Исследование механизма связывания железа казеиновыми фосфопептидами
РезюмеВ статье представлены результаты исследований механизма связывания (хелатирования) железа казеиновыми фосфопептидами (КФП). Изучены молекулярно-массовые распределения водных растворов казеиновых фосфопептидов, полученных ферментативным гидролизом казеината натрия различными протеиназами. Наибольшее количество низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой менее 2,8 кДа обнаружено в трипсиновом гидролизате. Пепсиновый и химотрипсиновый гидролизаты имеют близкий качественный состав и содержат пептиды с более высокой молекулярной массой. При гидролизе казеината натрия химозином в основном образуются высокомолекулярные пептиды, а фрагменты с молекулярной массой менее 2,8 кДа не обнаружены. При исследовании хелатирующей способности КФП установлено, что максимальное количество железа связывают пептидные фракции трипсинового гидролизата. В пептидных комплексах трипсинового гидролизата удельное содержание железа составляет 18,8 мг/г белка, а химотрипсинового и пепсинового - 13,2 и 11,3 мг/г белка соответственно. Отмечено, что с увеличением дозы железа степень хелатирования микроэлемента во всех гидролизатах снижается. Хроматографические исследования показали, что более 70% хелатированного железа в трипсиновом и пепсиновом гидролизатах обнаружено в пептидных фракциях с молекулярной массой 0,5-1,4 кДа и только 30% - во фракциях с молекулярной массой 1,4-4,5 кДа. Методом масс-спектроскопии изучены аминокислотные пептидные профили КФП в трипсиновом гидролизате. Установлено, что после взаимодействия аминокислот с железом величина пиков молекулярного иона на участках -Val-Ser-Ser-Glu-Glu-, а также -Ala-Glu-Ser-Ser-Ser-Glu-Glu- увеличивается на 15-25%, что указывает на связывание данных аминокислот с металлом. Полученные результаты свидетельствуют о том, что основная часть железа связывается с низкомолекулярной фракцией относительно коротких пептидов молекулярной массой 1,4-4,5 кДа. Отмечено, что при ферментативном гидролизе казеината натрия трипсином образуется наибольшее количество низкомолекулярных пептидов, которые связывают железо и повышают его биодоступность. Следует отметить, что хелатированные комплексы будут легко проникать внутрь клеток, освобождая металл именно там, где это необходимо, защищая его при этом от окисления и взаимодействия с другими элементами в желудочно-кишечном тракте. Полученные результаты позволили оптимизировать питательную среду и обеспечить высокое хелатирование железа.
Ключевые слова:казеиновые фосфопептиды, железо, солюбилизация, хелатирование, молекулярно-массовое распределение, гидролиз
Вопр. питания. 2016. № 3. С. 104-111.
Железодефицитные состояния по-прежнему остаются актуальной и во многих отношениях нерешенной проблемой современной медицины [1-4]. Учитывая, что в повседневной жизни человек потребляет железо в составе растительных и животных продуктов и что наличие аминокислот и пептидов, а также белков животного происхождения способствует лучшему усвоению организмом этого микроэлемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами железа.
Из данных литературы известно, что в качестве биологически активных добавок к пище (БАД) может использоваться биомасса микроводорослей, обогащенная железоорганическими соединениями, нормализующая обмен железа у человека и животных. Однако нерешенной проблемой массового культивирования микроводорослей является нестабильность выхода биомассы и ее состава [5]. В настоящее время обсуждается [6, 7] возможность использования в качестве источника биодоступного железа наночастиц среднего фосфата железа (III) (FePO4). Приведенные результаты показывают, что использование нерастворимых и химически инертных наночастиц FePO4 имеет хорошие перспективы, однако данный вопрос требует дополнительного изучения.
Кроме того, нерастворимые формы наночастиц FePO4 могут вызывать побочные эффекты в виде раздражения слизистой желудочно-кишечного тракта. Поэтому биологически активные вещества естественного природного происхождения более предпочтительны для организма, так как действуют гораздо мягче и более длительно. К таким родственным организму человека биологически активным веществам относятся казеиновые фосфопептиды (КФП) [8-12].
Необходимо отметить, что исключительная биодоступность кальция из молока и молочных продуктов обусловлена наличием КФП, которые образуются в желудочно-кишечном тракте при переваривании казеина и обеспечивают высокую растворимость кальция в тонкой кишке [8].
С учетом хелатирующей способности КФП нами разработан новый вид БАД на основе биомассы пропионовокислых бактерий, содержащей комплекс КФП, связанных с железом [13]. Выбор пропионовокислых бактерий в качестве объекта для создания железосодержащей БАД обусловлен тем, что они являются общепризнанными пробиотиками, устойчивы к действию желчных кислот и выдерживают низкую кислотность желудка, что очень важно для создания пробиотических препаратов [14]. Пропионовокислые бактерии растут в анаэробных условиях, синтезируют гемовые ферменты, супероксиддисмутазу, каталазу, пероксидазу, витамины группы В, особенно в большом количестве витамин В12, что будет способствовать антиокислительной защите железа и его нормальному усвоению [14-16].
В отличие от других существующих средств профилактики дефицита железа разработанная нами БАД содержит высокое количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий и профилактическую дозу биодоступного железа.
Цель настоящей работы - исследование механизма связывания железа казеиновыми фосфопептидами.
Материал и методы
Объектом исследования служил водный раствор КФП, который получали путем ферментативного гидролиза натриевого казеината [8, 17-19]. При получении КФП применяли схему одностадийного гидролиза казеината натрия с использованием пепсина (КФ 3.4.23.1), трипсина (КФ 3.4.21.4), химозина (КФ 3.4.23.4) и химотрипсина (КФ 3.4.21.1) при оптимальных для каждого фермента значениях рН. Реакцию проводили при соотношении фермент:субстрат 1:100 в течение 6 ч. После протеолитического переваривания гидролизаты подкисляли до рН 4,6. При этом в осадок выпадал интактный казеин и нерастворимые продукты его гидролиза, которые отделяли центрифугированием или ультрафильтрацией.
Для получения хелатированных комплексов железа с КФП в полученные гидролизаты казеината натрия добавляли различное количество сульфата железа (5-20 мг/мл). С целью удаления из конечного продукта несвязанных ионов железа гидролизаты подвергали нанофильтрации.
В качестве источника железа использовали двухвалентную его соль (FeSO4).
Количество хелатированного железа (Fe) (т.е. процент связанного железа от первоначальной дозы) определяли колориметрическим методом [20]. Метод основан на измерении интенсивности окраски раствора комплексного соединения двухвалентного железа с ортофенантролином красного цвета.
Молекулярно-массовое распределение пептидов в составе водного раствора КФП оценивали эксклюзионной хроматографией среднего давления [21] на колонке “TSK GEL” (0,8×30 см) (“НР”, США) и колонке “Superose 12” (1,6×50 см) (“Pharmacia”, Швеция). Оптическую плотность элюируемого раствора регистрировали, используя проточный ультрафиолетовый детектор при длине волны 280 нм. В качестве элюента использовали буферный раствор 0,05 М KH2PO4.
Пептидные фракции гидролизатов исследовали на времяпролетном MALDI масс-спектрометре “Ultraflex Tof/Tof” (“Bruker”, Германия) в одном из ведущих протеомных центров страны, ЦКП "Протеом человека" (Москва), созданном на базе отдела постгеномных технологий ФГБНУ ИБМХ [22, 23].
Для характеристики связывания железа с пептидными структурами КФП было проведено хроматографическое исследование весовым методом в диапазоне от свободного до полного объема хроматографической колонки [24].
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы Statistica 6. Использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (для сравнения независимых выборок). Значимыми считали различия, если вероятность ошибки р≤0,05.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследований были изучены молекулярно-массовые распределения КФП, полученных одностадийным гидролизом казеината натрия различными протеиназами в течение 6 ч. Результаты исследований представлены в табл. 1.
Из данных табл. 1 следует, что через 6 ч гидролиза трипсином содержание низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой (м.м.) менее 2,8 кДа составило 26,6%. Что касается пепсина и химотрипсина, то полученные гидролизаты при достаточно хорошей скорости гидролиза имеют весьма близкий качественный состав и содержат пептиды с более высокой м.м. в пределах 5,1-11,0 кДа, что в процентном соотношении составляет 21,4 и 19,5% соответственно.
Количество пептидов с м.м. менее 2,8 кДа в этих гидролизатах не превышает 11%, что в 2,5 раза меньше, чем в трипсиновом гидролизате. При гидролизе химозином в основном присутствуют высокомолекулярные пептиды, а фрагменты с м.м. менее 2,8 кДа вообще не обнаружены. Таким образом, при ферментативном гидролизе казеината натрия трипсином обнаружено наибольшее количество низкомолекулярных пептидов.
На следующем этапе исследований было изучено влияние КФП в различных гидролизатах на солюбилизацию (хелатирование) железа. Для этого в водный раствор КФП вносили сульфат железа в количестве 5-20 мг/мл и оценивали степень хелатирования минерального вещества (т.е. процент связанного железа от первоначальной дозы). Результаты исследования представлены на рис. 1.
Из данных рис. 1 следует, что КФП проявляют различную хелатирующую активность. Максимальное количество хелатированных комплексов железа образуется в трипсиновом гидролизате при внесении 5 мг/мл железа и составляет 100%.В пептидных комплексах трипсинового гидролизата удельное содержание железа составляет 18,8 мг/г белка, а химотрипсинового и пепсинового - 13,2 и 11,3 мг/г белка соответственно. Отмечено, что с увеличением дозы железа степень хелатирования микроэлемента во всех гидролизатах снижается. Это, вероятно, объясняется тем, что КФП могут связывать только ограниченное число молекул железа, т.е. количество ионизированного микроэлемента не должно превышать количество имеющихся анионных гидрофильных участков аминокислот КФП.
Для изучения механизма связывания железа с пептидными структурами трипсинового и пепсинового гидролизатов был использован хроматографический метод (см. рис. 2).
Полученные данные (см. рис. 2) свидетельствуют о том, что в исследуемых растворах КФП преобладающей формой железа являются его комплексы с относительно короткими пептидами. Более 70% хелатированного железа в трипсиновом и пепсиновом гидролизатах обнаружено в пептидных фракциях с м.м. 0,5-1,4 кДа и только 30% - во фракциях с м.м. 1,4-4,5 кДа.
Известно, что минералосвязывающая способность КФП зависит от степени фосфорилирования [8, 17-19].
Исследования аминокислотных пептидных профилей КФП в трипсиновом гидролизате показали, что после взаимодействия аминокислот с железом величина m/z пиков молекулярного иона на участках -Val-Ser-Ser-GluGlu-, а также -Ala-Glu-Ser-Ser-Ser-Glu-Glu- увеличивается на 15-25% (рис. 3), что указывает на связывание данных аминокислот с металлом.
Следует отметить, что комплексообразование ионов железа с низкомолекулярными пептидами в гидролизатах влияет на молекулярно-массовое распределение пептидных фракций. Причиной изменений молекулярно-массового распределения могут быть, по-видимому, как преципитация части фракций относительно крупных пептидов при взаимодействии с ионами металла, так и возникновение "мостиков" или "сшивок" между молекулами коротких пептидов, координирующих центральный атом железа, что согласуется с гипотезой, выдвинутой авторами [25].
В результате исследований установлено, что взаимодействие пептидных структур гидролизата с катионным микроэлементом железа сопряжено со связыванием железа с относительно короткими пептидами в диапазоне м.м. 0,5-1,4 кДа. Такие хелатированные комплексы будут легко проникать внутрь клеток, освобождая металл именно там, где это необходимо, защищая его при этом от окисления и взаимодействия с другими элементами в желудочно-кишечном тракте.
Полученные результаты позволили оптимизировать питательную среду и обеспечить высокое хелатирование железа и активный рост пропионовокислых бактерий [13, 15].
Употребление 5 мл БАД, содержащей 2,25 мг хелатированного железа, обеспечит 20% от рекомендуемой суточной нормы потребления этого минерального вещества [13].
Заключение
В результате проведенных исследований установлено, что железо связывается с относительно короткими низкомолекулярными фракциями КФП. Отмечено, что при ферментативном гидролизе казеината натрия трипсином образуется наибольшее количество низкомолекулярных пептидов, которые связывают железо и повышают его биодоступность. Методом масс-спектроскопии определены аминокислотная последовательность пептидных профилей КФП и участки взаимодействия аминокислот с железом. Полученные результаты открывают широкие перспективы для создания новых лечебно-профилактических продуктов, обогащенных легкоусвояемыми биодоступными микроэлементами.
Литература
1. Сельчук В.Ю., Чистяков С.С., Толокнов Б.О., Манзюк Л.В. др. Железодефицитная анемия: современное состояние проблемы // Рус. мед. журн. 2012. № 1. С. 1-8.
2. Смагулова И.Е., Шарманов Т.Ш., Балгимбеков Ш.А. Распространенность анемии у детей и женщин репродуктивного возраста в Казахстане и основные принципы ее профилактики // Вопр. питания. 2013. Т. 82, № 5. С. 58-63.
3. Струтынский А.В. Диагностика и лечение железодефицитных анемий // Рус. мед. журн. 2014. № 11. С. 839-844.
4. Stephenson L.S., Latham M.C., Ottesen EA. Global malnutrition // Parasitology. 2000. Vol. 121, suppl. 1. P. S5-22.
5. Голтвянский А.В., Сысенко Е.И. Биоаккумуляция железа и сезонная вариабельность продуктивности культуры микроводорослей Dunaliella viridis Teod // Біотехнологія. Наука. Освіта. Практика: тези доповідей IV Міжнародної науковопрактичної конференції. Дніпропетровськ, 2008. С. 18-19.
6. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. и др. Нанотехнологии в пищевых производствах: перспективы и проблемы // Вопр. питания. 2009. Т. 78, № 2. С. 4-17.
7. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 3. С. 25-30.
8. Гаппаров М.М., Стан Е.Я. Влияние казеиновых фосфопептидов на биодоступность минералов // Вопр. питания. 2003. № 6. С. 40-44.
9. Chiu S.C.K., Kitts D.D. Antioxidant characterization of caseinphosphopeptides from bovine milk // Nutraceutical Beverages: Chemistry, Nutrition and Health Effects. Series A. ACS Symposium Series / eds F. Shahidi, D.K. Weerasinghe. Washington, 2004. Vol. 871. P. 279-289.
10. Diaz M., Decker E.A. Antioxidant mechanisms of caseinophosphopeptides and casein hydrolysates and their application in ground beef // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52. P. 8208-8213.
11. Dziuba J., Iwaniak A. Database of protein and bioactive peptide sequences // Nutraceutical Proteins and Peptides in Health and Disease / eds V. Mine, F. Shahidi. Boca Raton; London : CRC Press, Taylor and Francis Group, 2006. P. 543-563.
12. Kamau S.M., Lu R.R., Chen W., Liu X.M. et al. Functional significance of bioactive peptides derived from milk proteins // Food Rev. Int. 2010. Vol. 26. P. 386-401.
13. Кривоносова А.В. Разработка технологии биологически активной добавки, обогащенной железом : автореф. дис. - канд. тех. наук. Улан-Удэ, 2007.
14. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. М. : Изд-во МГУ, 1999. 300 с.
15. Хамагаева И.С., Кривоносова А.В. Влияние сульфата железа на активность пропионовокислых бактерий // Мол. пром-сть. 2007. № 6. С. 33.
16. Хамагаева И.С., Кривоносова А.В. Влияние сульфата железа на синтез внеклеточных факторов адаптации пропионовокислых бактерий // Мол. пром-сть. 2009. № 6. С. 71-72.
17. Berrocal R., Chanton S., Jullerat M.A., Pavillard B. et al. Tryptic phosphopeptides from whole casein. II Physicochemical properties related to the solubilization of calcum // J. Dairy Res. 1988. Vol. 56. P. 335-341.
18. Fitz Gerald R.J., Meisel H.M. Milk protein hydrolysis and bioactive peptides // Advanced Dairy Chemistry. 3rd ed. Pt B, Ch. 14 / eds P.F. Fox, P. McSweeney. New York : Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003. P. 675-698.
19. Juillerat M.A., Baechler R., Berrocol R., Chanton S. et al. Tryptic phosphopeptides from whole casein. I Preparation and analysis by fast protein liquid chromatography // J. Dairy Res. 1988. Vol. 56. P. 603-611.
20. ГОСТ 26928-86 Продукты пищевые. Метод определения железа. Введ. 1988-07-01. М. : Изд-во стандартов, 1988. Переиздан.: М. : Изд-во стандартинформ, 2010. С. 107-110.
21. Mori S., Barth H.G. Size-Exclusion Chromatography. Berlin : Springer. 1999. 234 p.
22. Torshin I.Yu. Bioinformatics in the post-genomic era: sensing the change from molecular genetics to personalized medicine. New York : Nova Biomedical Books, 2009 ("Bioinformatics in the PostGenomic Era" series, ISBN: 978-1-60692-217-0).
23. URL: www.proteocentr.ru 24. Schoneich C., Kwok S.K., Wilson G.S. Separation and analysis of peptides andproteins // Anal. Chem. 1993. Vol. 65. P. 67-84.
25. Мазо В.К., Зорин С.Н., Гмошинский И.В., Баяржаргал Г. и др. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Комплексы цинка с ферментативным гидролизатом сывороточных белков коровьего молока // Вопр. дет. диетологии. 2003. Т. 1, № 6. С. 6-8.