Сбалансированный аминокислотный состав белка куриного яйца (БКЯ) определяет перспективы его эффективного использования в качестве функционального пищевого ингредиента (ФПИ) в составе широкого спектра специализированных пищевых продуктов высокой биологической и пищевой ценности. Разработанная технология получения коагулированного БКЯ направлена на расширение ассортимента функциональных пищевых яйцепродуктов, характеризуемых высокими органолептическими показателями [1]. Проведенное ранее исследование свидетельствует, что в коагулированном яичном белке, получаемом тепловой обработкой и подкислением органическими кислотами яичной массы, содержание незаменимых аминокислот существенно не отличалось от исходного охлажденного белка, за исключением некоторого снижения содержания триптофана вследствие перехода этой аминокислоты в сыворотку [2]. Показатели биологической ценности белка, как известно, зависят и от его аминокислотного скора, и от его усвояемости и наиболее обоснованно определяются в биологическом эксперименте на растущих животных или в исследовании с привлечением добровольцев [3]. Важным показателем перспективности применения белка в составе продуктов для питания детей (особенно раннего возраста) является снижение его потенциальных аллергизирующих свойств, зависящих в определенной степени от сохранения исходной антигенности [4]. Соответственно целями нашей работы в плане характеристики коагулированного БКЯ стали исследованиеего биологической ценности in vivo на растущих крысах-самцах линии Вистар и сравнительная иммунохимическая оценка его антигенности in vitro.
Материал и методы
Коагулированный БКЯ получен отделением от желтка куриного яйца, перемешиванием жидкой белковой массы, подкислением лимонной кислотой с добавлением хлористого натрия (0,13 и 0,8% соответственно), выдерживанием при комнатной температуре (24 °С) в течение 15 мин и последующей тепловой обработкой смеси в одну стадию до достижении структуры зерненого творога при постоянном перемешивании [5]. После отделения жидкой фазы полученный коагулят был охлажден и лиофильно высушен. Нативный БКЯ получен отделением от желтка куриного яйца и лиофильно высушен. В рационе контрольной группы использовали казеин пищевой кислотный ("Тагрис Молоко", РФ, 90% белка).
Содержание антигенных структур овальбумина (интактного овальбумина): в лиофилизированных образцах нативного БКЯ и диспергированного коагулированного БКЯ определяли непрямым иммуноферментным методом согласно [7], используя в качестве стандарта (интактного овальбумина) 5-кратно перекристаллизованный овальбумин куриного яйца, поликлональные моноспецифические кроличьи антитела против этого белка и автоматический иммуноферментный анализатор "ЭФОС 9305" (ОАО "МЗ Сапфир", РФ). Для проведения иммуноферментного анализа 1 г образца коагулированного БКЯ был диспергирован в 10 см3 0,01 М K-фосфатного буфера рН 7,3±0,1 с 0,15 М NaCI (PBS) в течение 5 мин на установке "Т 25 basic" (Германия) до получения однородной мелкодисперсной взвеси. Затем к 1,0 см3 взвеси добавляли 9,0 см3 PBS, содержащего 0,5% нормальной лошадиной сыворотки.
Сравнительную оценку in vivo биологической и пищевой ценности коагулированного БКЯ проводили в эксперименте на 50 растущих крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 80±5 г, полученных из филиала "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства". Исследования на животных выполнены в соответствии с приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 193н "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики" и требованиями, изложенными в Национальном стандарте РФ ГОСТ Р 53434-2009 "Принципы надлежащей лабораторной практики". Животные были адаптированы в лаборатории в течение 7 сут до начала эксперимента. Во время этого периода осуществлялся ежедневный осмотр внешнего состояния животных. В эксперимент были взяты животные без признаков отклонений здоровья.
Животных распределяли по группам с применением принципа рандомизации таким образом, чтобы средняя масса тела животных статистически не различалась между группами. После распределения по группам животных содержали по 1 особи в клетках из поликарбоната при 12/12-часовом режиме освещенности и температуре 25±1 °С. Животные были разделены на 3 группы: контрольную 1-ю группу (n=16) составили крысы с массой тела 119±1,5 г и две опытные, 2-ю и 3-ю группы (n=16), - крысы с массой тела соответственно 118±2,3 и 118±1,9 г. Животные всех групп получали базовый изокалорийный (380 ккал/100 г сухого корма) и изоазотистый (20% белка казеина по калорийности) полусинтетический рацион. Животные 1-й контрольной группы (Г1) получали рацион, в котором в качестве источника белка использовали казеин, животные опытных 2-й (Г2) и 3-й (Г3) групп получали рацион, в котором казеин был полностью заменен на БКЯ и коагулированный БКЯ соответственно. Состав полусинтетических рационов всех групп представлен в табл. 1.
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_diet,607,,4,photo1,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Воду и корм животные получали ad libitum. На протяжении всего исследования, длительность которого составила 29 сут, определяли индивидуальные показатели поедаемости корма и прироста массы тела каждого животного: через сутки на протяжении всего эксперимента контролировали потребление корма, 1 раз в неделю животных взвешивали.
С 24-х по 26-е сутки, в так называемый обменный период, помимо перечисленных показателей определяли количество азота в корме и выведенного с калом.
На 29-е сутки депривированных голодом в течение ночи животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. Собранную после декапитации животного кровь центрифугировали в течение 15 мин при 500g, сыворотку хранили при -20 °С.
В сыворотке крови на автоматическом анализаторе "Konelab 20i" ("Thermo Scientific", Финляндия) определяли концентрации триглицеридов, холестерина, липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП).
Сравнительное определение биологической ценности коагулированного белка куриного яйца, нативного белка куриного яйца и казеина "ростовыми" методами. Оценивали скорость роста лабораторных животных и определяли коэффициент эффективности белка (КЭБ) индивидуально для каждой крысы. Определяли прирост массы тела у лабораторных животных в граммах на 1 г потребленного ими белка [3, 9, 10] и рассчитывали КЭБ по формуле (1):
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_diet,607,,4,photo5,00000000,)&hide_Cookie=yes)
где ΔW - прирост массы тела крысы (в граммах) за экспериментальный период, Wt - масса тела крысы (в граммах) в последние сутки экспериментального периода, W0 - масса тела крысы (в граммах) в первые сутки экспериментального периода; Ip - количество белка, потребленного крысой (в граммах) за экспериментальный период.
Количество белка, потребленного крысой (Ip), рассчитывали по его экспериментально определенному содержанию в съеденном крысой корме. Съеденный крысой корм (поедаемость) определяли по разности между количеством корма, полученным крысой за весь экспериментальный период, и суммарным не съеденным ею остатком этого корма.
Сравнительное определение истинной усвояемости коагулированного белка куриного яйца, нативного белка куриного яйца и казеина. Метод расчета истинной усвояемости азота (Dист) основан на определении доли истинно абсорбированного в желудочно-кишечном тракте крысы азота (Аист), выраженной в процентах от азота, потребленного животным с пищей (I). Значение истинной усвояемости азота соответствует значению истинной усвояемости белка. Количество азота, выделяемого с калом в течение суток крысой, находящейся на безбелковом рационе, принимали равным 0,023 г [10].
Истинную усвояемость белка рассчитывали по формуле:
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_diet,607,,4,photo6,00000000,)&hide_Cookie=yes)
где Dист - истинная усвояемость (в %), I - общее количество азота, потребленного крысой с пищей в течение балансового периода (в граммах), F - количество азота, экскретированного с калом крысой в течение балансового периода (в граммах), Fk - количество азота, экскретированного с калом крысой, находившейся на безбелковой диете в течение такого же балансового периода (в граммах), Аист. - истинное количество азота, абсорбированного в желудочно-кишечном тракте у крысы в течение балансового периода (в граммах).
Истинную усвояемость белка рассчитывали индивидуально для каждой крысы.
Содержание общего азота в рационе и фекалиях определяли методом Кьельдаля (с предварительной минерализацией) [6] с применением автоматического анализатора "Kjeltec 8100" ("FOSS Analytical AB", Швеция).
Статистический анализ. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20, используя непараметрический ранговый критерий Мана-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждение
На протяжении всего эксперимента с использованием растущих крыс линии Вистар по сравнительному определению биологической и пищевой ценности коагулированного БКЯ, исходного нативного БКЯ и эталонного белка - казеина коровьего молока - общее состояние всех животных по внешнему виду, качеству шерстного покрова и поведению при ежедневном осмотре было удовлетворительным.
Средняя поедаемость корма для животных контрольной 1-й группы за весь период составила 18,4±0,6 г, для животных опытной 2-й группы - 19,2±0,5 г и для животных 3-й опытной группы - 13,7±0,6 г. Средняя поедаемость корма животными опытной 3-й группы, получавшими коагулят БКЯ, была статистически значимо ниже по сравнению как с животными 1-й контрольной группы, так и с животными 2-й опытной группы Г2 (р<0,05).
На рис. 1 приведен график изменения массы тела животных всех групп за весь период эксперимента.
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_diet,607,,4,photo4,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Как видно из представленных данных, уже на 8-е сутки эксперимента прирост массы тела животных 2-й опытной группы, получавшей БКЯ, был статистически значимо выше по сравнению с параметром обеих других групп, причем средняя потребляемость корма животными этой группы от контрольной группы достоверно не отличалась. Прирост массы тела животных 3-й опытной группы, получавших коагулированный БКЯ, достоверно от 1-й контрольной группы не отличался при статистически значимо более низкой потребляемости корма.
В табл. 2 представлены результаты определения показателей липидного обмена и глюкозы сыворотки крови.
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_diet,607,,4,photo2,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Из представленных данных видно, что статистических различий таких показателей липидного обмена, как концентрации холестерина, триглицеридов и ЛПНП, для всех групп не обнаружено. Концентрация ЛПВПу крыс из 3-й группы было выше (р<0,01) по сравнению с показателем животных 2-й опытной группы и при этом находилась в пределах нормы для данного вида животных. ЛПВП в первую очередь обеспечивают функцию обратного транспорта холестерина, помимо этого выполняют ряд других протективных функций: осуществляют транспорт полиненасыщенных жирных кислот, обладают антиоксидантной активностью, регулируют активность глюкокортикоидов. Выявленное повышение содержания ЛПВП в сыворотке крови животных, потреблявших коагулят БКЯ, отражает благоприятное влияние этого белка на липидный обмен.
Концентрация глюкозы натощак у животных опытной группы Г2 была достоверно ниже по сравнению с показателем животных контрольной группы.
В табл. 3 представлены результаты определения изменений массы тела животных, поедаемости ими корма и истинной усвояемости казеина, БКЯ и коагулята БКЯ в обменный период.
В так называемый обменный период крысы всех групп продолжали набирать массу тела, хотя средние значения этого показателя достоверно не различались. Важно отметить, что при этом более низкой прибавке массы тела животных 3-й опытной группы как по сравнению с животными контрольной, так и с животными другой опытной группы соответствовала более низкая потребляемость корма.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что среднее количество коагулированного БКЯ, потребляемого крысой с кормом за обменный период, было более чем в 1,5 раза меньше такового для животных, потреблявших стандартный казеиновый рацион и содержащий БКЯ рацион, а истинная усвояемость всех трех белков при этом практически не различалась.
На рис. 2 показаны средние значения коэффициента эффективности казеина, БКЯ и коагулята БКЯ, определенные за весь период эксперимента.
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_diet,607,,4,photo3,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Как видно из представленных данных, КЭБ для животных 3-й группы, получавших коагулят БКЯ, был статистически значимо выше по сравнению со значениями КЭБ как для животных контрольной группы, получавших казеин (р<0,01), так и для животных 2-й опытной группы, получавших БКЯ (р<0,05). В свою очередь КЭБ для животных, получавших БКЯ, был также достоверно, хотя и незначительно, выше по сравнению с его значением для животных контрольной группы, получавших казеин (Р<0,05) Результаты иммуноферментного тестирования сохранности исходной антигенности овальбумина в нативном БКЯ свидетельствовали, что его содержание составило 33,0% относительно стандарта интактного овальбумина, антигенность которого принята за 100%. Разработанный процесс коагуляции способствовал снижению антигенности (также относительно антигенности стандарта интактного овальбумина) до 2,2%.
Заключение
Совокупность полученных данных свидетельствует о высокой биологической ценности коагулированного БКЯ, полученного с использованием кислотно-солевого гидролиза и теплового нагрева. Результаты иммуноферментного тестирования сохранности исходной антигенности овальбумина в коагулированном БКЯ (показателя потенциальной аллергенности) свидетельствуют о том, что тепловое воздействие в сочетании с подкислением раствора привело к снижению этого показателя в коагулированном белке по сравнению с нативным БКЯ более чем в 15 раз. Этот результат является важным дополнительным аргументом перспективности использования коагулята БКЯ в составе пищевых продуктов массового спроса и специализированных пищевых продуктах.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-04047).
Литература
1. Гущин В.В., Стефанова И.Л., Клименкова А.Ю. Разработка новых видов продуктов из яичного белка // Птица и птицепродукты. 2015. № 2. С. 22-24.
2. Стефанова И.Л., Клименкова А.Ю. Обоснование технологии производства коагулированного яичного белка и продуктов на его основе // Птица и птицепродукты. 2016. № 3. С. 37-40.
3. Высоцкий В.Г. Экспериментальное обоснование потребностей человека в белке : автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 1977.
4. Ногаллер А.М., Гущин И.С., Мазо В.К., Гмошинский И.В. Пищевая аллергия и непереносимость пищевых продуктов. М. : Медицина, 2008. 336 с.
5. Гущин В.В., Кулишев Б.В., Стефанова И.Л., Агафонычев В.П., Юхина И.А, Шахназарова Л.В. Способ получения яичного белкового продукта. Пат. РФ 2406371, 2008.
6. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. М. : Медицина, 1998. С. 37-42, 183-185.
7. Круглик В.И., Зорин С.Н., Гмошинский И.В. Способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков со средней степенью гидролиза. Пат. РФ 2375910, 2009.
8. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Петров Н.А., Макаренко М.А., Саркисян В.А., Мазо В.К. и др. Физиолого-биохимическая оценкаобогащения рациона крыс докозагексаеновой кислотой и астаксантином // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 5. С. 46-55.
9. Высоцкий В.Г., Яцышина Т.А., Рымаренко Т.В., Мамаева Е.М. О методах определения биологической ценности белков // Мед. реферат. журн. 1976. Разд. VII, № 6. С. 24-35.
10. Высоцкий В.Г., Мамаева Е.М. К оценке эндогенных потерь азота у белых крыс различного возраста // Вопр. питания. 1979. № 3. С. 48-53.