Антирадикальная активность продуктов переработки голотурии Cucumaria japonica и их практическое применение для стабилизации липидов

• Табакаева Оксана Вацлавовна
• Татьяна Кузьминична Каленик
• Табакаев Антон Вадимович

РезюмеПродукты технологической и биотехнологической модификации голотурии Дальневосточного региона кукумарии японской (Cucumaria japonica) являются сложными многокомпонентными системами, содержащими биологически активные вещества морского происхождения, что должно обеспечивать им биологическую активность. Цель исследования состояла в изучении антирадикальных свойств кислотных, ферментативных гидролизатов (КГ, ФГ) и гидротермических экстрактов (ГТЭ) из мягких тканей голотурии Дальневосточного региона Cucumaria japonica и их влияния на окисление липидов в масложировых эмульсионных продуктах. В качестве модельной системы использовали реакцию со стабильным свободным 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил радикалом. Радикалсвязывающая активность гидролизатов и экстрактов из Cucumaria japonica изменялась в пределах от 48 до 78%. Максимальная радикалсвязывающая активность отмечена у КГ. Активность гидролизата из венчика и щупалец Cucumaria japonica сравнима с активностью ионола. Определено, что антирадикальная активность зависит от способа технологической и биотехнологической обработки сырья. Изучение фракционного состава меланоидинов гидролизатов и экстрактов из Cucumaria japonica показало, что они разделяются на фракции с молекулярными массами около 10 000 и 1000 Да. Максимальное содержание меланоидинов определено в фракции массой около 1000 Да. Введение в состав масложировых эмульсионных систем КГ, ФГ и ГТЭ из Cucumaria japonica позволяет замедлить процессы окисления липидов и гидролиза триглицеридов майонеза. Введение в масложировой эмульсионный продукт гидролизатов и ГТЭ из Cucumaria japonica позволяет на 90-е сутки хранения снизить перекисное число на 22-45%, кислотное число на 12-35%. Наиболее существенно снижают скорость окисления и гидролиза КГ из Cucumaria japonica.

Ключевые слова:гидролизат, гидротермический экстракт, кукумария японская, антирадикальная активность, меланоидины, ионол, липиды, стабилизация, перекисное и кислотные числа

В настоящее время процессам свободнорадикального окисления уделяется все более пристальное внимание в связи с доказанным их влиянием на различные процессы метаболизма организма человека. Накопление свободных радикалов - продуктов неполного восстановления кислорода, избыток которых ведет к перекисному окислению липидов и, как следствие, нарушению функции клеточных мембран, приводит к преждевременному старению организма, частым болезням и даже образованию злокачественных опухолей [5].

Количественное изучение антирадикальных свойств различных веществ является актуальным направлением исследований, позволяющим определить пути практического использования веществ с антирадикальной активностью. Однако основное внимание при изучении антирадикальной активности отводится сырью растительного происхождения: эфирным маслам и их смесям, экстрактам лекарственных растений и др. [7, 11, 15]. В то же время сырье животного происхождения, в том числе морского, и продукты его технологической и биотехнологической модификации также могут обладать антирадикальными свойствами. Биологическая и фармакологическая активность органических природных соединений морского происхождения доказана многочисленными исследованиями [2, 8]. Многие виды морских организмов в настоящее время применяются в пищевых целях, в традиционной и нетрадиционной медицине, а также в качестве сырья для получения биологически активных добавок.

Из морских гидробионтов обращают на себя внимание в качестве источников биологически активных веществ, возможно, обладающих антирадикальными свойствами, представители класса голотурий, из них наиболее распространена в прибрежных водах Приморья кукумария японская (Cucumaria japonica). Ткани голотурий содержат гликозиды, по составу сходные с гликозидами женьшеня [1, 6, 12].

Антирадикальные свойства продуктов технологической и биотехнологической модификации голотурий могут быть основанием для их использования в качестве компонентов в масложировой эмульсионной продукции с целью снижения скорости окисления липидов.

Процессы окисления липидов, протекающие в масложировых продуктах, в том числе эмульсионных, нежелательны, так как они приводят к ухудшению не только органолептических показателей качества, но и к снижению безопасности употребления продукта. В настоящее время существуют способы стабилизации липидов растительных масел, основанные на введении в их состав различных синтетических веществ, выполняющих функцию антиоксидантов, таких как диэтилдитиофосфат калия или 2,4,6-трис-(диметиламино)-фенол или их смеси с ионолом, нафтолы, пропилгаллаты, комплексообразующие вещества хелатного типа на основе фосфоновых или карбоксилсодержащих кислот или их производных. Недостаток этих стабилизаторов состоит в том, что они не всегда достаточно эффективны и в то же время не лишены токсических свойств [16].

Гораздо более эффективным является использование для стабилизации качества пищевых жиросодержащих продуктов антиоксидантов натурального происхождения, например эфирных масел, продуктов переработки растительного и животного, в том числе морского, сырья с выраженными антиоксидантными свойствами.

Целью работы было изучение антирадикальных свойств кислотных (КГ), ферментативных гидролизатов (ФГ) и гидротермических экстрактов (ГТЭ) из мягких тканей голотурии Дальневосточного региона Cucumaria japonica и оценка их влияния на окисление липидов в масложировых эмульсионных продуктах.

Материал и методы

В качестве объектов исследования использованы КГ, ФГ и ГТЭ из мускульной оболочки, венчика и щупалец Cucumaria japonica, а также масложировой эмульсионный продукт (майонез) с их использованием.

КГ из тканей Cucumaria japonica получали обработкой предварительно измельченного сырья (диаметр частиц 3-7 мм) 6% раствором лимонной кислоты, продолжительность обработки 7-8 ч, температура 95-100 °С.

ФГ получали с использованием ферментного препарата протомегатерин Г20х (ТУ 00479942002-94, Россия) с протеолитической активностью (ПЕ) 800 ед/г. Измельченное сырье подвергали гидролизу при температуре 45 °С в течение 7-8 ч, рН 7,5, соотношение воды и сырья 1:2, соотношение фермент - субстрат 5:1000. По окончании гидролиза полученную жидкую фазу отделяли фильтрованием и кипятили для инактивации фермента в течение 20 мин.

ГТЭ получали путем высотемпературной обработки сырья в водном растворе (соотношение воды и сырья 1:1, размер частиц 5-10 мм, температура 95-100 °С, продолжительность обработки 180 мин).

Масложировой эмульсионной продукт (майонез) получали по традиционной технологии полугорячим способом. Содержание жировой фазы в майонезе составило 67%. Продукты технологической и биотехнологической переработки мускульной оболочки Cucumaria japonica вводили в водную фазу продукта в массовой доле: 12% (КГ), 18% (ФГ), 20% (ГТЭ). В качестве контроля использовали майонез с содержанием жира 67% без введения гидролизатов и ГТЭ.

Для фракционирования меланоидинов использовали метод гель-хроматографии на колонках с TSK-гелями Toypearl HW-40 и HW-50 ("Toyo Soda", Япония), предварительно откалиброванных по белкам с известными молекулярными массами. Использованные гели имеют следующие диапазоны разделения по молекулярным массам для белков: на HW-40 происходит разделение белков с молекулярными массами от 100 до 10 000 Да, на HW-50 - от 500 до 80 000 Да.

В качестве элюента применяли 0,2 М раствор хлорида натрия и дистиллированную воду. На колонку (1,2×35 см, свободный объем 12 мл) наносили по 0,4 мл предварительно обезжиренного хлороформом образца.

Оптическую плотность фракций объемом 1 мл измеряли на спектрофотометре VSU-2P ("Netzsch", Германия) при длинах волн 400 и 420 нм. Расчет содержания меланоидинов осуществляли по формулам, выведенным на основании стандартной кривой [13].

В составе меланоидинов, полученных модификаций из голотурии Cucumaria japonica, с помощью качественных реакций проверяли наличие или отсутствие пиридиновых, пиразиновых, пиррольных и фурановых структур. Наличие пиридиновых структур определяли реакцией с сульфатом меди и роданидом аммония с последующим фотометрированием продуктов реакции при длине волны 450 нм. Наличие пиразиновых структур устанавливали реакцией образования труднорастворимого осадка пиразиновых структур с хлоридом ртути.

Для обнаружения пиррола проводили 2 специфические реакции: с реактивом Эрлиха, с которым пиррол дает красную окраску, и с азатином, когда образуется темно-синий осадок. Наличие фуранового кольца определяли по присутствию фурфурола, как наиболее часто встречаемого производного фурана, по качественной реакции с ацетатом анилина [14].

Антирадикальные свойства оценивали по способности взаимодействовать со стабильным свободным 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) радикалом in vitro. Определение проводили в реакционной смеси, содержащей 3 мл 0,3 мМ ДФПГ в этаноле, 1 мл 50 мМ трис-HCl буфера, рН 7,4 и 1 мл экстракта или гидролизата [14]. После 30 мин инкубации при комнатной температуре регистрировали значения оптической плотности при λ=517 нм. Исследования проведены на спектрофотометре "Specord UV VIS" ("Analytik Jena", Германия) в кюветах l=1 см при Т=298 °К.

Активность характеризовали следующими показателями:

- радикалсвязывающая активность (РСА), которую рассчитывали по формуле:

РСА (%) = (D₅₁₇I - D₅₁₇II)/D₅₁₇I × 100, (1)

где D₅₁₇I - контроль, D₅₁₇II - образец;

- эффективная концентрация вещества, при которой восстанавливается 50% свободных радикалов ДФПГ (Е С50 );

- время восстановления половины количества радикала (Т EC50 ), мин;

- антирадикальная эффективность (АЕ) - характеристика, связывающая Т EC50 и необходимую для этого концентрацию субстрата (Е С50 ), которую рассчитывали по формуле:

AE = 1/(Е_C50 × T_EC50). (2)

Антирадикальные свойства сравнивали с эффектом известного синтетического антиоксиданта ионола (2,6-дитретбутил-4-метил-фенол), который предварительно очищали перекристаллизацией из этанола, выделенные кристаллы сушили и возгоняли в вакууме.

Определение кислотного числа липидов, выделенных из масложирового эмульсионного продукта, осуществляли нейтрализацией свободных жирных кислот, содержащихся в навеске исследуемого масла, спиртовым раствором гидрооксида натрия [3].

Определение перекисного числа липидов, выделенных из масложирового эмульсионного продукта, осуществляли титриметрическм методом путем количественного определения раствором тиосульфата натрия выделившегося йода при взаимодействии продуктов окисления липидов (перекисей и гидроперекисей) с йодистым калием в растворе уксусной кислоты и хлороформа [4].

Статистическая обработка данных. Экспериментальные данные представлены в виде среднего арифметического (М) и стандартной ошибки среднего (m). Все исследования проводились в 3-5-кратной повторности. Статистическую обработку проводили с использованием пакетов прикладных статистических программ Excel, Statistica 7.0. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента при 95% уровне значимости.

Результаты и обсуждение

Гидролизаты и ГТЭ из Cucumaria japonica представляют собой жидкость от светло- до темнокоричневого цвета, с характерным невыраженным запахом. Содержание сухих веществ составляет 14,3-15,2% в КГ, 7,5-8,1% в ФГ, 5,1-5,5% в ГТЭ.

Основную часть составляют углеводы и азотсодержащие вещества (белки, пептиды, свободные аминокислоты).

Оценка антирадикальной активности полученных гидролизатов и экстрактов из Cucumaria japonica, а также известного антиоксиданта ионола показала, что все изученные объекты обладают достаточно высокой способностью связывать радикал ДФПГ (рис. 1).

Радикалсвязывающая активность гидролизатов и экстрактов из кукумарии изменялась в широких пределах: от 48 до 78%. Максимальный показатель отмечен у КГ, причем активность гидролизата из венчика и щупалец на 11% выше, чем гидролизата из мускульной оболочки, и всего на 14% ниже активности ионола. Минимальную антирадикальную активность проявляют ГТЭ, и это характерно для экстрактов, полученных из различных частей кукумарии. ФГ обладают антирадикальной активностью ниже, чем у КГ, но немного выше, чем у ГТЭ.

Проведенные исследования показали, что на уровень проявления антирадикальных свойств более существенно влияет способ модификации тканей Cucumaria japonica, чем используемое биосырье. Полученные данные представлены в таблице.

При изучении антирадикальных свойств смеси веществ, которыми являются гидролизаты и экстракты из кукумарии, необходимо определить, какие вещества или группы веществ отвечают за проявление данных свойств. Для сырья животного происхождения известно, что меланоидины и свободные аминокислоты проявляют антирадикальные свойства [15].

Ранее проведенными исследованиями [15, 16] показано, что получаемые в результате кислотного гидролиза тканей мидий гидролизаты содержат свободные аминокислоты, амины, дипептиды, свободные жирные кислоты, минеральные вещества, а также высокомолекулярные вещества, которые представлены двумя фракциями: I - молекулярная масса 1500-6000 Да и II - масса менее 1500 Да. Причем биологическая активность II фракции выражена существенно сильнее, чем у I. Доказано, что II фракцию составляют меланоидины, обладающие биологической активностью.

Исходя из установленного ранее химического состава Cucumaria japonica, в частности наличия белков и углеводов, и предположения о протекании реакции меланоидинообразования, изучен фракционный состав высокомолекулярных веществ, полученных из КГ, ФГ и ГТЭ.

Установлено, что высокомолекулярные вещества гидролизатов и ГТЭ разделяются на 3 фракции, причем 2 из них представлены веществами с молекулярными массами - около 10 000 Да, молекулярная масса III фракции около 1000 Да.

Максимальное содержание меланоидинов определено в III фракции, фракции I и II содержат небольшое количество меланоидинов. КГ из венчика и щупалец Cucumaria japonica характеризуется самым высоким содержанием меланоидинов в III фракции.

Количественное соотношение фракций меланоидинов в исследованных гидролизатах и экстрактах графически представлено на рис. 2.

Поскольку известно, что меланоидины не являются четко определенными веществами, чтобы объяснить их антирадикальную активность исследовали наличие пиррольных, пиридиновых и пиразиновых структур, а также фуранового кольца и фенольных гидроксилов. Определено, что в высокомолекулярной фракции присутствует небольшое количество фенолов (около 1%), в составе низкомолекулярной - в 2-3 раза больше.

С помощью качественных реакций установлено, что в выделенных фракциях присутствуют гетероциклические азотсодержащие структуры (пиразины, пиридины), а также кислородсодержащие соединения - фурановые структуры. Пиррольные структуры в составе меланоидинов гидролизатов и экстрактов не обнаружены.

Исследование влияния гидролизатов и ГТЭ из голотурии Cucumaria japonica на перекисное число жира, выделенного из масложировых эмульсионных продуктов, показало, что при введении данных компонентов в состав майонеза и соуса майонезного происходит снижение его значения по сравнению с контролем (рис. 3).

Как видно из рис. 3, в процессе хранения происходит окисление жировой фазы майонеза с образованием первичных продуктов окисления - перекисей и гидроперекисей, причем значение перекисного числа находится в прямой зависимости от срока хранения. Введение в состав майонеза продуктов технологической и биотехнологической модификации Cucumaria japonica существенно тормозит процессы окисления липидов майонеза, о чем свидетельствует снижение перекисного числа по сравнению с контролем для всех исследованных образцов. Минимальное перекисное число на протяжении всего срока хранения определено для жира, выделенного из майонеза с использованием КГ из Cucumaria japonica, что хорошо коррелирует с высокими антирадикальными свойствами гидролизата, установленными раннее. ГТЭ и ФГ из Cucumaria japonica при введении в майонез также уменьшают перекисное число липидов масложирового эмульсионного продукта пропорционально их антирадикальным и антиоксидантным свойствам, описанным выше. Введение в масложировой эмульсионный продукт гидролизатов и ГТЭ из Cucumaria japonica позволяет снизить перекисное число (на 90-е сутки хранения) на 22-45%.

Динамика изменения кислотного числа жира, выделенного из майонеза с добавками продуктов переработки Cucumaria japonica, в процессе хранения по сравнению с таковой у майонеза без добавок представлена на рис. 4.

Полученные экспериментальные данные показывают, что в процессе хранения кроме окисления жировой фазы майонеза наблюдается гидролиз триглицеридов с образованием свободных жирных кислот: кислотное число липидов, выделенных из майонеза, возрастает в процессе хранения. Введение в состав майонеза КГ, ФГ и ГТЭ из Cucumaria japonica замедляет гидролиз триглицеридов майонеза, о чем свидетельствует снижение кислотного числа майонеза по сравнению с контролем для всех исследованных образцов. Минимальное кислотное число на протяжении всего срока хранения определено для жира, выделенного из майонеза с использованием КГ из Cucumaria japonica. Введение в масложировой эмульсионный продукт гидролизатов и ГТЭ из Cucumaria japonica позволяет снизить кислотное число (на 90-е сутки хранения) на 12-35%.

Заключение

Гидролизаты и ГТЭ голотурии Дальневосточного региона Cucumaria japonica обладают антирадикальной активностью, уровень проявления которой зависит от способа биотехнологической обработки. Определение антирадикальной активности с использованием стабильного свободного ДФПГ радикала показало, что максимальными антирадикальными свойствами обладают КГ, вероятно, за счет более высокого содержания в них низкомолекулярных фракций меланоидинов.

Введение в состав масложировых эмульсионных систем КГ, ФГ и ГТЭ из Cucumaria japonica позволяет замедлить процессы окисления липидов и гидролиза триглицеридов майонеза. Наиболее существенно снижают скорость окисления и гидролиза КГ из Cucumaria japonica.

Работа поддержана Российским научным фондом (проект № 14-50-00034).

Литература

1. Авилов С.А., Калинин В.И., Дроздова В.А. Новые тритерпеновые гликозиды из голотурии Cladolabes sp. // Химия природ. соединений. - 1993. - № 2. - С. 49-52.

2. Барильяк И.Р., Ольшевская О.Д., Лебская Т.К., Толкачева В.Ф. Медико-биологические исследования концентрата каротиноидов из североатлантического морского огурца Cucumaria frondosa // Вопр. питания. - 1999. - Т. 68, № 3. - С. 15-18.

3. ГОСТ Р 50457 (ИСО- 660) Жиры и масла животные и растительные. Определение кислотного числа и кислотности. - М.: Стандартинформ, 1993. - 6 с.

4. ГОСТ Р 53595 Майонезы и соусы майонезные. Правила приемки и методы испытаний. - М.: Стандартинформ, 2011. - 32 с.

5. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. - М.: Наука, 2001. - 342 с.

6. Калинин В.И., Левин B.C., Стоник В.А. Химическая морфология: тритерпеновые гликозиды голотурий. - Владивосток: Дальнаука, 1994. - 284 с.

7. Мишарина Т.А., Теренина М.Б., Крикунова Н.И. Оценка антирадикальных свойств корня имбиря // Прикл. биохимия и микробиология. - 2009. - Т. 45, Т 6. - С. 710-716.

8. Мульгидин В.А., Ковалев В.В. Влияние экстракта внутренних органов голотурии Cucumaria japonica на показатели неспецифической резистентности // Биология моря. - 2001. - Т. 27, № 6. - С. 25-28.

9. Новикова М.В., Рехина Н.И., Беседина Т.В., Королев А.Н. Пищевая биологически активная добавка из мидий // Вопр. питания. - 1998. - № 1. - С. 10-13.

10. Рехина Н.И., Терентьев В.А., Новикова М.В. и др. Меланоидиносодержащий препарат МИГИ-К из мидий и некоторые его характеристики // Биологические науки. - 1991. - № 10. - С. 47-51.

11. Смирнова Г.В., Самойлова З.Ю., Кукушкина Т.А. Антиоксидантные свойства экстрактов лекарственных растений Западной Сибири // Прикл. биохимия и микробиология. - 2009. - Т. 45, № 6. - С. 705-709.

12. Стоник В.А. Морские физиологически активные вещества // Вестн. ДВО РАН. - 1999. - № 4. - С. 25-33.

13. Черных В.П. Общий практикум по органической химии. - Харьков: Издательство НФАУ "Золотые страницы", 2002. - 592 с.

14. Brands C.M., Wedzicha B.L., Boekel M.A. Quantification of melanoidin concentration in sugar-casein systems // J. Agric. Food Chem. - 2002. - Vol. 50, N 5. - P. 1178-1183.

15. Kim H.J., Chen F., Wang X. et al. Evaluation of antioxidant activity of vetiver (Vetiveria zizanioides L.) oil and identification of its antioxidant constituents // J. Agric. Food Chem. - 2005. - Vol. 53. - P. 7691-7695.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)