Полифенолы винограда культурного, содержащиеся в кожице, мякоти и семечке виноградной ягоды, определяют антиоксидантную активность продуктов его переработки, которые, поступая в организм человека с питанием, препятствуют процессам перекисного окисления в биомембранах, повышают антиоксидантный статус и снижают риск возникновения заболеваний сердечно-сосудистой и дыхательной систем (атеросклероз, ишемическая болезнь, бронхит, бронхиальная астма, эмфизема, ревматизм), стресса, аллергии, лучевой болезни, отравления, старения организма, сахарного диабета и других нарушений обмена веществ [1, 2]. Условно полифенолы продуктов переработки красных сортов винограда можно распределить на две группы: флавоноидные и нефлавоноидные полифенолы.
Флавоноиды включают такие соединения, как антоцианы, флавоны, мономерные и олигомерные (процианидины) и полимерные (танины) флаван-3олы. Нефлавоноидные полифенолы представлены в основном оксикоричными и оксибензойными кислотами [3]. Среди групп полифенолов, присутствующих в продуктах переработки винограда в значительных объемах, можно выделить флаван3-олы и галловую кислоту, являющиеся наиболее мощными антиоксидантами среди полифенолов винограда [4, 5].
Систематизированные данные о качественном и количественном составе полифенолов продукции из массовых красных сортов винограда для промышленной переработки, таких как "КабернеСовиньон", "Саперави", "Мерло", а также сведения, характеризующие антиоксидантную активность этой продукции, отсутствуют, что затрудняет оценку перспектив ее применения для здорового питания.
Цель исследования - установить экспериментально антиоксидантную активность, а также качественный и количественный состав полифенолов в продукции из красных сортов винограда "Каберне-Совиньон", "Саперави", "Мерло".
Материал и методы
При проведении исследований использовали сок, вино, пищевые концентраты полифенолов из винограда сортов "Каберне-Совиньон", "Саперави", "Мерло", произведенные в Крыму и на Кубани, полученные от производителей, урожая 2014 г.
Хранили вина при температуре, не превышающей +16 оС, и относительной влажности 65-80%, пищевые концентраты полифенолов винограда - при температуре +5-+20 оС и относительной влажности воздуха 65-80%.
Качественный и количественный состав полифенолов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием хроматографической системы "Agilent Technologies 1100" ("Agilent", США) с диодно-матричным детектором. Для разделения веществ использовали хроматографическую колонку Zorbax SB-C18 размером 2,1×150 мм, заполненную силикагелем с привитой октадецилсилильной фазой с размером частиц сорбента 3,5 мкм. Анализ проводили в градиентом режиме.
Состав элюента: раствор А - метанол, раствор В - 0,6% водный раствор трифторуксусной кислоты.
Состав элюента в ходе анализа изменялся по следующей схеме (по содержанию компонента В): 0 мин - 8%; 0-8 мин - 8-38%; 8-24 мин - 38-100%; 24-30 мин - 100%; скорость протока элюента - 0,25 мл/мин. Объем вводимой пробы - 1 мкл. Хроматограммы регистрировали при следующих длинах волн: 280 нм для галловой кислоты, (+)-D-катехина, (-)-эпикатехина и процианидинов, 313 нм для производных оксикоричных кислот, 371 нм для кверцетина и 525 нм для антоцианов. Идентификацию веществ производили путем сравнения их спектральных характеристик времени удерживания с аналогичными характеристиками стандартов. Спектральные характеристики отдельных веществ получали с использованием данных литературы [6-8].
Количественное содержание индивидуальных компонентов рассчитывали с использованием калибровочных графиков зависимости площади пика от концентрации вещества, построенных по растворам индивидуальных веществ. Содержание антоцианов определяли в пересчете на хлорид мальвидин-3-О-глюкозида, содержание кафтаровой кислоты - в пересчете на кофейную кислоту, содержание полимерных и олигомерных процианидинов производили в пересчете на (+)D-катехин. Все определения проводили в трех повторностях.
В качестве стандартов использовали галловую кислоту, кофейную кислоту, (+)-D-катехин, хлорид мальвидин-3-О-глюкозида, кверцетин дигидрат, изокверцитрин ("Fluka Chemie AG", Швейцария) и (-)-эпикатехин, сиреневую кислоту ("SigmaAldrich", Швейцария).
Результаты исследований обрабатывали стандартными методами математической статистики [9].
Массовую концентрацию фенольных веществ определяли колориметрическим методом, основанным на том, что реактив Фолина-Чокальтеу при добавлении в исследуемый продукт окисляет фенольные группы, восстанавливаясь при этом в соединение голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации фенольных веществ.
Исследуемый концентрат полифенолов винограда разбавляли в 100 раз. В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещали 1 см3 исследуемого раствора, добавляли 1 см3 реактива Фолина-
Чокальтеу, 10 см3 раствора карбоната натрия. Доводили дистиллированной водой до метки при температуре 20±0,5 °С и перемешивали. Через 30-40 мин измеряли оптическую плотность растворов в кювете 10 мм при длине волны 670 нм против контрольного раствора на колориметре фотоэлектрическом "КФК-2" (ЗОМЗ, РФ). Значение массовой концентрации фенольных веществ в мг/дм3 по галловой кислоте определяли по градуировочной кривой [10].
За окончательный результат принимали среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не превышало (для диапазона измерений 3000-20 000 мг/дм3) 33 мг/дм3. Предел погрешности при доверительной вероятности р=0,95 для диапазона измерения 3000-20 000 мг/дм3 составлял ±39 мг/дм3.
Определения проводили в 3 повторностях.
Для оценки антиоксидантной активности образцов продукции (сока, вина, концентратов) использовали амперометрический метод измерения массовой концентрации антиоксидантов по стандартному антиоксиданту тролоксу (Trolox) на приборе "Цвет-Яуза 01-АА" (НПО "Химавтоматика", РФ) по ГОСТ Р 54037 [11].
Для проведения биолюминесцентного анализа антиоксидантной активности использовали светящиеся бактерии Photobacterium leiognathi Sh1 из коллекции Медицинской академии, Крымского федерального университета [12]. Биотестирование проводили по методикам оценки острого и хронического действий образцов на биолюминесценцию тест-бактерий (рис. 1А, Б).
&hide_Cookie=yes)
Подготовку бактериальных культур для биотестирования антиоксидантной активности проводили, как описано ранее [12]. Для определения острого действия образцов (см. рис. 1А) в кюветах люминометра смешивали 0,8-0,9 мл тестируемого виноматериала в 3% NaCl, 100 мкл фосфатного буферного раствора, рН 7,0 и 50-200 мкл бактериальной суспензии до конечной концентрации 5×105 кл/мл. Изменение интенсивности биолюминесценции регистрировали в течение 30 мин с использованием биолюминометра "БЛМ 8801" (СКТБ "Наука", РФ) с самописцем. Интенсивность действия выражали в виде значений биолюминесценции при определенной концентрации образцов (мг/мл, для растворов индивидуальных веществ) или их разведения (V/V, для растворов неизвестного состава).
Хроническое действие определяли как влияние тестируемого объекта на рост и биолюминесценцию P. leiognathi Sh1. Для этого после измерения острого воздействия в пробы дополнительно вносили 20-50 мкл стерильной питательной среды для светящихся бактерий ("Himedia", Индия, с добавлением NaCl до конечной концентрации 3%) и помещали их в термостат при температуре 30 °С. После инкубации в течение 18 ч измеряли интенсивность биолюминесценции, как описано выше (см. рис. 1Б).
Результаты и обсуждение
Экспериментальные данные по качественному и количественному составу полифенолов винограда, антиоксидантной активности соков, вин и концентратов полифенолов из винограда "Каберне-Совиньон", "Саперави", "Мерло" приведены в табл. 1 и 2.
&hide_Cookie=yes)
Как видно из данных табл. 1 и 2, сведения литературы о флавоноидной и нефлавоноидной природе полифенолов красных сортов винограда находят подтверждение в наших опытах.
&hide_Cookie=yes)
Флавоноиды представлены антоцианами в форме гликозидов дельфинидина, мальвидина, цианидина, петунидина, пеонидина, а также кверцетином и его гликозидом, (+)-D-катехином, (-)-эпикатехином. В значительном количестве присутствуют олигомерные процианидины, представляющие собой конденсированные катехиновые единицы (2-6), растворимые в воде, а также полимерные процианидины с количеством катехиновых единиц более 7, не растворимые в воде. Полимерные процианидины составляют основную часть полифенолов вина и концентратов из красных сортов винограда, находятся в продукции в лабильном состоянии; в соке наблюдается полное отсутствие олигомерных и полимерных процианидинов, как известно, обладающих многообразной биологической активностью [13].
Среди нефлавоноидных полифенолов идентифицированы оксибензойные (галловая, сиреневая) и оксикоричные (кафтаровая, каутаровая) кислоты, относительное содержание которых в сумме полифенолов максимально в соке, минимально в концентратах.
Сумма фенольных веществ в образцах продукции, найденная по данным ВЭЖХ и колориметрически (по реактиву Фолина-Чокальтеу), в пересчете на галловую кислоту систематически различается, что, по-видимому, связано с большей чувствительностью методики ВЭЖХ.
Оценка антиоксидантной активности in vitro амперометрическим методом по ГОСТ Р 54037 [11] показала, что величина антиоксидантной активности в единицах тролокса возрастает по мере увеличения концентрации полифенолов в продукции (см. табл. 1, 2). При этом данные табл. 1 и 2 по величинам антиоксидантной активности и массовой концентрации фенольных веществ аппроксимируются уравнением с коэффициентом корреляции R=0,9952:
Y=0,53627+0,1395X+0,080439X2-0,00064708X3,
где: Y - антиоксидантная активность, г/дм3 в пересчете на тролокс; X - массовая концентрация фенольных веществ по Фолину-Чокальтеу, г/дм3.
Уравнение справедливо в пределах варьирования 1,0-82,67 г/дм3 по фенольным веществам и 0,76-196,22 г/дм3 антиоксидантной активности. Уравнение, обобщающее величины антиоксидантной активности в широком диапазоне изменения концентрации полифенолов для сока, вина и концентратов из красных сортов винограда "Каберне-Совиньон", "Саперави", "Мерло" позволяет косвенно оценить биологическую активность продукции при наличии банка данных, полученных для этой продукции in vivo.
Антиоксидантную активность образцов исследовали также на биологической модели люминесцентных бактерий, которые представляют собой разнородную группу микроорганизмов, объединенных по способности излучать видимый свет.
Большинство представителей этой группы являются морскими бактериями, которые обитают практически во всех акваториях мирового океана.
Бактериальная биолюминесценция представляет собой ферментативный процесс, сопровождающийся потреблением кислорода и выделением света. В общем виде химизм реакции генерации свечения может быть представлен как окисление восстановленного флавинмононуклеотида (ФМН H2) до ФМН с одновременным окислением длинноцепочечного алифатического альдегида (RCHO) до соответствующей жирной кислоты (RCOOH) [14]:
ФМН H2+O2+RCHO → ФМН+H2O+RCOOH+ фотон (495 нм).
Традиционно светящиеся морские бактерии широко используются для биотестирования, в частности для оценки биотоксичности. Принцип биолюминесцентных тестов заключается в инкубировании люминесцирующих бактерий в анализируемых средах, содержащих вещество или смеси веществ, способных оказать влияние на физиологическое состояние бактериальных клеток. Соответственно, возможными реакциями являются отсутствие изменения уровня свечения, его повышение или снижение, в последнем случае обычно интерпретируемое как развитие токсического эффекта. При этом в случае исследования образцов неизвестного состава, регистрируемый отклик неспецифичен, так как отражает реакцию на всю совокупность присутствующих в пробе химических веществ [14-16].
В данной работе люминесцентные бактерии были использованы для биотестирования антиоксидантных свойств виноматериалов. При этом биолюминесцентная реакция бактерий с участием фермента люциферазы рассматривалась как модельная окислительная система и ее ингибирование как результат антиокислительного действия [17, 18]. Учитывая, что бактерии реагируют изменением свечения на самые различные факторы, в том числе биоцидные, одновременно с антиоксидантной активностью тест показывал и наличие антибактериальных свойств виноматериалов, что можно считать дополнительным преимуществом такого подхода.
На первом этапе для испытания люминесцентных бактерий в качестве модели для изучения антиоксидантной активности изучали воздействие двух модельных антиоксидантов: галловой кислоты (нефлавоноидное фенольное соединение) и кверцетина (флавоноид) на интенсивность бактериальной люминесценции. В качестве водорастворимой формы кверцетина использовали фармацевтический препарат корвитин (ПАО НПЦ "Борщаговский ХФЗ", Украина), представляющий собой комплекс кверцетина с поливинилпирролидоном.
Оба препарата оказывали сходное ингибирование биолюминесценции бактерий, которое отмечалось через 10 мин (рис. 2А) и усиливалось при 18-часовом тесте на хроническое действие (рис. 2Б). В последнем случае наблюдалось также увеличение хронического эффекта корвитина по сравнению с галловой кислотой.
&hide_Cookie=yes)
Далее было изучено действие образцов виноматериалов и виноградных концентратов на биолюминесценцию фотобактерий (рис. 3). Результаты оценки острого действия (10 и 30 мин) показали более сильное воздействие концентратов ("Эноант", "Эноант Премиум", "Фэнокор") по сравнению с образцами вин.
&hide_Cookie=yes)
При использовании 18-часового биотеста на хроническое действие наблюдалось изменение в активности полифенольных концентратов (рис. 4). Если при 10- и 30-минутных тестах ингибирование биолюминесценции "Эноантами" и "Фэнокором" было практически одинаково, то при в 18-часовом тесте отмечалось усиление действия в ряду "Эноант" (6) - "Эноант Премиум" (4) - "Фэнокор" (5), что совпадает с увеличением содержания в них полифенольных антиоксидантов, а также с увеличением общей антиоксидантной активности.
&hide_Cookie=yes)
Представлялось интересным установить корреляционные зависимости между показателями антиоксидантной активности в биологическом тесте по ингибированию бактериальной биолюминесценции и данными по содержанию фенолов согласно ВЭЖХ, фотоколориметрическому методу и общей антиоксидантной активности по тролоксу. Как видно из табл. 3, между результатами биотестирования на светящихся бактериях и значениями антиоксидантной активности, полученными другими методами, наблюдается достаточно строгая обратная корреляция. Более высокое содержание антиоксидантов в образцах приводило к более сильному ингибированию бактериальной биолюминесценции и более низким показателям интенсивности свечения тест-бактерий. Наиболее высокие коэффициенты корреляций 0,75-0,81 наблюдались при использовании значений биолюминесценции при 18-часовом тесте на хроническое действие и при разведении образца в 1000 раз (0,001).
&hide_Cookie=yes)
Таким образом, в работе проведен качественный и количественный физико-химический анализ антиоксидантной активности продуктов переработки красных сортов винограда "КабернеСовиньон", "Мерло", "Саперави", получено экспериментальное уравнение для расчетов антиоксидантной активности образцов в единицах тролокса.
Показана достоверность биотеста на люминесцентных тест-бактериях Photobacterium leiognath Sh1 для оценки антиоксидантной активности виноматериалов и виноградных концентратов.
Коэффициенты корреляции значений антиоксидантной активности, полученных с использованием биотеста на светящихся бактериях (хроническое действие, 18 ч), с данными ВЭЖХ, результатами определения по Фолину-Чокальтеу и тролоксу составляли 0,75-0,81.
Статья выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России.
Уникальный идентификатор ПНИ RFMEFI60414X0077 при подписании Соглашения № 14.604.21.0077.
Литература
1. Яшин Я.И., Рыжнев В.Ю., Яшин А.Я., Черноусова Н.И.. Природные антиоксиданты. Содержание в пищевых продуктах и их влияние на здоровье и старение человека. М.: ТрансЛит, 2009. 192 с.
2. Биологические активные вещества винограда и здоровье : монография / под общ. ред. А.Л. Загайко. Харьков : Форт, 2012. 404 с.
3. Огай Ю.А., Алексеева Л.М., Сиказан О.М., Катрич Л.И. Полифенольные биологически активные компоненты пищевого концентрата "Эноант" // Материалы конференции "Биологически активные природные соединения винограда - III: Гигиенические и медицинские эффекты применения продуктов с высоким содержанием полифенолов винограда". Ялта, 17-18 декабря 2004 г. URL: http://enoant.info/_pdf/_sb2/3_enoant_ info_Ogay.pdf.
4. Bombardelli E., Morazzoni P. Vitis vinifera L. // Fitoterapia. 1995. Vol. LXVI, N 4. P. 291-317.
5. Teissedre P.L., Walzem R.L., Waterhouse A.L., Cterman J.B. et al. Composes phenoliques durasin, duvinetsante // Revue des Oenologues. 1996. Vol. 79. P. 7-14.
6. Bagchi D., Bagchi M., Stohs S.J., Das D.K. et al. Free radicals and grape seed proanthocyanidn extract: importance in human health and disease prevention // Toxicology. 2000. Vol. 148. P. 187-197.
7. Bagchi D., Sen C.K., Ray S.D., Dipak K. et al. Molecular mechanisms of cardioprotection by a novel grape seed proanthocyanidin extract // Mutat. Res. 2003. Vol. 523. P. 87-97.
8. Woodring P. J., Edwards P.A., Chisholm M.G. HPLC determination of nonflavonoid phenols in vidal blanc wine using electrochemical detection // J. Agric. Food Chem. 1990. Vol. 38. P. 729-732.
9. Лакин Г.Ф. Биометрия : учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М. : Высш. шк., 1990. 352 с.
10. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. Руководство Р 4.1.1672.
11. ГОСТ З 54037-2010 Продукты пищевые. Определение содержания водорастворимых антиоксидантов амперометрическим методом в овощах, фруктах, продуктах их переработки, алкогольных и безалкогольных напитках.
12. Кацев А.М. Новые термофильные люминесцентные бактерии, выделенные из Азовского моря // Таврический медико-биологический вестн. 2014. Т. 17, № 2. С. 59-64.
13. В.Г. Спрыгин, Н.Ф. Кушнерова. Природные олигомерные процианидины - перспективные регуляторы метаболических нарушений // Вестн. ДВО РАН. 2006. № 2. С. 81-90.
14. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М. : Наука, 2009. 248 с.
15. Berest G.G.,Voskoboynik O.Y., Kovalenko S.I.,Nosulenko I.S. et al. Synthesis of New 6-{[ω-(Dialkylamino(heterocyclyl)alkyl]thio}-3-R-2H- [1,2,4]triazino[2,3-c]quinazoline-2-ones and evaluation of their anticancer and antimicrobial activities // Sci. Pharm. 2012. Vol. 80, N 1. P. 37-65.
16. Antipenko L.N., Karpenko A.V., Kovalenko S.I., Katsev A.M. et al. Synthesis, cytotoxicity by bioluminescence inhibition, antibacterial and antifungal activity of ([1,2,4]triazolo[1,5-c]quinazolin-2ylthio)carboxylic acid amides // Arch. Pharm. (Weinheim). 2009. Vol. 342, N 11. P. 651-620.
17. Kudryasheva N., Vetrova E., Kuznetsov A. et al. Bioluminescence assays: effects of quinones and phenols // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2002. Vol. 53, N 3. P. 198-203.
18. Исмаилов А.Д. Биолюминесценция как излучательная форма защиты от окислительного стресса у морских фотобактерий // Материалы VII Съезда Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, 14-20 сентября 2014 г. Пущино, 2014. С. 104.