Влияние карнозина и α-липоевой кислоты на апоптоз гепатоцитов и цитокиновый профиль при индуцированном жировой дистрофии печени у крыс линии Вистар

Резюме

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) в настоящее время представляет собой распространенное заболевание печени, выявляемое примерно у 1/3 населения мира. В связи с этим особую актуальность приобретает вопрос изучения патогенетических факторов развития данного заболевания с целью выбора адекватной лекарственной терапии и применения биологически активных веществ, обладающих антиоксидантными и регулирующими баланс про-и противовоспалительных цитокинов свойствами.

Цель исследования - оценка влияния минорных биологически активных веществ: карнозина и α-липоевой кислоты - на апоптоз гепатоцитов и цитокиновый профиль на экспериментальной модели начального этапа развития НАЖБП.

Материал и методы. Исследования проводили на крысах-самцах линии Вистар со средней исходной массой тела 150±10 г. Животные были разделены на 5 групп по 8 крыс в каждой. В течение 8 нед крысы 1-й (контрольной) группы получали полноценный модифицированный рацион AIN93М, в котором соевое масло было заменено на подсолнечное масло и лярд (1:1). Животные опытных групп потребляли высококалорийный холинодефицитный рацион (ВКХДР), в котором содержание жира составляло 45%, фруктозы - 20% от энергетической ценности рациона. Крысы 2-й группы получали ВКХДР без добавок, 3-й группы - с добавлением карнозина в дозе 75 мг на 1 кг массы тела, 4-й группы - с добавлением α-липоевой кислоты в дозе 75 мг на 1 кг массы тела, 5-й группы - с добавлением карнозина и α-липоевой кислоты в суммарной дозе 150 мг на 1 кг массы тела. Апоптоз гепатоцитов крыс исследовали методом проточной цитометрии. Окрашивали гепатоциты аннексином V и витальным красителем 7-аминоактиномицином с последующей детекцией на проточном цитофлуориметре. Содержание цитокинов и хемокинов [интерлейкины (IL) -1α, -10, -17А; колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), макрофагальный белок воспаления 1α (М1Р-1α) и 3а (MIP-3α), хемокин, выделяемый T-клетками при активации (RANTES)]в цитоплазматической фракции ткани печени определяли методом мультиплексного иммуноанализа.

Результаты и обсуждение. На модели начального этапа развития НАЖБП у самцов крыс линии Вистар обнаружена активация процессов апоптоза гепатоцитов по сравнению с животными, получавшими контрольный сбалансированный рацион. Обогащение ВКХДР карнозином и α-липоевой кислотой оказало протективный эффект на гепатоциты со снижением интенсивности апоптоза до уровня у крыс контрольной группы. Под влиянием ВКХДР в цитоплазматической фракции ткани печени обнаружено повышение содержания M-CSF и М1Р-1α и снижение уровней MIP-Зα и RANTES, стимулирующих миграцию и дифференцировку различных иммунорегуляторных популяций в паренхиму на раннем этапе формирования жирового гепатоза. При этом снижение уровня провоспалительных цитокинов IL-17А и К-1α и увеличение продуцируемого преимущественно Treg-популяциями IL-10 свидетельствует об отсутствии выраженных воспалительных изменений в печени самцов крыс линии Вистар на начальных этапах развития жировой дистрофии.

Заключение. Обогащение ВКХДР как карнозином, так и α-липоевой кислотой у крыс линии Вистар оказало протективный эффект на гепатоциты со снижением интенсивности апоптоза до уровня у крыс контрольной группы. Рост соотношения IL-10/IL-17А свидетельствует об активации противовоспалительных механизмов за счет функционального преобладания Treg-клеток над лимфоцитами Th1/Th17.

Ключевые слова:неалкогольная жировая болезнь печени, жировой гепатоз, карнозин, α-липоевая кислота, цитокины, хемокины

Финансирование. Поисково-аналитическая работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема НИР № 0529-2019-0058).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Для цитирования: Трушина Э.Н., Ригер Н.А., Мустафина О.К., Тимонин А.Н., Аксенов И.В., Гусева Г.В., Тутельян В.А. Влияние карнозина и α-липоевой кислоты на апоптоз гепатоцитов и цитокиновый профиль при индуцированной жировой дистрофии печени у крыс линии Вистар // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 5. С. 6-16. DOI: https://www.doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10061

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) в настоящее время представляет собой распространенное заболевание печени, выявляемое примерно у 1/3 населения мира [1, 2]. Патогенез НАЖБП представлен сложными механизмами, включающими запуск процессов воспаления и гибели гепатоцитов (некроз, апоптоз), инсулинорезистентности, активации клеток Купфера, фиброгенеза, в ходе которых формируется неалкогольный стеатогепатит, затем трансформирующийся в фиброз и цирроз печени. В основе развития

НАЖБП лежит периферическая инсулинорезистентность, способствующая накоплению жиров в печени и повышению уязвимости ее клеток ко многим факторам, таким как окислительный стресс, с последующим перекисным окислением липидов [3]. Высококалорийное питание у генетически предрасположенных лиц вызывает выраженную постпрандиальную гиперлипидемию, а также активацию липолиза и, как следствие, избыточное образование свободных жирных кислот [4]. Избыток свободных жирных кислот приводит к ингибированию Na+/ К+-аденозинтрифосфатов (АТФазы), угнетению гликолиза, разобщению окислительного фосфорилирования, активизации PPAR-α (рецепторов, активируемых пероксисомным пролифератором-α) пути утилизации избытка свободных жирных кислот. При снижении защитных свойств мембраны гепатоцитов происходят прямое или опосредованное окислительным стрессом повреждение митохондрий, апоптоз и некроз гепатоцитов. Апоптоз может быть опосредован либо внешним (рецепторным) путем, либо внутренним (митохондриальным) путем, основанным на повреждении клеточных органелл. Оба пути реализуются через единый механизм, индуцируемый расщеплением каспазы-3. В клетках печени апоптоз индуцируется связыванием поверхностных рецепторов смерти, в том числе Fas (CD95), рецепторов фактора некроза опухоли 1 (TNF-R1) и рецепторов родственного фактору некроза опухоли апоптоз-индуцирующего лиганда (TRAIL-R1 и -R2) [5, 6]. В исследовании на мышах линии C57BL/6J, которые потребляли рацион с высоким содержанием фруктозы (35% по калорийности) в течение 3 нед, обнаружена активация процесса апоптоза гепатоцитов, подтвержденная повышением соотношения белков Bax/Bcl2 и активности поли(АДФ-рибозо)полимеразы (PARP-1), соответственно, в 2 и 1,5 раза по сравнению с данными показателями в контрольной группе мышей, находившихся на стандартном полноценном рационе [7]. В настоящее время показатели апоптоза рассматриваются в качестве перспективных биомаркеров прогрессирования НАЖБП [8-10].

При прогрессировании НАЖБП основными медиаторами воспалительного процесса являются цитокины. Некоторым из них, например интерлейкину-6 (IL-6) и фактору некроза опухоли альфа (TNF-α), отводится ключевая роль в этом процессе [11-13]. Провоспалительные цитокины способны стимулировать воспаление, а также регулировать апоптоз и некроз клеток печени, индуцировать фиброз. Члены семейства TNF-белков, в том числе TNF-α, CD95L, TRAIL (TNF SF10), - наиболее известные индукторы апоптоза гепатоцитов. TNF-α является ключевым фактором в прогрессировании НАЖБП, в частности неалкогольного стеатогепатита (НАСГ). Известно, что TNF-α способен инициировать апоптоз и некроз гепатоцитов, но при отсутствии жировой дистрофии этого не происходит, так как TNF-α-целевые гены обычно экспрессируются на минимальном уровне [14]. Изучению цитокинового профиля в сыворотке крови при жировой дистрофии печени и прогрессировании НАЖБП с формированием фиброза и цирроза посвящено большое количество исследований. Однако спектр и механизмы регуляции изменений цитокинов и хемокинов в печени на начальных этапах развития жирового гепатоза остаются неизученными.

В связи с этим целью исследования была оценка влияния минорных биологически активных веществ: карнозина и α-липоевой кислоты - на апоптоз гепатоцитов и цитокиновый профиль на экспериментальной модели начального этапа развития НАЖБП на крысах.

Материал и методы

Исследования проводили на крысах-самцах линии Вистар со средней исходной массой тела 150±10 г. Животные были разделены на 5 групп по 8 крыс в каждой. В течение 8 нед крысы 1-й (контрольной) группы получали полноценный модифицированный рацион AIN93M, в котором соевое масло заменено на подсолнечное масло и лярд (1:1) (энергетическая ценность рациона - 3.9 ккал/г сухого корма). Содержание жира в рационе составляло 9% от его энергетической ценности. Крысы 2-й группы потребляли высококалорийный холинодефицитный рацион (ВКХДР), содержание жира в котором составляло 45%, фруктозы - 20% от энергетической ценности рациона (энергетическая ценность рациона - 4.9 ккал на 1 г сухого корма). Крысы 3-й группы получали ВКХДР с добавлением карнозина (L-Carnosine, степень чистоты - не менее 99%; Qingdao Samin Chemical Co., LTD, КНР) в дозе 75 мг на 1 кг массы тела. Крысы 4-й группы получали ВКХДР с добавлением α-липоевой кислоты (DL-α-Lipoic acid, степень чистоты - не менее 99%; Chem-Impex International, Inc., США) в дозе 75 мг на 1 кг массы тела. Крысы 5-й группы получали ВКХДР с добавлением комплекса карнозин - липоевая кислота (соотношение карнозин/липоевая кислота - 52/48; патент RU 2 647 435 C2; ФГБНУ "Научный центр неврологии", РФ) в суммарной дозе 150 мг на 1 кг массы тела. Среднесуточное потребление сухого корма животными, получавшими полноценный рацион (1-я группа), составило 19 г; потребление ВКХДР крысами 2-5-й групп составило в среднем 16 г сухого корма на крысу в сутки.

Крысы находились в пластиковых клетках с подстилкой из опилок при температуре от 20 до 24 °С, влажности воздуха 45-65%, искусственном освещении с равной продолжительностью светлого и темного периодов. Животные получали воду ad libitum, рацион - из расчета 20 г сухого корма на крысу в сутки. Наблюдение за поедаемостью корма, общим состоянием животных: внешним видом, поведением, двигательной активностью, качеством шерстного покрова проводили ежедневно; массу тела крыс измеряли еженедельно. По окончании эксперимента предварительно анестезированных эфиром животных умерщвляли путем декапитации. Условия содержания и работы с животными соответствовали действующим российским требованиям (ГОСТ 33044-2014 Принципы надлежащей лабораторной практики).

Исследование апоптоза гепатоцитов крыс проводили методом проточной цитометрии. Суспензию гепатоцитов получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани BD Medimachine (Becton Dickinson and Company, США). Однократно отмывали клетки забуференным фосфатами 0,15 М раствором хлорида натрия, рН 7,2-7,4 (PBS) и готовили пробу с концентрацией клеток 1×106/см3. Гепатоциты окрашивали конъюгированным с флуорохромом аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-ами-ноактиномицином (7-AAD) (Beckman Coulter, США) с последующей детекцией на проточном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter, США). Иссеченные кусочки печени и клеточную суспензию в процессе работы хранили на льду. Результаты представлены в виде процентного соотношения живых клеток и гепатоцитов, находящихся на разных стадиях апоптоза на 100 000 просчитанных объектов в каждом образце.

Содержание цитокинов и хемокинов [интерлейкины (IL) -1α, -10, -17A; колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), макрофагальный белок воспаления 1α (MIP-1α), макрофагальный белок воспаления 3α (MIP-3α), хемокин, выделяемый T-клетками при активации (Regulated on Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted, RANTES) в цитоплазматической фракции ткани печени, приготовленной по ранее описанной методике] [15] определяли методом мультиплексного иммуноанализа с использованием базового набора Bio-Plex Pro™ Reagent Kit V, дополняемого реагентами Bio-Plex Pro™ (Rat Cytokine IL-1α Set, Rat Cytokine IL-10 Set, Rat Cytokine IL-17A Set, Rat Cytokine M-CSF Set, Rat Cytokine MIP-1α Set, Rat Cytokine MIP-3α Set, Rat Cytokine RANTES Set) (Bio-Rad Laboratories, Inc., США), на анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США) по технологии xMAP с использованием программного обеспечения Luminex xPONENT Version 3.1.

Статистический анализ данных выполняли с использованием двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA в пакете программ SPSS 20.0 (IBM, США). Гипотезу о различии функции распределения данных в сравниваемых группах дополнительно проверяли с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия принимали за достоверные на уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования апоптоза гепатоцитов экспериментальных животных представлены в таблице.

Апоптоз гепатоцитов экспериментальных животных, % (M±m)

Apoptosis of hepatocytes in experimental animals, % (M±m)

П р и м е ч а н и е. Статистически значимое отличие (р<0,05) от показателя: * - контрольной группы; ** - 2-й группы; *** - 3-й группы. Обозначения: живые клетки - AnV-FITC-/7-AАD-; "ранний" апоптоз - AnV-FITC+/7-AAD-; "поздний" апоптоз - AnV-FITC+/7-AAD+; мертвые клетки - AnV-FITC-/7-AAD+.

N o t e. Statistically significant difference (p<0.05) compared with: * - control group; ** - 2nd group; *** - 3rd group. Designations: Living cells - AnV-FITC-/7-AАD-; "Early" apoptosis - AnV-FITC+/7-AAD-; "Late" apoptosis - AnV-FITC+/7-AAD+; Dead cells - AnV-FITC-/7-AAD+.

Как следует из представленных в таблице данных, у животных 2-й группы, которые получали ВКХДР, показатели апоптоза гепатоцитов статистически значимо (р<0,05) отличались от показателей у крыс контрольной группы (по относительному содержанию живых и мертвых клеток, сумме клеток в апоптозе).

Изученные показатели апоптоза гепатоцитов у крыс 3-й группы, которым в рацион ВКХДР добавляли карнозин (β-аланил-L-гистидин) в количестве 75 мг на 1 кг массы тела, не имели статистически значимых отличий от показателей животных контрольной группы, но имели статистически значимо (р<0,05) большее относительное содержание живых клеток и, соответственно, меньшее относительное содержание клеток в апоптозе по сравнению с показателями апоптоза у животных 2-й группы (см. таблицу).

Мембранопротекторные и антиоксидантные свойства карнозина служат основой для использования в терапии широкого спектра заболеваний, патогенетическим фактором развития которых является окислительный стресс. Установлено наличие у карнозина супероксидперехватывающей активности, способности нейтрализовать синглетный кислород и гидроксилрадикал, сохранять активность мембранных ферментов в условиях индукции перекисного окисления [16]. Особенность карнозина заключается в сочетании прямых антиоксидантных эффектов, направленных на нейтрализацию активных форм кислорода, с одной стороны, и модулирующего действия на активность вовлеченных в развитие окислительного стресса ферментов - с другой [17]. Кроме того, в исследованиях in vitro установлено положительное влияние карнозина на выживаемость и пролиферацию клеток 1608hTERT (клон иммортализованных фибробластов кожи человека) [18].

Показатели апоптоза гепатоцитов у крыс 4-й группы, которым в рацион ВКХДР добавляли α-липоевую кислоту (75 мг на 1 кг массы тела), не имели статистически значимых различий с показателями животных контрольной группы (см. таблицу). По сравнению с показателями апоптоза у крыс 2-й группы обнаружено уменьшение процента мертвых клеток (р<0,05). Известно, что α-липоевая кислота является коэнзимом митохондриального мультиферментного комплекса, катализирующего окислительное декарбоксилирование α-кетокислот. Она выполняет роль липофильного антиоксиданта, при введении в организм восстанавливается до дигидролипоевой кислоты, которая и обеспечивает нейтрализацию супероксидов [19, 20]. На модели ревматоидного артрита у крыс [21] выявлено увеличение активности каспаз в мышцах экспериментальных животных. Так, активность каспазы-3 и каспазы-8 возрастала соответственно в 3,1 и 2,6 раза по сравнению с показателями контрольных животных. Внутрибрюшинное введение α-липоевой кислоты в дозе 35 мг на 1 кг массы тела сопровождалось уменьшением активности этих ферментов соответственно в 1,4 и 1,3 раза по сравнению с животными контрольной группы. Снижение уровня апоптотических процессов в присутствии α-липоевой кислоты авторы объясняют уменьшением интенсивности свободнорадикального окисления. Данный эффект рассматривается авторами не только как самостоятельный антиоксидантный потенциал α-липоевой кислоты за счет наличия двух тиоловых групп в молекуле, но и как положительное воздействие на функционирование других антиоксидантных систем в организме.

Совместное введение в рацион крыс 5-й группы, которые получали ВКХДР, карнозина и α-липоевой кислоты оказало ингибирующий эффект на развитие апоптоза гепатоцитов (см. таблицу). Все изученные показатели апоптоза не отличались от таковых у крыс контрольной группы и имели статистически значимые отличия по всем изученным параметрам апоптоза от показателей крыс 2-й опытной группы (см. таблицу).

Полученные результаты свидетельствуют о протективном эффекте биологически активных веществ: карнозина и α-липоевой кислоты - при их раздельном и совместном добавлении в рацион крыс на апоптоз гепатоцитов при морфологически подтвержденном жировом гепатозе (данные не приводятся).

При анализе цитокинового профиля в цитоплазматической фракции ткани печени у животных 2-й группы, получавших ВКХДР, выявлено статистически значимое повышение содержания IL-10, M-CSF и М1Р-1α (р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 1, 2). Уровни цитокинов IL-1 α, IL-17A и хемокинов MIP-Зα, RANTES статистически значимо снизились (р<0,05) по сравнению с этими показателями у крыс контрольной группы (см. рис. 1, 2).

Рис. 1. Содержание в ткани печени колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF), макрофагального белка воспаления 1a (MIP-1α) и 3α (MIP-3α), хемокина, выделяемого T-клетками при активации (RANTES) [(Me (min-max)]

* - статистически значимые отличия (р<0,05) в сравнении с показателем контрольной группы.

Fig. 1. The content in liver tissue: macrophage colony stimulating factor (M-CSF), macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α), macrophage inflammatory protein-3α (MIP-3α), regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES) [Me (min-max)]

* - p<0.05 - compared with control group.

Рис. 2. Содержание в ткани печени интерлейкинов IL-10, IL-17A и IL-1α [Ме (min-max)]

* - статистически значимые отличия (р<0,05) в сравнении с показателем контрольной группы.

Fig. 2. Content of interleukins in liver tissue: IL-10, IL-17A и IL-1α [Ме (min-max)]

* - р<0.05 - compared with control group.

При добавлении в рационы карнозина уровни IL-10 и MIP-1α сохранялись повышенными (р<0,05), а содержание IL-17A, IL-1α и RANTES в цитоплазматической фракции ткани печени оставалось сниженным (см. рис. 1, 2) по сравнению с контролем (р<0,05), при этом содержание IL-17A (р<0,1) и IL-1α (р<0,05) было ниже по сравнению с показателем 2-й группы животных. Содержание в печени MIP-Зα возвращалось к контрольным значениям. Добавка в рационы α-липоевой кислоты способствовала снижению содержания IL-10 (р<0,1) и увеличению RANTES (р<0,1) до уровней в контрольной группе. При этом уровень MIP-1α увеличился (р<0,05), а содержание IL-17A, IL-1α, M-CSF и MIP-Зα уменьшилось (см. рис. 1, 2; р<0,05) по сравнению с животными, потреблявшими контрольный рацион. При сравнении данных с показателями животных 2-й группы обнаружено статистически значимое (р<0,05) снижение содержания IL-17A, IL-1α и M-CSF и тенденция к повышению уровня MIP-1α (р<0,1).

Совместное обогащение рациона крыс карнозином и α-липоевой кислотой привело к снижению (р<0,05) уровней IL-10, IL-1α, MIP-и RANTES по сравнению с контрольной группой (см. рис. 1, 2). Продукция и содержание MIP-1α оставались выше по сравнению с контролем (р<0,05), а уровни IL-17A и M-CSF не отличались от показателей 1-й группы (см. рис. 1, 2). При сравнении с показателями крыс 2-й группы статистически значимые отличия (р<0,05) отмечены только в снижении содержания IL-10 и MIP-Зα.

Отношение уровня IL-10, продуцируемого преимущественно Treg-лимфоцитами, к IL-17A, основная часть которого является показателем секреторной активности Th17 [22], возрастало по сравнению с контролем как на фоне потребления ВКХДР, так и при введении в рацион α-липоевой кислоты и карнозина (рис. 3; р<0,05). При сочетании в рационе α-липоевой кислоты и карно-зина статистически значимого увеличения IL-10/IL-17A по сравнению с контролем не выявлено.

Рис. 3. Изменение соотношения IL-10/IL-17A

Прямая линия - IL-10/IL-17A в контрольной группе; * - статистически значимые отличия (р<0,05) в сравнении с показателем контрольной группы.

Fig. 3. Changes in the IL-10 / IL-17A ratio Straight line - IL-10/IL-17A in the control group; * - р<0.05 - compared with control group.

Несбалансированное питание и избыточное накопление жировых отложений приводят к тканевой гипоксии в результате дисрегуляции в молекулярных механизмах гомеостаза жирных кислот, митохондриальной дисфункции и развитию окислительного стресса. Прогрессирующее ожирение и вызванное гипоксией хроническое воспаление сопровождаются регуляторными нарушениями в инсулинозависимом сигнальном пути и становятся основными причинами тканевой резистентности к инсулину [23]. Указанные изменения в зависимости от степени выраженности нарушений обмена веществ тесно связаны с механизмами цитокиновой регуляции метаболизма при формирующемся ожирении, вызывая цитокиновую дисрегуляцию. Жировая дистрофия неадипозных тканей приводит к увеличению клеточной миграции из кровяного русла в очаги адипогенеза, активации элементов тканевой стромы и лимфоидных органов к продукции факторов, регулирующих вялотекущее воспаление [24, 25]. За счет этого наблюдается рост одних и снижение содержания других цитокинов в цитоплазматической фракции ткани печени под влиянием ВКХДР, карнозина и α-липоевой кислоты (см. рис. 1-3).

Печень, состоящая на 20% из непаренхиматозных клеток, кроме обеспечения метаболического гомеостаза, участвует в регуляции иммунитета и иммунной толерантности. В избыточном накоплении жировых включений и формировании гепатоза с апоптотическими изменениями паренхимы, особенно при потреблении животными ВКХДР (см. таблицу), ведущая роль принадлежит синусоидальным эндотелиальным клеткам (HSC). Кроме того, в этих процессах участвуют дендритные клетки, макрофаги и мигрирующие из сосудистого русла гранулоциты, моноциты и лимфоидные популяции [26, 27]. С этим согласуется обнаруженное среди хе-мокинов в печени статистически значимое возрастание содержания M-CSF при потреблении крысами ВКХДР и уровня MIP-1a при всех опытных рационах по сравнению с контролем (см. рис. 1). Напротив, содержание хемоаттрактантов для лимфоидных популяций MIP-3α и RANTES может не увеличиваться, а снижаться на начальных этапах жирового гепатоза (см. рис. 1) [28].

Активация и способность синусоидальных скоплений HSC к росту и накоплению липидов не зависит ни от исследуемой модели, ни от характера альтерирующего воздействия (пищевое, токсическое и т.п.). Установлено, что этот феномен гипертрофии тесно связан с продукцией коллагена и степенью выраженности фиброза в печени [29, 30].

При развитии жирового гепатоза в HSC активируется экспрессия большого числа генов (в частности, Ki-67, CXCL14, семейство ингибиторов апоптоза - IAP, холестерин 25-гидроксилаза и многих др.), регулирующих процессы пролиферации и играющих защитную роль в выживаемости непаренхиматозных клеток печени при развитии фиброзных изменений [26].

Активация, или супрессия, генов хемокинов CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-3α), CLL5 (RANTES), изменение содержания которых обнаружено в нашем исследовании (см. рис. 1, 2), а также активация семейства лигандов CXCL14 выступают при жировой дистрофии важнейшими сигналами для мобилизации иммунных клеток в очаги воспаления и формирующейся фиброзно-дистрофической трансформации паренхимы печени [28]. Кроме того, позитивная индукция сигнальных путей: холестерин 25-гидроксилаза (CH25H), транскрипционные факторы (sterol regulatory element-binding protein) SREBP-1 и SREBP-2 -способствует приобретению HSC схожего с адипоцитами фенотипа и избыточному накоплению липидов [29, 30].

Среди интерлейкинов в печени крыс 2-й группы выявлено значимое (р<0,05) по сравнению с контрольной группой снижение уровня провоспалительных цитокинов IL-17А и IL-1α и прогрессивный рост продуцируемого преимущественно Treg-популяциями IL-10 (см. рис. 2). Это можно расценить как косвенные признаки отсутствия явных воспалительных изменений в печени на начальном этапе жировой дистрофии. На ранних этапах жировой трансформации печеночные дендритные клетки (DCs), распознав присутствующие в очагах воспаления антигены (процесс, как и активация непаренхиматозных клеток, неспецифичен), активируют цитокиновые сети позитивной дифференцировки и миграции Treg за счет нарастания продукции и увеличения общего и тканевого (преимущественно в селезенке) содержания IL-10. При дистрофических изменениях в печени (независимо от этиологического фактора) неизбежно происходят морфофункциональные изменения в селезенке [25, 31, 32]. В результате нарастает содержание в печени IL-10 и соотношение IL-10/IL-17A за счет активации Treg-популяций на фоне как ВКХДР, так и добавления антиоксидантов. Дисрегуляция и блокада этих механизмов при прогрессировании инсулинорезистентности и ожирении приводят к формированию очагов фиброза, повышению выброса провоспалительных факторов, метаболическим нарушениям и печеночной дисфункции [27].

Снижение содержания цитокинов IL-17А и IL-1α в печени крыс 3-й и 4-й групп по сравнению с крысами 2-й группы и контрольной, увеличение соотношения IL-10/ IL-17A свидетельствует о том, что используемые в рационах биологически активные вещества: карнозин и α-липоевая кислота - способны уменьшать воспалительные изменения при наблюдаемой жировой дистрофии печени на фоне ВКХДР. Однако механизмы положительного влияния этих добавок различаются и не до конца изучены. В частности, α-липоевая кислота - природный эндогенный антиоксидант, действует как агонист PPAR-γ, уменьшая проявления окислительного стресса. Предполагается, что α-липоевая кислота может оказывать метаболический и иммуномодулирующий эффект при воспалительных процессах различного генеза.

Было показано, что α-липоевая кислота значимо снижает процентное содержание Th1 и Th17. Напротив, наблюдается стимуляция дифференцировки и созревания Treg-популяций в селезенке и системная индукция PPAR-γ сигнальных путей с ингибированием воспалительных реакций [33]. При этом на рис. 1 показано, что добавление в рацион α-липоевой кислоты вызывает тенденцию к росту хемоаттрактанта для лимфоцитов RANTES по сравнению с крысами, потреблявшими ВКХДР На моделях с депрессией генов PPAR-γ/α или блокадой PPAR в печени, напротив, наблюдаются избыточное накопление липидов с развитием жирового гепатоза и воспалительная трансформация паренхимы [34].

Карнозин, как и а-липоевая кислота, является природным антиоксидантом и обладает способностью улучшать метаболические процессы на моделях диабета у животных. Механизмы этого влияния до сих пор не полностью расшифрованы. Было показано, что карнозин снижает уровень циркулирующего связывающего инсулиноподобного фактора роста 1 (IGFBP1) и экспрессию этого белка в печени за счет прямой супрессии индуцируемого гипоксией фактора-1α (HIF-1α) -центрального медиатора, индуцирующего продукцию IGFBP1 на фоне гипоксии. С другой стороны, карнозин повышает уровень циркулирующего инсулина, и за счет снижения содержания глюкозы возрастает его концентрация в плазме [35]. Уровень IGFBP1 увеличивается системно и в печени при воспалительных процессах, окислительном стрессе и ожирении. Этот белок вовлечен в регуляцию процессов апоптоза в печени. Инсулин, уровень которого возрастает при добавлении карнозина, прямо супрессирует промоутеры IGFBP1 - протеинкиназу B (Akt) и транскрипционный фактор FoxO1 (Forkhead box O1). Медиаторы воспаления: TNF-α, IL-1α, IL-1β и IL-6 - способны индуцировать экспрессию мРНК и продукцию IGFBP1 in vitro. Семейство IL-1 - основные индукторы биосинтеза IGFBP1 при воспалении [36]. Снижение содержания I L-1α (р<0,05 в сравнении с контролем и со 2-й группой) и IL-17A (р<0,05 с контролем, р<0,1 со 2-й группой) за счет потребления животными карнозина можно расценить как инсулинонезависимый путь редукции уровня IGFBP1 в механизмах супрессии воспаления, уменьшения количества клеток в апоптозе и улучшения метаболических процессов при жировом гепатозе. Однако стоит отметить, что при сочетанном применении карнозина и α-липоевой кислоты в дозе 150 мг на 1 кг массы тела не удалось достичь суммирования противовоспалительных эффектов, наблюдаемых при раздельном использовании данных биологически активных веществ.

Под влиянием ВКХДР у крыс 2-й группы в цитоплазматической фракции ткани печени обнаружено повышение содержания M-CSF и MIP-1α и снижение уровней MIP-3α и RANTES, стимулирующих миграцию и дифференцировку различных иммунорегуляторных популяций в паренхиму на раннем этапе формирования жирового гепатоза. При этом снижение уровня провоспалительных цитокинов IL-17A и IL-1α и увеличение содержания IL-10 свидетельствуют об отсутствии выраженных воспалительных изменений в печени самцов крыс линии Вистар на начальных этапах развития жировой дистрофии.

Заключение

Обогащение ВКХДР как карнозином, так и α-липоевой кислотой у крыс линии Вистар оказало протективный эффект на гепатоциты со снижением интенсивности апоптоза до уровня у крыс контрольной группы. Рост соотношения IL-10/IL-17A свидетельствует об активации противовоспалительных механизмов за счет функционального преобладания Treg-клеток над лимфоцитами Th1/Th17.

Апоптоз гепатоцитов при алиментарно-индуцированной дистрофии печени является определяющим фактором развития прогрессирующих форм неалкогольного жирового гепатоза. В связи с этим особую актуальность приобретает вопрос выбора адекватной лекарственной терапии и применения биологически активных веществ, обладающих антиоксидантными и регулирующими баланс про- и противовоспалительных цитокинов свойствами.

Литература

1. Ивашкин В.Т., Драпкина О.М., Маев И.В. и др. Распространенность неалкогольной жировой болезни печени у пациентов амбулаторно-поликлинической практики в Российской Федерации: результаты исследования DIREG 2 // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2015. № 6. С. 31-41.

2. Fierbinteanu-Braticevici С., Moldoveanu А., Petrisor А., Diaconu S. Nonalcoholic fatty liver disease: one entity, multiple impacts on liver health // Cell Biol. Toxicol. 2017. Vol. 33. P. 5-14. DOI: https://doi.org/10.1007/s10565-016-9361-x

3. Duvnjak M., Lerotic I., Barcic N. et al. Pathogenesis and management issues for nonalcoholic fatty liver disease // World Gastroenterol. 2007. Vol. 13. P. 4539-4550.

4. Кособян Е.П., Смирнова О.М. Современные концепции патогенеза неалкогольной жировой болезни печени // Сахарный диабет. 2010. № 1. С. 55-64.

5. Ribeiro P.S., Cortez-Pinto H., Solá S. et al. Hepatocyte apoptosis, expression of death receptors, and activation of NF-kappaB in the liver of nonalcoholic and alcoholic steatohepatitis patients // Am. J. Gastroenterol. 2004. Vol. 99, N 9. P. 1708-1717. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1572-0241.2004.40009.x

6. Guicciardi M.E., Gores G.J. Apoptosis as a mechanism for liver disease progression // Semin. Liver Dis. 2010. Vol. 30, N 4. P. 402-410. DOI: https://doi.org/10.1055/s-0030-1267540

7. Choi Y., Abdelmegeed M.A. et al. Diet high in fructose promotes liver steatosis and hepatocyte apoptosis in C57BL/6J female mice: Role of disturbed lipid homeostasis and increased oxidative stress // Food Chem. Toxicol. 2017. Vol. 103. P. 111-121. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2017.02.039

8. Курбатова И.В., Топчиева Л.В., Дуданова О.П., Шиповская А.А. Биохимические и молекулярно-генетические показатели воспаления и апоптоза при циррозе печени как исходе прогрессирования неалкогольного стеатогепатита // Терапевтический архив. 2019. Т. 91, № 4. С. 21-27. DOI: https://doi.org/10.26442/00403660.2019.04.000057

9. Neuman M.G., Cohen L.B., Nanau R.M. Biomarkers in nonalcoholic fatty liver disease // Can. J. Gastroenterol. Hepatol. 2014. Vol. 28, N 11. P. 607-618. DOI: https://doi.org/10.1155/2014/757929

10. Дуданова О.П., Шиповская А.А., Курбатова И.В. Маркеры печеночно-клеточного повреждения и воспаления при ранней форме неалкогольной жировой болезни печени // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2017. № 3. С. 16-20.

11. Braunersreuther V., Viviani G.L., Mach F., Montecucco F. Role of cytokines and chemokines in non-alcoholic fatty liver disease // World J. Gastroenterol. 2012. Vol. 18. P. 727-735.

12. Топчиева Л.В, Курбатова И.В., Дуданова О.П., Соколовская А.А, Шиповская А.А. Полиморфизм генов провоспалительных цитокинов (TNF, IL6) и их рецепторов (TNFRSF1A, TNFRSF1B, IL6R) и неалкогольная жировая болезнь печени // Труды Карельского научного центра РАН. 2017. № 5. С. 3-22. DOI: https://doi.org/10.17076/eb568

13. Neurath M.F., Finotto S. IL-6 signaling in autoimmunity, chronic inflammation-associated cancer // Cytokine Growth Factor Rev. 2011. Vol. 22. P. 83-89. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cytogfr.2011.02.003

14. Tilg H., Diehl A.M. Cytokines in alcoholic and nonalcoholic steatohepatitis // N. Engl. J. Med. 2000. Vol. 343. P. 1467-1476.

15. Lake B.G. Preparation and characterization of microsomal fractions for studies on xenobiotic metabolism // Biochemical Toxicology - a Practical Approach / eds K. Snell, B. Mullock. Oxford : IRL Press, 1987. Ch. 8. P. 183-215.

16. Болдырев А.А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса. Москва : Диалог-МГУ, 1999. 362 с.

17. Болдырев А.А., Стволинский С.Л., Федорова Т.Н. Карнозин: эндогенный физиологический корректор активности антиоксидантной системы организма // Успехи физиологических наук. 2007. Т. 38, № 3. С. 57-71.

18. Вишнякова Х.С., Бабижаев М.А., Алипер А.М. и др. Стимуляция пролиферации карнозином: клеточный и транскриптомный подход // Молекулярная биология. 2014. Т. 48, № 5. С. 824-833.

19. Rochette L., Ghibu S., Muresan A., Vergely C. Alpha lipoic acid: molecular mechanisms and therapeutic potential in diabetes // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2015. Vol. 93. P. 1021-1027. DOI: https://doi.org/10.1139/cjpp-2014-0353

20. Строков И.А., Фокина А.С. Альфа-липоевая кислота - основное фармакологическое лечение диабетической полинейропатии в стационаре и поликлинике // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. 2017. № 3. С. 50-55.

21. Крыльский Е.Д., Попова Т.Н., Кирилова Е.М., Сафонова О.А. Воздействие липоевой кислоты на активность каспаз, показатели иммунного и антиоксидантного статуса при ревматоидном артрите у крыс // Биоорганическая химия. 2016. Т. 42, № 4. С. 431-439.

22. Lee G.R. The balance of Th17 versus treg cells in autoimmunity // Int. J. Mol. Sci. 2018. Vol. 19, N 3. Article ID E730. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms19030730

23. Yi Z., Bishop G.A. Regulatory role of CD40 in obesity-induced insulin resistance // Adipocyte. 2014. Vol. 4, N 1. P. 65-69. DOI: https://doi.org/10.4161/adip.32214

24. Lee B.C., Lee J. Cellular and molecular players in adipose tissue inflammation in the development of obesity-induced insulin resistance // Biochim. Biophys. Acta. 2014. Vol. 1842, N 3. P. 446-462. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2013.05.017

25. Gotoh K., Inoue M., Masaki T. et al. A novel anti-inflammatory role for spleen-derived interleukin-10 in obesity-induced inflammation in white adipose tissue and liver // Diabetes. 2012. Vol. 61, N 8. P. 1994-2003. DOI: https://doi.org/10.2337/db11-1688

26. Trefts E., Gannon M., Wasserman D.H. The liver // Curr. Biol. 2017. Vol. 27, N 21. P. R1147-R1151. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cub.2017.09.019

27. Ma M., Duan R., Zhong H. et al. The crosstalk between fat homeostasis and liver regional immunity in NAFLD // J. Immunol. Res. 2019. Vol. 2019. Article ID 3954890. DOI: https://doi.org/10.1155/2019/3954890

28. Dembic Z. The Cytokines of the Immune System. Cambridge : Academic Press, 2015. 320 p.

29. Hoffmann C., Djerir N., Danckaert A. et al. Hepatic stellate cell hypertrophy is associated with metabolic liver fibrosis // Sci. Rep. 2020. Vol. 10, N 1. P. 3850. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-60615-0

30. De Minicis S., Seki E., Uchinami H. et al. Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo // Gastroenterology. 2007. Vol. 132, N 5. P. 1937-1946.

31. Kashani A., Salehi B., Anghesom D. et al. Spleen size in cirrhosis of different etiologies // J. Ultrasound Med. 2015. Vol. 34, N 2. P. 233-238. DOI: https://doi.org/10.7863/ultra.34.2.233

32. Li L., Duan M., Chen W. et al. The spleen in liver cirrhosis: revisiting an old enemy with novel targets // J. Transl. Med. 2017. Vol. 15, N 1. P. 111-120.

33. Wang K.C., Tsai C.P., Lee C.L. et al. α-Lipoic acid enhances endogenous peroxisome-proliferator-activated receptor-γ to ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis in mice // Clin. Sci. (Lond.). 2013. Vol. 125, N 7. P. 329-340. DOI: https://doi.org/10.1042/CS20120560

34. Stec D.E., Gordon D.M., Hipp J.A. et al. Loss of hepatic PPARα promotes inflammation and serum hyperlipidemia in diet-induced obesity // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2019. Vol. 317, N 5. P. R733-R745. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpregu.00153.2019

35. Forsberg E.A., Botusan I.R., Wang J. et al. Carnosine decreases IGFBP1 production in db/db mice through suppression of HIF-1 // J. Endocrinol. 2015. Vol. 225, N 3. P. 159-167. DOI: https://doi.org/10.1530/JOE-14-0571

36. Shi L., Banerjee D., Dobierzewska A. et al. Direct regulation of IGF-binding protein 1 promoter by interleukin-1β via an insulin- and FoxO-1-independent mechanism // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2016. Vol. 310, N 8. P. E612-E623. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpendo.00289.2015

SCImago Journal & Country Rank
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Медицина сегодня
Рентгенология в сочельник

Рентгенология в сочельник Научно-практическая конференция в онлайн-формате 25 декабря 2020 года 25 декабря 2020 года состоялась традиционная научно-практическая конференция Российского общества радиологов и рентгенологов. По инициативе президента РОРР, подобные мероприятия...

XV Международный конгресс по репродуктивной медицине.

XV Международный конгресс по репродуктивной медицине 19-21 января 2021 года в онлайн-формате состоится XV Международный конгресс по репродуктивной медицине . Цель конгресса по репродуктивной медицине - улучшение качества оказания помощи в планировании семьи и рождении детей...

Проект "Школы РОАГ" выходит на общероссийский уровень.

Проект "Школы РОАГ" выходит на общероссийский уровень В 2021 году Школы РОАГ выходят на новый - всероссийский уровень. География проекта охватит все федеральные округа! Школы пройдут в 18 городах, а онлайн-технологии помогут присоединиться к образовательному процессу...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»