-30 мг/мл). Процесс образования липидного бислоя наблюдали в отраженном свете при помощи бинокулярного микроскопа МБС-1 (ОАО "ЛЗОС", Россия). Измерение электропроводности БЛМ проводили в растворе незабуференного 0,1 М водного раствора хлорида калия при комнатной температуре методом сравнения падения напряжения на эталонном сопротивлении и суммарном сопротивлении эталона и БЛМ. Входной регистр электрометра содержал набор сопротивлений от 10 7 до 10 9 Ом, что обеспечивало большую точность измерения. Стандартное измерительное напряжение равнялось 50 мВ. Величину электропроводности рассчитывали по формуле:



где Gм - электропроводность мембраны; U - напряжение, подаваемое от потенциометра; U’ - напряжение на выходе; Rэт - эталонное сопротивление.

При построении графиков использовали значение удельной электропроводности Gм/Sм, [Ом-1 × см-2 См × см-2], где Gм - интегральная проводимость мембраны, Sм - площадь мембраны.

В каждом случае было проведено не менее 3 независимых определений. Для математической обработки экспериментального материала использовали программу Microsoft Excel 7.0 с применением методов вариационной статистики и вычислением средней арифметической величины и t-критерия Стьюдента. Достоверными считались результаты при р<0,05.

Результаты и обсуждение

В основу исследования АОА розмариновой кислоты были положены 2 теста: система Hb-Н2О2 и система, содержащая азоинициаторы (нестойкие соединения, самопроизвольно распадающиеся с образованием свободных радикалов).

В основе обоих экспериментальных подходов лежит измерение ХЛ ЛМ при воздействии свободных радикалов, образующихся в системе либо в реакции гемоглобина с перекисью водорода, либо при распаде азоинициаторов. Добавление в изучаемую систему соединений, исследуемых на АОА, приводит к тому, что эти соединения начинают перехватывать радикалы и снижают интенсивность ХЛ [7, 12].

Как видно из данных, приведенных на рис. 2, РК эффективно перехватывает радикалы, вызывающие ХЛ в модельной системе Hb-H2O2 -ЛМ. Тушение ХЛ в этой системе обусловлено взаимодействием РК не столько с радикалами-инициаторами, сколько с радикалами, образующимися в последующих реакциях окисления ЛМ [7, 12]. В качестве одного из них следует назвать супероксидный анион-радикал, который является промежуточным продуктом в реакции свободнорадикального окисления ЛМ. Можно предположить, что РК, как водорастворимый антиоксидант, способна эффективно тушить ХЛ модельной системы, перехватывая супероксид-анион, и тем самым ингибировать инициацию СРР in vivo [7, 12].

Значения констант тушения ХЛ модельной системы Нb-Н 2 О 2 -ЛМ свидетельствуют о том, что РК по АОА в единицах тролокса приблизительно в 6 раз эффективнее аскорбиновой кислоты, но незначительно превосходит биофлавоноид дигидрокверцетин (табл. 1).

В качестве второй модельной системы для исследования антиоксидантных свойств РК мы использовали водную гомогенную систему на основе ААРН-ЛМ, образующую пероксильные радикалы [12]. Взаимодействие этих радикалов с ЛМ приводит к его окислению, сопровождающемуся ХЛ.

Как видно из данных, приведенных на рис. 3, судя по амплитуде и времени латентного периода ХМ, РК обладает высокой эффективностью тушения ХМ и в этой системе. Из данных правой части табл. 1 следует, что РК по параметрам АОА в системе ААРН-ЛМ более чем в 6,5 раза превосходит тролокс и приблизительно в 3 раза - дигидрокверцетин.

При определении защитной активности в отношении перекисного окисления линолевой кислоты с помощью железо-тиоцианатного метода [10] была изучена сравнительная эффективность ингибирующего действия тролокса, дигидрокверцетина и РК. Наибольшую активность проявила РК. Если все исследуемые вещества расположить в ряд по убывающей активности, то он будет иметь следующий вид: РК > ДГК > тролокс. При этом во многом потенциал антипероксильного действия исследуемых веществ напоминает их АОА в системе ААРН-ЛМ. Таким образом, РК демонстрирует как высокий антиоксидантный потенциал, так и выраженный защитный эффект при индуцированном ПОЛ. По этим показателям она заметно превосходит не только тролокс и аскорбиновую кислоту, но и дигидрокверцетин.

Учитывая выраженную АОА РК и ее способность защищать мембранные липиды от ПОЛ, представляло интерес изучить мембранотропные свойства этого полифенольного соединения, в частности проверить ее влияние на проницаемость модельных мембран. В табл. 2 представлены результаты оценки воздействия РК на электропроводность БЛМ. Как видно из этих данных, РК в широком диапазоне концентраций (от 0,5 до 10 мкг/мл) не оказывает достоверного влияния на проводимость модельных липидных мембран. Вполне вероятно, что РК является слабым индуктором функциональных нарушений проницаемости липидного бислоя и биологических мембран [7, 16, 17].

Полученные нами результаты по антиоксидантной и мембранотропной активности РК хорошо согласуются с данными французских авторов, которые недавно отметили высокую эффективность РК в предотвращении ПОЛ модельных липосомальных мембран из 1,2-дилинолеилглицеро-3-фосфатидилхолина (ДЛФХ). Они пришли к заключению, что молекулы РК локализуются главным образом в области полярных групп этого липида, но без значимого влияния на структурно-функциональные свойства модельного липидного бислоя. При этом для полного предотвращения ПОЛ вполне достаточно спонтанного включения 1 моль% РК в липосомы из ДЛФХ [11].

Однако АФК генерируются и при нормальных физиологических условиях, принимая активное участие в сигнальных клеточных системах. Очевидно поэтому в некоторых случаях нейтрализующее действие РК в отношении физиологических сигнальных доз АФК иногда может нести негативные последствия [8].

Таким образом, в основе антиоксидантного действия РК лежит ее способность ингибировать стадию инициации СРР ПОЛ, во многом обусловленную образованием АФК. В связи с этим РК как мощный и эффективный ингибитор АФК и ПОЛ имеет большие перспективы для широкого использования не только в медицине [5, 13], но и в пищевой промышленности для сохранения качества скоропортящихся продуктов питания [17].

Литература

1. Заводник И.Б., Дремза И.К., Лапшина Е.А., Чещевик В.Т. Сахарный диабет: метаболические эффекты и окислительный стресс // Биологические мембраны. - 2011. - Т. 28. № 2. - С. 83-94.

2. Корепанова Е.А., Попов А.М., Анисимов М.М., и др. Действие тритерпеновых гликозидов на ионную проницаемость холестерин-содержащих бислойных липидных мембран // ДАН СССР. - 1980. - Т. 252, № 5. - С. 1261-1264.

3. Кривошапко О.Н., Попов А.М., Артюков А.А. Применение биоантиоксидантов при нарушениях липидного и углеводного обмена // Здоровье. Мед. экология. Наука. - 2009. - Т. 39-40, № 4-5. - С. 86-89.

4. Кривошапко О.Н., Попов А.М. Лечебные и профилактические свойства липидов и антиоксидантов, выделенных из морских гидробионтов // Вопр. питания. - 2011. - № 2. - С. 4-8.

5. Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н. и др. Лечебные и профилактические свойства липидов и антиоксидантов, выделенных из морских гидробионтов // Мед. иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4-5. - С. 331-332.

6. Попов А.М., Кривошапко О.Н., Артюков А.А. Сравнительная оценка фармакологической активности лютеолина и 7,3′-дисульфата лютеолина при моделировании разных патологий // Биофармацевт. журн. - 2011. - Т. 3, № 4. - С. 27-33.

7. Попов А.М., Осипов А.Н., Корепанова Е.А. и др. Изучение антиоксидантной и мембранной активности розмариновой кислоты с использованием различных модельных систем // Биофизика. - 2013. - Т. 58, № 5. - P. 775-785.

8. Цыбульский А.В., Попов А.М., Артюков А.А., и др. Повышение иммуногенной активности вакцины Инфлювак при использовании адъювантных ТИ-комплексов, модифицированных эхинохромом А // Биомед. химия. - 2011. - Т. 57, № 3. - С. 341-325.

9. Alkam T., Nitta A., Mizoguchi H. et al. A natural scavenger of peroxynitrites, rosmarinic acid, protects against impairment of memory induced by Abeta(25-35) // Behav. Brain Res. - 2007. - Vol. 180, N 2. - Р. 139-145.

10. Chamulitrat W., Mason R.P. Lipid peroxyl radical intermediates in the peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenase. Direct electron spin resonance investigations // J. Biol. Chem. - 1989. - Vol. 264. - P. 20968-20973.

11. Fadel O., El Kirat K., Morandat S. Fadel O., El Kirat K., Morandat S. The natural antioxidant rosmarinic acid spontaneously penetrates membranes to inhibit lipid peroxidation in situ // Biochim. Biophys. Acta. - 2011. - Vol. 1808, N 12. - Р. 2973-2980.

12. Huang D., Ou B., Prior R.L. The chemistry behind antioxidant capacity assays // J. Agric. Food Chem. - 2005. - Vol. 53, N 6. - P. 1841-1856.

13. Kawai Y. Immunochemical detection of food-derived polyphenols in the aorta: macrophages as a major target underlying the anti-atherosclerotic activity of polyphenols // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2011. - Vol. 75, N 4. - P. 609-617.

14. van Kessel K. P., Kalter E. S. Verhoef J. Rosmarinic acid inhibits external oxidative effects of human polymorphonuclear granulocytes // Agents Actions. - 1986. - Vol. 17. - Р. 375-376.

15. Krivoshapko O. N., Popov A. M., Artyukov A. A., Kostetsky E. Y. Peculiarities of the corrective effects of polar lipids and bioantioxidants from sea hydrobionts in impairments of lipid and carbohydrate metabolism // Biochemistry (Moscow) Suppl. Ser. B: Biomedical Chemistry. - 2011. - Vol. 5, N 2. - P. 152-157.

16. Lee J., Jung E., Kim Y., Lee J., Park J., Hong S., Hyun C.G., Park D., and Kim Y. S. Rosmarinic acid as a downstream inhibitor of IKK-beta in TNF-alpha-induced upregulation of CCL11 and CCR3 // J. Pharmacol. - 2006. - Vol. 148. - Р. 366-375.

17. Li Z., Henning S.M., Zhang Y. et al. Antioxidant-rich spice added to hamburger meat during cooking results in reduced meat, plasma, and urine malondialdehyde concentrations // Am. J. Clin. Nutr. - 2010. - Vol. 91, N 5. - Р. 1180-1184.

18. Ngo S.N., Williams D.B., Head R.J. Rosemary and cancer prevention: preclinical perspectives // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. - 2011. - Vol. 51, N 10. - P. 946-954.

19. Petersen M., Simmonds M.S. J. Rosmarinic acid // Phytochemistry. - 2003. - Vol. 62, N 2. - P. 121-125.

20. Proctor L.M., Strachan A.J., Woodruff T.M., Mahadevan I.B., Williams H.M., Shiels I.A., Taylor S.M. Complement inhibitors selectively attenuate injury following administration of cobra venom factor to rats // Int. Immunopharmacol. - 2006. - Vol. 6, N 8. - P. 1224-1232.

21. Xu Y, Xu G, Liu L, Xu D, Liu G. J. Anti-invasion effect of rosmarinic acid via the extracellular signal-regulated kinase and oxidation-reduction pathway in Ls174-T cells // J. Cellular Biochem. - 2010. - Vol. 111, N 2. - Р. 370-379.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»