Остеопротективный эффект хлеба, обогащенного белком, пищевыми волокнами, кальцием, железом и йодом, при гипоэстроген-индуцированном остеопорозе у крыс

Резюме

Поиск новых стратегий профилактики и борьбы с остеопорозом представляет актуальную задачу. Особый интерес в этом плане вызывают функциональные пищевые продукты и их компоненты.

Цель - изучение влияния хлеба, обогащенного белком, пищевыми волокнами, кальцием, железом и йодом, на состояние костной ткани крыс в условиях модели постменопаузального остеопороза.

Материал и методы. Эксперимент проводили на 55 половозрелых самках крыс линии Wistar массой тела 250-270 г, разделенных на группы: К - контрольная (ложно оперированные крысы, не подвергнутые овариэктомии); О30 - модель остеопороза (животныхумерщвляли через 30 дней после овариэктомии); группы О120 и О120+ - модель остеопороза (животные умерщвлялись через 120 дней после овариэктомии). Все крысы находились на стандартном виварном рационе. Животным группы О120+ с 40-го по 120-й день в рацион включали хлеб в количестве 6 г на 100 г массы тела в сутки, обогащенный белком (молочный сывороточный, белки плазмы крови сельскохозяйственных животных), пищевыми волокнами, кальцием (скорлупа куриных яиц), железом (очищенный гемоглобин) и йодом (йодированный белок молочной сыворотки). Крысы групп К и О120 с 40-го по 120-й день получали необогащенный хлеб в таком же количестве. В крови животных определяли концентрацию общего кальция колориметрическим методом, гонадотропинов, тестостерона и эстрадиола - методом твердофазного иммуноферментного анализа. Проводили микротомографическую оценку архитектуры и минеральной плотности трабекулярной части бедренной кости и поясничных позвонков, выполняли гистоморфологический анализ матки и бедренной кости животных.

Результаты и обсуждение. У животных группы О120+ в сравнении с выборкой О120 наблюдалось уменьшение в крови концентрации тестостерона и выраженное компенсаторное выделение фолликулостимулирующего гормона, при этом не выявлялось изменений в концентрации эстрадиола и состоянии атрофированной на фоне овариэктомии матки. Отмечалось увеличение трабекулярной минеральной плотности бедренной кости и поясничных позвонков. Доля костных трабекул в общем объеме метафиза бедренной кости (BV/TV) у животных выборки О120+ составила 12,5±0,7 против 10,4±0,5% в группе О120. Величины структурного модельного индекса (SMI), отражающего потерю прочности кости, и коэффициента трабекулярности (TbPf) у крыс О120+ (1,44±0,07 и 5,96±0,29 1/мм) были значительно ниже этих параметров в группе О120 (1,74±0,08; 9,13±0,46 1/мм, р<0,05). Микроархитектурная структура бедренной кости у крыс группы О120+ приближалась к таковой выборки Оз0, выступающей моделью раннего этапа остеопороза (SM11,42±0,07; TbPf 5,55±0,28 1/мм). Процент периметра резорбции кости и число остеокластов в трабекулах бедренной кости животных О120+ были меньше, чем в группе О120. В группе О120+ в значительной части полостей резорбции отмечалось появление активных остеобластов. Дифференцировка клеток наблюдалась больше в остеогенном направлении, нежели в адипогенном.

Заключение. Потребление обогащенного белком, пищевыми волокнами, кальцием, железом и йодом хлеба ослабило проявления остеопороза, вызванного овариэктомией у крыс. Включение его в рацион может быть полезно для профилактики и лечения системного постменопаузального остеопороза.

Ключевые слова:остеопротективный эффект, обогащенный пищевой продукт, постменопаузальный остеопороз, овариэктомированные крысы

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Для цитирования: Беляев Н.Г, Тимченко Л.Д., Ржепаковский И.В., Писков С.И., Лодыгин А.Д., Гапонов В.И., Хлебак Т.С. Остеопротективный эффект хлеба, обогащенного белком, пищевыми волокнами, кальцием, железом и йодом, при гипоэстроген-индуцированном остеопорозе у крыс // Вопросы питания. 2020. Т 89, № 6. С. 58-69. DOI: 10.24411/0042-8833-2020-10079

Распространенность остеопороза в настоящее время достигает эпидемических масштабов. По данным Всемирной организации здравоохранения, почти 200 млн человек страдают этой патологией, и каждый год из-за остеопороза происходит более 9 млн переломов [1]. Постменопаузальная потеря костной ткани остается наиболее распространенной причиной остеопороза. Постклимактерический остеопороз обусловлен ускорением костной резорбции и системным дисбалансом кальция в результате дефицита эстрогена [2]. Для профилактики и лечения остеопороза, вызванного гипоэстрогенией, в основном применяют средства, предотвращающие резорбцию или стимулирующие формирование костной ткани. В первую очередь это препараты на основе женских половых гормонов или селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов [3]. Однако следует констатировать, что частота развития остеопороза и выраженность связанных с ним последствий не несут тенденции к снижению. Кроме того, длительные курсы гормонотерапии в постменопаузе могут приводить к развитию у женщин инсульта, инфаркта миокарда, тромбоэмболии и рака молочной железы [4]. Все это определяет важность поиска иных стратегий профилактики и лечения остеопороза, связанного с менопаузой. Акцент смещается в сторону естественных альтернатив. Обнадеживает, что с ростом знаний о критических звеньях патогенеза и терапии остеопороза доказано, что его алиментарная коррекция вполне реалистична. Диетические подходы могут служить эффективной стратегией в поддержании костного гомеостаза [5]. Особый интерес в этом плане вызывают функциональные пищевые продукты и их компоненты.

Цель настоящего исследования - изучение влияния хлеба, обогащенного белком, пищевыми волокнами, кальцием, железом и йодом, на состояние костной ткани крыс в условиях модели системного постменопаузального остеопороза при гипоэстрогении.

Материал и методы

Эксперимент осуществляли на половозрелых самках белых крыс линии Wistar в возрасте 12-14 мес с массой тела 250-270 г. Содержание животных и все манипуляции с ними осуществляли в условиях вивария в строгом соответствии с ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами". Исследования одобрены комиссией по биоэтике Института живых систем СКФУ (протокол № 002).

Гипоэстроген-индуцированный остеопороз воспроизводили путем двусторонней овариэктомии [6]. Операцию у крыс проводили на фоне наркоза в условиях оперблока вивария. В качестве анестетика использовали смесь тилетамина гидрохлорида и золазепама гидрохлорида (Virbac, Франция).

В эксперименте животные были разделены на 4 группы: К - контрольная (ложно оперированные крысы, не подвергнутые овариэктомии, n=12); О30 - модель остеопороза (животных умерщвляли через 30 дней после овариэктомии, n=12); группы О120 и О120+ - модель остеопороза (животных умерщвляли через 120 дней после овариэктомии, n=15 и 16 соответственно). Крысы группы О120+ получали с 40-го по 120-й день хлеб с добавлением пищевого обогатителя "МОБИ-ЛЮКС КОМБИ" (ООО НПФ "Мобитек-М", РФ). Животные групп К и О120 с 40-го по 120-й день получали пшеничный хлеб из муки 1-го сорта аналогичного состава без обогащающей добавки.

Хлеб был произведен и предоставлен для эксперимента Центром здорового питания ГБПОУ "Ставропольский колледж сервисных технологий и коммерции". В состав пищевого обогатителя входит белок молочный сывороточный, пищевые волокна, очищенный гемоглобин, белки плазмы крови сельскохозяйственных животных, минеральный компонент из скорлупы куриных яиц, йодированный белок молочной сыворотки. Пищевая ценность обогатителя из расчета на 100 г: белок - не менее 60 г, углеводы - 15 г, жиры - 0,5 г, пищевые волокна - 20 г, кальций - 2000 мг, железо - 12 мг, йод - 400 мкг [7]. В состав хлеба пищевой обогатитель вносили на этапе замеса теста в количестве 5% от массы муки. Сведения по пищевой и энергетической ценности обогащенного хлеба и пшеничного хлеба без обогатителя представлены в табл. 1.

Таблица 1. Показатели пищевой и энергетической ценности обогащенного хлебобулочного изделия в сравнении с пшеничным хлебом из муки 1-го сорта (в 100 г)

Table 1. Nutritional and energy value of a fortified bakery product in comparison with wheat bread made from the 1st grade flour (per 100 g)

Принимая во внимание, что количество хлеба и хлебобулочных изделий в суточном рационе человека составляет в среднем 354 г, руководствуясь правилами межвидового переноса доз (коэффициент пересчета дозы в мг на 1 кг массы с крысы на человека - 0,17) [8], а также ориентируясь на величины, сопоставимые с физиологическими нормами потребления пищевых веществ, и исследования подобного плана других авторов [9], количество хлеба, вводимое в рацион крыс, составляло 6 г на 100 г массы тела в сутки.

Экспериментальных животных содержали в индивидуальных клетках. Взвешенные порции хлеба с учетом массы тела крыс подконтрольно до полного потребления продукта скармливали ежедневно в утреннее время. После этого животные получали стандартный виварный рацион в виде гранулированного корма (ГОСТ Р 50258-92) в свободном доступе. Во всех группах животных контролировали потребляемость корма, прием воды и поведенческий статус. Массу тела животных оценивали с использованием тензометрических весов ВТ-3000 ("Госметр", РФ) еженедельно. После выведения животных из эксперимента методом декапитации внутренние органы (надпочечники, матка) взвешивали с помощью прецизионных весов ML203E (Mettler Toledo, Испания).

В сыворотке крови измеряли концентрацию общего кальция, гонадотропных и половых гормонов. Исследования крови проведены на кафедре биомедицины и физиологии СКФУ. Уровни фолликулостимулирующего (ФСГ), лютеинизирующего (ЛГ) гормонов, тестостерона и эстрадиола определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа на микропланшетном фотометре ImmunoChem-2100 (HTI, США) с использованием коммерческих наборов, концентрацию общего кальция - колориметрическим методом с использованием биохимического анализатора BioChem SA Plus (HTI, США) и набора реагентов "Кальций-2 Ольвекс" ("Ольвекс Диагностикум", РФ).

Оценку минеральной плотности и архитектуры костной ткани осуществляли методом рентгеновской микротомографии (микро-КТ). При вскрытии животных отбирали левую бедренную кость и поясничный отдел позвоночника. Сканирование костей проводилось с использованием компьютерного микротомографа SkyScan 1176 (Bruker-microCT, Бельгия). Зоной интереса рентгеновского сканирования выступали дистальный метафиз бедренной кости и тело 4-го поясничного позвонка.

Протокол сканирования: ускоряющее напряжение источника рентгеновского излучения 80 кВ, ток источника излучения 300 мкА, фильтр Cu + Al, размер пикселя 17,54 мкм, томографическое вращение 180°, шаг съемки 0,3°, усреднение по 3 кадрам.

Объемную реконструкцию, 3-мерный количественный анализ и реалистичную 3-мерную визуализацию сканируемых костей проводили с помощью программ Nrecon (1.7.4.2), DataViewer (1.5.6.2), CTAn (1.18.4.0), CTVox (3.3.0r1403) (Bruker-microCT, Бельгия).

Проводили гистоморфологическую оценку костной ткани и матки крыс. Правую бедренную кость и матку животных после извлечения фиксировали в 10% растворе формалина в течение 72 ч. Для костной ткани проводили кислотную декальцинацию. После промывки органы дегидратировали в изопропиловом спирте и заключали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5-6 мкм осуществляли на санном микротоме МС-2 ("АТМ-практика", РФ) и окрашивали гематоксилином и эозином.

Оценку гистологических микропрепаратов и визуализацию полученных изображений осуществляли с помощью микроскопа Axio Imager 2(A2), фотокамеры AxioCam MRc5 и программного обеспечения Zen 2 (Carl Zeiss Microscopy, Германия).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Statistics для Windows 6.0 и Biostat 4.03. Применяли t-критерий Стьюдента (в случае нормального распределения переменных) и критерий Манна-Уитни (при отсутствии согласия данных с нормальным распределением). Полученные результаты фиксировали в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего арифметического (M±m). О статистической значимости различий величин исследуемых показателей судили при р<0,05.

Результаты

На фоне включения образцов хлеба в рацион животных не отмечено изменений в приеме воды и поведенческом статусе. Среднесуточная потребляемость животными основного рациона без учета хлеба в группах К, О120 и О120+ не имела статистически значимых различий и составляла 7,92±0,19; 8,41±0,22 и 8,31±0,18 г соответственно на 100 г массы тела животного. Отмечалась лишь некоторая тенденция к ее увеличению в группах овариэктомированных животных (О120 - на 6,2%; О120+ - 4,9%).

Пищевая ценность рационов животных с учетом среднесуточной потребляемости основного рациона и потребления хлеба представлена в табл. 2.

Таблица 2. Пищевая ценность суточного рациона на 100 г массы тела животного (M±m)

Table 2. Nutritional value of the daily diet per 100 g of animal body weight (M±m)

П р и м е ч а н и е. Статистически значимые различия (р<0,05): ■ - по отношению к группе К; □ - по отношению к группе О120.

N o t e. Statistically significant differences (p<0.05): ■ - in relation to group K; □ - in relation to group О120.

Согласно данным табл. 2, спектр усиления среднесуточного рациона животных с индуцированным остеопорозом группы О120+ в сравнении с выборкой О120 характеризовался увеличением количества белка (на 8,13%), пищевых волокон (17,65%), кальция (7,50%), железа (5,43%) и йода (7,01%).

К завершению эксперимента прирост массы тела у овариэктомированных крыс групп О120 и О120+ оказался значительно больше, чем у ложно оперированных. Полученные данные согласуются с результатами других авторов [10] и обусловлены дефицитом эстрогена, способного вызывать снижение секреции из жировой ткани лептина, оказывающего анорексигенное действие и, как следствие, приводящее к гиперфагии. При этом следует отметить, что прирост массы тела у крыс группы О120 насчитывал 21,4%, у животных О120+ - 10,9% (табл. 3).

Таблица 3. Масса тела и внутренних органов крыс (M±m)

Table 3. Body weight and weight of internal organs of rats (M±m)

П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 4, 5: средние значения в одном столбце с разными индексами статистически различны (р<0,05). N o t e. Here and in tables 4, 5: mean values in the same column with different indices are statistically different (p<0.05).

При оценке гормонального статуса выявлено снижение концентрации эстрадиола в крови животных групп О3о, О120 и О120+ более чем на 80% по сравнению с контрольной группой (табл. 4).

Таблица 4. Содержание половых и гонадотропных гормонов в сыворотке крови крыс (M±m)

Table 4. Content of sex and gonadotropic hormones in the blood serum of rats (M±m)

В группах О30 и О120 наблюдалось статистически значимое увеличение концентрации тестостерона, что, по всей видимости, обусловлено возросшей на фоне овариэктомии компенсаторной секреторной активностью сетчатой зоны коры надпочечников, косвенным подтверждением чего являлось увеличение их массы (табл. 3). При этом следует отметить, что гормональный профиль животных групп О120 и О120+ по сравнению с выборкой О30 характеризовался значительно меньшим количеством в крови тестостерона и более высоким уровнем эстрадиола. Мы склонны полагать, что выявленная тенденция может быть связана с увеличением у овариэктомированных животных количества жировой ткани, где под действием ароматазы происходит конверсия эстрогенов из андрогенов. Вместе с тем концентрация эстрадиола в крови животных как группы О120, так и группы О120+ оставалась низкой и не превышала 16% от ее значения в контроле.

На фоне овариэктомии у крыс отмечалось увеличение концентрации ЛГ и ФСГ, что расценивается нами как ответная реакция аденогипофиза на снижение концентрации эстрадиола. Наиболее высокими величинами ЛГ характеризовались животные модельной группы остеопороза О30. Сходные по величине уровни ЛГ в выборках О120 и О120+ относительно группы О30 имели тенденцию к уменьшению, оставаясь при этом значимо выше по сравнению с концентрацией у крыс контрольной группы. Концентрации ФСГ у животных в группах К и О30 не имели статистически значимых различий. Уровни ФСГ в крови животных групп О120 и О120+ превышали таковой в выборке К более чем в 2 и в 6 раз соответственно.

Относительная масса матки крыс в группах О30, О120, О120+ оказалась значительно меньше по сравнению с таковой в контроле (см. табл. 1). Приведенные изменения в сочетании со сдвигами в гормональном статусе указывают на успешно воспроизведенную модель овариэктомии и согласуются с результатами S. Reddi и соавт. [11], демонстрирующими, что овариэктомия сопровождается уменьшением матки и атрофией эндометрия.

По гистоморфологическим данным толщина стенки матки у животных составила: в группе К - 1235,0±22,9 мкм; О30 - 870,8±18,3 мкм; О120 - 699,7±30,46 мкм; О120+ - 70 6,7±28,49 мкм. В группе О30 наибольшим изменениям подвергался именно внутренний слой матки (рис. 1). В группах О120 и О120+ отмечалась выраженная гипоплазия как эндометрия, так и миометрия, регистрировалась атрофия органа почти до половины его размеров в контроле.

Рис. 1. Микрофотографии поперечных срезов матки белых крыс на уровне средней части рогов

Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×50.

Fig. 1. Micrographs of transverse sections of the uterus of white rats at the level of the middle part of the horns

Hematoxylin and eosin staining. 50× Magnification.

Таким образом, включение в рацион животных О120+ обогащенного белком, пищевыми волокнами и минеральными веществами хлеба сопровождалось снижением в крови уровня тестостерона и выраженным компенсаторным выделением ФСГ При этом оно не оказывало влияния на концентрацию эстрадиола и не приводило к гистоморфологическим изменениям в атрофированной на фоне овариэктомии матки.

В диагностике остеопороза показатель минеральной плотности костной ткани (МПКТ) является "золотым стандартом". Увеличение МПКТ выступает одним из основных критериев для оценки эффективности средств при постменопаузальном остеопорозе.

В настоящем исследовании, согласно результатам, полученным методом микро-КТ, выявлено, что овариэктомия у животных привела к значительному снижению величины трабекулярной МПКТ. Введение в пищевой рацион овариэктомированным животным группы О120+ обогащенного хлеба на протяжении 80 дней сопровождалось статистически значимым увеличением трабекулярной МПКТ как для бедренной кости, так и для поясничных позвонков (табл. 5).

Таблица 5. Трабекулярная минеральная плотность костной ткани крыс (МПКТ, M±m)

Table 5. Trabecular bone mineral density of rats (BMD, M±m)

Однако следует упомянуть, что МПКТ не всегда определяет ее прочность. МПКТ-независимые переломы могут возникать из-за количественных изменений в кости, в частности из-за истончения и потери трабекул [12]. Поэтому в нашем исследовании дополнительно проводилась микро-КТ-оценка трабекулярной микроархитектуры костей.

На полученных микротомограммах у овариэктомированных животных в губчатой костной ткани бедренной кости и тел позвонков регистрировалось снижение количества костных трабекул, которые у крыс контрольной группы формируют крупнопетлистую сеть костных пластин (рис. 2, 3).

Рис. 2. Микротомографические 3D-изображения дистального метафиза бедренной кости крыс

Изотропное пространственное разрешение 17,54 мкм.

Fig. 2. Microtomographic 3D images of the femur distal metaphysis of rats

Isotropic spatial resolution 17.54 μm.

Рис. 3. Микротомографические 3D-изображения поясничных позвонков крыс

Изотропное пространственное разрешение 17,54 мкм.

Fig. 3. Microtomographic 3D images of the lumbar vertebrae of rats

Isotropic spatial resolution 17.54 μm.

Согласно 3D-изображениям в контрольной группе животных метафиз бедренной кости и тела позвонков состоял из хорошо организованной губчатой костной ткани. В группах крыс О30, О120, О120+ изменения качества костной ткани характеризовались более высокой пористостью и потерей трабекулярных связей. Костные трабекулы утратили свою нормальную архитектуру и выглядели как отдельные костные участки, разделенные расширенными пространствами.

По сравнению с группой О120 у животных группы О120+ отмечалась меньшая потеря костной массы. Структура трабекулярной сети метафиза бедренной кости и тел поясничных позвонков крыс группы О120+ имела сходную картину с таковой у животных группы О30, что указывает на сохранение и/или восстановление трабекул.

Основные количественные параметры трабекулярной микроархитектуры, воспроизведенной с помощью трехмерного микро-КТ-анализа, представлены в табл. 6.

Таблица 6. Количественные параметры трабекулярной части метафиза бедренной кости и тела 4-го поясничного позвонка крыс, полученные методом рентгеновской микротомографии (M±m)

Table 6. Quantitative X-ray microtomographic parameters of the trabecular part of the femur metaphysis and the 4th lumbar vertebra body in rats (M±m)

П р и м е ч а н и е. Статистически значимые различия (р<0,05): ■ - по отношению к группе К; ▼ - по отношению к группе О30; □ - по отношению к группе О120.

BV/TV - величина объемной доли трабекулярной кости, %; Tb.Th - толщина трабекул, мкм; Tb.Sp - разделение трабекул, мкм; Tb.N - число трабекул на 1 мм; Tb.Pf - коэффициент трабекулярности на 1 мм; SMI - структурный модельный индекс.

N o t e. Statistically significant differences (p<0.05): ■ - in relation to group K; ▼ - in relation to group О30; □ - in relation to group О120.

BV/TV - percent bone volume, %; Tb.Th - trabecular thickness, pm; Tb.Sp, - trabecular separation, pm; Tb.N - trabecular number, 1/mm; Tb.Pf - trabecular pattern factor, 1/mm; SMI - structure model index.

Согласно данным табл. 6, овариэктомия приводила к снижению величины объемной доли трабекулярной кости (BV/TV) и числа трабекул (Tb.N) при одновременном увеличении показателей трабекулярного разделения (Tb.Sp) и структурного модельного индекса (SMI) в метафизе бедренной кости, что согласуется с данными T.R. Giaze и соавт. [13] и подтверждает успешность воспроизводимой модели остеопороза. При этом отсутствующие различия в показателях толщины трабекул (Tb.Th) в группах К и О30 указывают на то, что потеря костной ткани у крыс на 30-е сутки после овариэктомии обусловлена в основном перфорацией трабекулярной структуры и потерей трабекулярной связи, а не истончением трабекул. Это подтверждается значительным увеличением у крыс группы О30 величины показателя Tb.Pf, количественно отражающего связность костных структур, и логически согласуется с результатами Z. Hayatullina и соавт. [14], показывающими, что перфорация трабекулярной структуры выступает основным механизмом потери костной ткани на ранней стадии дефицита эстрогена.

Сравнительно низкие значения показателя Tb.Th у крыс группы О120 по сравнению с показателем овариэктомированных животных на 30-е сутки (О30) отражают нарастающие в последующие 80 дней остеопоротические изменения.

Проявления остеопороза у всех овариэктомированных крыс более выраженными оказались в метафизах бедренных костей, нежели в губчатой ткани поясничных позвонков. Это подтверждает данные C. Palumbo и соавт. [15] и показывает, что овариэктомия влияет на кости осевого и периферического скелета в разной степени с большей резорбцией костной ткани в последнем.

После приема обогащенного хлеба в группе О120+ по сравнению с животными выборки О120 наблюдалось статистически значимое увеличение объемной доли костных трабекул в дистальной части метафиза бедренной кости (BV/TV). Выявлено снижение величины показателей SMI и TbPf, рост которых отражает потерю прочности кости как результат изменений структуры трабекул от пластин до стержней к сферам. Это указывает на сохранность или восстановление микроархитектурной структуры бедренной кости до уровня таковой у крыс группы О30, выступающей моделью раннего этапа остеопороза.

Проведенная гистопатологическая оценка представила дополнительные доказательства того, что дефицит эстрогена значительно изменяет внутреннюю структуру кости, а прием обогащенного продукта на протяжении 80 дней ингибирует развитие остеопоротических изменений.

В созвучии с данными микро-КТ результаты проведенного гистологического исследования регистрируют увеличение количества остеокластов и полостей эрозии, обнаруженных во всех группах овариэктомированных животных О30, О120, О120+, и указывают на то, что повышенная резорбция кости выступает главным фактором, лежащим в основе остеопороза, смоделированного у животных.

По сравнению с контролем в группах О30 и О120 была нарушена конфигурация костных трабекул, регистрировалось увеличение доли периметра резорбции кости, числа остеокластов и уменьшение остеобластов и остеоцитов. Вокруг костных пластинок широко распространены области, лишенные остеобластов. Визуализируемые вдоль костных трабекул остеобласты идентифицировались как малоактивные и представляли собой плоские клетки удлиненной формы. Многочисленные полости резорбции содержали скопления остеокластов или были пустыми, что не только указывает на преобладание резорбции над формированием новых костных пластинок, но и свидетельствует о замедлении костеобразования (рис. 4).

Рис. 4. Микрофотографии продольных срезов дистального метафиза бедренной кости крыс

Окраска гематоксилином и эозином, ×400.

Fig. 4. Micrographs of longitudinal sections of femur distal metaphysis of rats

Hematoxylin and eosin staining, ×400.

В группе животных О120+ все перечисленные признаки остеопороза присутствовали, но были менее выражены. Периметр резорбции кости и число остеокластов в метафизе бедренной кости животных О120+ были значительно ниже, чем в группе О120. У животных группы О120+ на поверхности костных трабекул сохранялись очаги лизиса костной ткани, однако в отличие от группы О120 в значительной части полостей резорбции чаще отмечалось появление остеобластов. Вдоль края костных трабекул наряду с неактивными остеобластами наблюдались клетки округлой формы с крупными ядрами, свидетельствующие об их активности.

Во всех группах овариэктомированных животных в костном мозге отмечено увеличение количества адипоцитов (рис. 5). Это явление согласно наблюдениям P. Bhardwaj и соавт. [16] сопровождает остеопению и повышенную резорбцию кости и может быть обусловлено дифференцировкой адипоцитов за счет остеогенных клеток.

Рис. 5. Адипоциты в срезе костного мозга крыс

Окраска гематоксилином и эозином, ×200.

Fig. 5. Adipocytes in the rat bone marrow section

Hematoxylin and eosin staining, ×200.

Группа О120+ характеризовалась относительным уменьшением числа адипоцитов, тем самым подтверждая предположение об активизации запуска дифференцировки клеток костного мозга больше в остеогенные клетки, нежели в адипоциты.

Все это указывает, что обогащение рациона минеральными веществами и белком ингибирует развитие остеокластов и резорбцию костной ткани и способствует формированию кости.

Вышеприведенные патоморфологические данные костной ткани вместе с показателями гормонального профиля логично подтверждаются результатами оценки общего кальция в крови, уровень которого может выступать показателем деятельности остеокластов, отражающим состояние процессов резорбции костной ткани.

Резорбция костной ткани сопровождается высвобождением кальция в кровь. У животных групп О30 и О120 его концентрация (3,06±0,07; 2,80±0,07 ммоль/л соответственно) статистически значимо превышала таковую у крыс в группе К (2,41±0,08 ммоль/л) вследствие его усилившегося выхода из мест основного депонирования - кости. Однако, несмотря на усиление костной резорбции, у крыс группы О120 концентрация общего кальция в крови была статистически значимо меньше, чем в группе О30. Это согласуется с данными А.А. Воропаевой и соавт. [17] и свидетельствует об активировании компенсаторных механизмов и возможностей организма овариэктомированных самок крыс посредством кальций-регулирующих гормонов поддерживать концентрацию кальция на должном уровне. Кроме того, согласно сведениям S. Schulz и соавт. [18] это может быть также связано со снижением всасываемости кальция в кишечнике, вызванным дефицитом эстрогенов. У животных группы О12о+ концентрация сывороточного кальция (2,38±0,04 ммоль/л) приближалась к величине контрольной группы.

Обсуждение

Проведенное исследование показало, что дополнительное введение в рацион овариоэктомированным крысам кальция, железа, йода, белка в составе хлебобулочного изделия ослабляло остеопороз, вызванный недостатком эстрогена. Обогащение рациона проявляло остеогенную активность, ингибирование развития остеокластов и резорбции кости, при этом не вызывая тех изменений в гормональном статусе, которые бы способствовали выявленному остеопротективному эффекту. Даже наоборот, что оказалось несколько парадоксальным, применение обогащенного хлеба у овариэктомированных животных сопровождалось выраженным компенсаторным выделением ФСГ, который в высоких концентрациях, по сведениям D. Lizneva и соавт. [12], через независимый от эстрогенов путь может усиливать резорбцию костной ткани. В связи с этим можно предполагать непосредственное влияние компонентов пищевого обогатителя на процессы минерального обмена в костной ткани и обсудить иные потенциальные механизмы его антиостеопорозного эффекта.

Антиостеопорозный эффект исследуемого обогащенного хлеба может обеспечиваться входящими в его состав сывороточным белком молока и белками плазмы крови животных. Есть данные [19], подтверждающие, что белковые добавки могут индуцировать рост уровня сывороточного инсулиноподобного фактора роста, способного ослаблять резорбцию костной ткани при постменопаузальном и возрастном остеопорозе. По сведениям M.C. Kruger и соавт. [20], фракции как основных, так и кислых белков молочной сыворотки могут активировать восстановление костной ткани при остеопорозе, инициированном овариэктомией. Также, по ряду данных, увеличение содержания в рационе некоторых аминокислот, имеющихся в составе сывороточного молочного белка, может способствовать повышению абсорбции кальция в кишечнике [21] и оказывать стимулирующее влияние на пролиферацию, активацию и дифференцировку остеобластов как в нормальной, так и в остеопенической костной ткани [22].

Не исключен остеопротективный эффект обогащенного хлеба за счет биогенного йода и гемового железа, включенных в состав в виде йодированного белка молочной сыворотки и гемоглобина. Йод играет ключевую роль в функционировании щитовидной железы и входит в состав ее основных гормонов, являющихся необходимыми регуляторами развития и метаболизма скелетных тканей. В количествах, не превышающих норму, тироксин и трийодтиронин стимулируют пролиферацию клеток-остеобластов и повышают их активность [23]. Железо, являясь эссенциальным элементом костной ткани, может кумулироваться в зонах энхондрального и периостального образования кости и участвовать в процессе отложения остеотропных макроэлементов в остеоидном веществе [24].

Кроме того, названные элементы вкупе с другими элементами, в частности с цинком, могут участвовать в регуляции образования в костном мозге адипоцитов, которым отводится значительная роль в потере костной ткани, вызванной овариэктомией. Известно, что адипоциты посредством секреции цитокинов, а именно фактора некроза опухоли а и интерлейкина-6, стимулируют дифференцировку и активность клеток остеокластов [25].

Выявленное в нашем исследовании снижение образования адипоцитов у овариэктомированных крыс на фоне обогащения рациона может косвенно способствовать пролиферации остеобластов, ингибированию формирования остеокластов и, как следствие, торможению резорбции кости, как это было прослежено в исследованиях P. Bhardwaj и соавт. [16] по изучению антиостеопорозной активности дополнительного приема цинка.

Конечно, нельзя исключать возможную заслугу в выявленном остеопротективном эффекте кальциевого компонента, являющегося важным элементом минерализации и формирования костей. Кальций играет весомую роль в регуляции ремоделирования кости. Прием кальция при остеопорозе в ряде случаев рассматривается даже в качестве монотерапии [26]. При этом нельзя не отметить, что большая часть кальция в хлебопродуктах отличается высоким уровнем биодоступности, а, по данным S. Juma и соавт. [27], процент его усвояемости из обогащенного кальцием хлеба может быть даже выше, чем из молока.

Другим положительным аспектом применения обогащенного хлеба оказалось ингибирование увеличения массы тела, которое обычно происходит при овариэктомии. Это может быть связано с входящими в состав обогатителя пищевыми волокнами, включение которых в рацион не только оказывает влияние на элементный состав костной ткани, но и, согласно данным J.E. Drew и соавт. [28], препятствует развитию алиментарного ожирения посредством участия пищевых волокон в регуляции углеводного и липидного метаболизма.

Заключение

Результаты исследования подтверждают гипотезу, что исследуемый обогащенный хлеб проявляет остеопротективный эффект при остеопорозе, вызванном овариэктомией у крыс. Полученные данные вносят теоретический вклад в концепцию безопасной коррекции костного гомеостаза и показывают, что включение в рацион хлеба, обогащенного белком, пищевыми волокнами, кальцием, железом и йодом, может быть полезно для профилактики и лечения системного постменопаузального остеопороза при гипоэстрогении.

Литература

1. Pisani P., Renna M.D., Conversano F. et al. Major osteoporotic fragility fractures: risk factor updates and societal impact // World J. Orthop. 2016. Vol. 7, N 3. P. 171-181. DOI: https://doi.org/10.5312/wjo.v7.i3.171

2. Xu X., Ji W., Lv X. et al. Impact of physical activity on health-related quality of life in osteoporotic and osteopenic postmenopausal women: a systematic review // Int. J. Nurs. Sci. 2015. Vol. 2, N 2. P. 204-217. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijnss.2015.04.002

3. Srinivasan V., Martens M.G. Hormone therapy in menopausal women with fibroids // Menopause. 2018. Vol. 25, N 8. P. 930-936. DOI: https://doi.org/10.1097/gme.0000000000001105

4. The 2017 hormone therapy position statement of The North American Menopause Society // Menopause. 2017. Vol. 24, N 7. P. 728-753. DOI: https://doi.org/10.1097/gme.0000000000000921

5. Muhammad A., Mada S.B., Malami I. et al. Postmenopausal osteoporosis and breast cancer: the biochemical links and beneficial effects of functional foods // Biomed. Pharmacother. 2018. Vol. 107. P. 571-582. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.08.018

6. Lasota A., Danowask K.D. Experimental osteoporosis different methods ovariectomy in female white rats // Rocz. Akad. Med. Bialymst. 2004. Vol. 49. P. 129-131.

7. Корячкина С.Я., Ладнова О.Л., Люблинский С.Л., Холодова Е.Н. Эффективность применения обогащенных хлебобулочных изделий в питании детей // Вопросы питания. 2015. Т. 84, № 3. С. 77-84.

8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А.Н. Миронова и др. Москва : Гриф и К, 2012. Ч. 1. 944 с.

9. Нилова Л.П., Пилипенко Т.В. Оценка антиоксидантных свойств обогащенных хлебобулочных изделий в эксперименте на лабораторных животных // Вопросы питания. 2016. Т. 85, № 6. С. 39-47.

10. Shin Y.-H., Cho D.-C., Yu S.-H. et al. Histomorphometric analysis of the spine and femur in ovariectomized rats using micro-computed tomographic scan // J. Korean Neurosurg. Soc. 2012. Vol. 52, N 1. P. 1-6. DOI: https://doi.org/10.3340/jkns.2012.52.1.1

11. Reddi S., Mada S.B., Kumar N. et al. Antiosteopenic effect of buffalo milk casein-derived peptide (NAVPITPTL) in ovariectomized rats // Int. J. Pept. Res. Ther. 2018. Vol. 25. P. 1147-1158. DOI: https://doi.org/10.1007/s10989-018-9763-0

12. Lizneva D., Yuen T., Sun L. et al. Emerging concepts in the epidemiology, pathophysiology, and clinical care of osteoporosis across the menopausal transition // Matrix Biol. 2018. Vol. 71-72. P. 70-81. DOI: https://doi.org/10.1016/j.matbio.2018.05.001

13. Giaze T.R., Shuid A.N., Soelaiman I.N. et al. Comparative anti-osteoporotic properties of the leaves and roots of Marantodes pumilum var. alata in postmenopausal rat model // J. Tradit. Complement. Med. 2019. Vol. 9, N 4. P. 393-400. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jtcme.2019.01.002

14. Hayatullina Z., Muhammad N., Mohamed N., Soelaiman I.-N. Virgin coconut oil supplementation prevents bone loss in osteoporosis rat model // Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2012. Vol. 2012. Article ID 237236. DOI: https://doi.org/10.1155/2012/237236

15. Palumbo C., Ferretti M., Bertoni L. et al. Influence of ferutinin on bone metabolism in ovariectomized rats. I: role in preventing osteoporosis // J. Bone Miner. Metab. 2009. Vol. 27, N 5. P. 538-545. DOI: https://doi.org/10.1007/s00774-009-0070-x

16. Bhardwaj P., Rai D.V., Garg M.L. Zinc inhibits ovariectomy induced microarchitectural changes in the bone tissue // J. Nutr. Intermed. Metab. 2016. Vol. 3. P. 33-40. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jnim.2015.12.333

17. Воропаева А.А., Фаламеева О.В., Садовой М.А. и др. Протеазы и их сывороточные ингибиторы у овариэктомированнных самок крыс Wistar при развитии остеопороза // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 6. URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=23768 (дата обращения: 12.03.2020)

18. Schulz S., O’Loughlin P., Morris H. Reduced dietary phosphate improves calcium balance in the ovariectomized rat // Bone. 2000. Vol. 27, N 4. P. 40. DOI: https://doi.org/10.1016/s8756-3282(00)80139-8

19. Shang N., Wu J. Nutrients for bone health // Reference Module in Food Science. Encyclopedia of Food Chemistry. 2018. Vol. 3. P. 349-356. DOI: https://doi.org/10.1016/b978-0-08-100596-5.21744-7

20. Kruger M.C., Plimmer G.G., Schollum L.M. et al. The effect of whey acidic protein fractions on bone loss in the ovariectomised rat // Br. J. Nutr. 2005. Vol. 94, N 2. P. 244-252. DOI: https://doi.org/10.1079/bjn20051454

21. Bihuniak J.D., Insogna K.L. The effects of dietary protein and amino acids on skeletal metabolism // Mol. Cell. Endocrinol. 2015. Vol. 410. P. 78-86.

22. Torricelli P., Fini M., Giavaresi G., Giardino R. Human osteopenic bone derived osteoblasts: essential amino acids treatment effects // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2003. Vol. 31, N 1. P. 35-46. DOI: https://doi.org/10.1081/bio-120018002

23. Ковальчук П.Є., Гасько М.В., Тулюлюк С.В. Репаративний остеогенез у нормі та за умов дефіциту мікроелементів йоду та селену // Международный эндокринологический журнал. 2015. № 3 (67). С. 61-64.

24. Пузиков А.М. Коррекция остеопороза в эксперименте // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2014. № 2 (102). C. 25-31.

25. Benayahu D., Peled A., Zipori D. Myeloblastic cell line expresses osteoclastic properties following coculture with marrow stromal adipocytes // J. Cell. Biochem. 1994. Vol. 56, N 3. P. 374-384. DOI: https://doi.org/10.1002/jcb.240560314

26. Flynn A. The role of dietary calcium in bone health // Proc. Nutr. Soc. 2003. Vol. 62, N 4. P. 851-858. DOI: https://doi.org/10.1079/pns2003301

27. Juma S., Sohn E., Arjmandi B.H. Calcium-enriched bread supports skeletal growth of young rats // Nutr. Res. 1999. Vol. 19, N 3. P. 389-399. DOI: https://doi.org/10.1016/S0271-5317(99)00008-1

28. Drew J.E., Reichardt N., Williams L.M. et al. Dietary fibers inhibit obesity in mice, but host responses in the cecum and liver appear unrelated to fiber-specific changes in cecal bacterial taxonomic composition // Sci. Rep. 2018. Vol. 8, N 1. Article ID 15566. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-018-34081-8

SCImago Journal & Country Rank
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Медицина сегодня
I Всероссийский форум "Актуальные вопросы медицинского права"

I Всероссийский форум "Актуальные вопросы медицинского права" 18-19 февраля 2021 года в режиме онлайн состоится Первый Всероссийский форум "Актуальные вопросы медицинского права". Мероприятие будет посвящено современным особенностям правового регулирования самых насущных...

I Всероссийский Конгресс с международным участием по фундаментальным проблемам лабораторной диагностики

I Всероссийский Конгресс с международным участием по фундаментальным проблемам лабораторной диагностики "Академия лабораторной медицины: новейшие достижения" 25-27 мая 2021 года в МВЦ "Крокус Экспо" состоится значимое событие в мире лабораторных исследований - I...

Онлайн конференция педиатров "Трудный диагноз: разбор клинических случаев",

Уважаемые коллеги! Приглашаем вас принять участие в работе III Научно-практической онлайн конференции педиатров "Трудный диагноз: разбор клинических случаев" , которая состоится 8-9 февраля 2021 года Организаторы: · ГБУЗ "Детская городская клиническая больница имени З.А...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»