Разработка и валидация методики количественного определения сибутрамина в биологически активных добавках к пище методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Резюме

Сибутрамин является высокоэффективным средством для лечения ожирения. Недобросовестные производители биологически активных добавок (БАД) к пище, предназначенных для лиц, контролирующих массу тела, могут добавлять сибутрамин - запрещенное к использованию в составе БАД к пище биологически активное синтетическое вещество - для достижения заявленного эффекта. В связи с этим разработка и валидация методов количественного определения сибутрамина в БАД к пище для контроля качества, выявления недоброкачественных БАД к пище и предотвращения незаконного оборота таких БАД к пище является особенно актуальной, учитывая масштабы реализации данной продукции.

Цель исследования - разработать методику количественного определения сибутрамина в БАД к пище, предназначенных для снижения массы тела, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и провести ее валидацию.

Материал и методы. Количество сибутрамина в БАД к пище определяли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в режиме изократического элюирования, использовали высокоэффективный жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым (УФ) детектором, в качестве неподвижной фазы использовали хроматографическую колонку С18 NUCLEOSIL размером 4,6x150 мм, размер частиц сорбента 5 мкм. Подвижная фаза содержит 0,05 М формиатный буфер pH 4,0 и ацетонитрил в соотношении 40:60 (по объему).

Результаты и обсуждение. Разработана методика определения сибутрамина в составе БАД к пище, позволяющая проводить контроль качества. На основании полученных хроматограмм определена специфичность, при этом показано, что растительные компоненты не влияют на определение сибутрамина в модельных смесях. Определена пригодность хроматографической системы: фактор удерживания соединения - 2,222 (>2,0), N - 5776 теоретических тарелок (>5000), Т пика сибутрамина - 0,939 (<1,5). В пределах аналитической области методики показана линейность: R2 = 0,9993 (>0,9950). ε=0,46% (≤1,5%), доверительный интервал включает значение 100%, расчетное значение критерия Стьюдента tрасч (2,47) меньше табличного tтабл (2,80), что доказывает правильность методики. Прецизионность результатов определяют благодаря полученному значению коэффициента вариации (RSD), который составляет 0,91% (не превышает 1%). Пределы обнаружения (LOD) и количественного определения (LOQ) составляют соответственно 0,1 и 1,0%. Диапазон измеряемых концентраций: 0,01-20,0 мг/г.

Заключение. В результате проведенных исследований методика определения сибутрамина в многокомпонентных БАД к пище, предназначенных для лиц, контролирующих массу тела, была валидирована и может применяться при контроле их качества.

Ключевые слова:сибутрамин, высокоэффективная жидкостная хроматография, валидация, биологически активные добавки к пище, контроль качества

Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств госбюджета на выполнение государственного задания по НИР.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Для цитирования: Суханова А.М., Перова И.Б., Кошечкина А.С., Рылина Е.В., Тумольская Е.В., Родионова ГМ. Разработка и валидация методики количественного определения сибутрамина в биологически активных добавках к пище методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Вопросы питания. 2020. Т 89, № 6. С. 123-129. DOI: 10.24411/0042-8833-2020-10085

По данным Росстата за 2019 г., избыточная масса тела наблюдалась у 62% взрослого населения, а ожирение - у каждого 5-го российского гражданина [1].

Первой линией терапии ожирения является изменение образа жизни (рациональное питание, включающее снижение энергопотребления, повышение физической активности, поведенческая терапия), однако в силу занятости многие люди прибегают к наиболее простому способу снижения массы тела - приему анорексигенных лекарственных препаратов.

На данный момент самым эффективным лекарственным препаратом анорексигенного действия является сибутрамин - ингибитор обратного захвата норэпинефрина и серотонина [2]. Согласно постановлению Правительства РФ от 29.12.2007 № 964 (ред. от 19.12.2018) "Об утверждении списков сильнодействующих и ядовитых веществ для целей статьи 234 и других статей Уголовного кодекса Российской Федерации, а также крупного размера сильнодействующих веществ для целей статьи 234 Уголовного кодекса Российской Федерации" сибутрамин входит в Перечень сильнодействующих и ядовитых веществ, поэтому отпуск данного лекарственного средства осуществляется строго по рецепту врача [3]. В связи с этим недобросовестные производители биологически активных добавок (БАД) к пище нелегально добавляют сибутрамин для достижения заявленной ими эффективности [3].

В США сибутрамин был запрещен в 2010 г. решением Food and Drug Administration (FDA) по результатам исследования The recent Sibutramine Cardiovascular Outcomes Trial (SCOUT), в котором участвовало 300 медицинских центров из 17 стран мира с привлечением пациентов старше 55 лет, имеющих сердечно-сосудистые заболевания или предрасположенность к ним, а также сахарный диабет [4-6]. Сибутрамин находится под запретом в Европе, Индии, Китае, Гонконге, Новой Зеландии, Таиланде. Кроме того, сибутрамин входит в запрещенный список Всемирного антидопингового кодекса 2020 г.

Эффекты сибутрамина преимущественно обусловлены двумя образующимися под влиянием изофермента CYP3A4 цитохрома P450 фармакологически активными метаболитами (М1 - десметилсибутрамин и М2 - дидесметилсибутрамин), период полувыведения которых составляет 14 и 16 ч, а сибутрамина - 1,1 ч [2, 7].

Несмотря на свою высокую эффективность сибутрамин способен вызывать множество побочных эффектов [2]. Со стороны сердечно-сосудистой системы наблюдаются тахикардия, повышение артериального давления; со стороны органов желудочно-кишечного тракта - анорексия, тошнота, диспепсия; со стороны опорно-двигательного аппарата - артралгия, миалгия, заболевания суставов; со стороны нервной системы - нервозность, сухость во рту, инсомния, тревога, депрессия. При проведении двойного слепого исследования риск возникновения инсульта значительно выше у пациентов, принимавших сибутрамин, по сравнению с теми, кто употреблял плацебо [2, 8-12].

Высокая терапевтическая активность субстанции сибутрамина побудила недобросовестных производителей БАД к пище для похудения добавлять в свою продукцию активную фармацевтическую субстанцию для достижения заявленного ими эффекта.

Подобные манипуляции были незамедлительно установлены правоохранительными органами, осуществляющими мониторинг биологически активных синтетических веществ, запрещенных к использованию в составе БАД к пище на разных стадиях оборота и распространения указанной продукции (таможня, контрольно-аналитические лаборатории) согласно Техническому регламенту Таможенного союза ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции".

В связи с этим необходимо использовать весь комплекс современных физико-химических методов исследования для контроля качества БАД к пище и проведения их санитарно-эпидемиологической экспертизы. Для создания обоснованных критериев оценки полученных результатов необходимо утверждение валидированных методик идентификации и количественного определения активной фармацевтической субстанции - сибутрамина в БАД к пище - в качестве нормативной документации для использования в контрольно-аналитических лабораториях.

В современных ведущих фармакопеях для определения подлинности активных фармацевтических субстанций применяют основные физико-химические методы: инфракрасную и ультрафиолетовую (УФ) спектрофотометрию, поляриметрию, спектроскопию ядерного магнитного резонанса, хроматографию в тонком слое сорбента, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газовую хроматографию с использованием различных детекторов, а также капиллярный электрофорез [13-17].

По номенклатуре ИЮПАК (±)-1-(4-хлорфенил)-N,N-диметил-альфа-(2-метилпропил) циклобутанметанамин (рис. 1). Он представляет собой кристаллический порошок от белого до кремового цвета, растворимый в воде и метаноле, в связи с чем в качестве экстрагента целесообразно использовать данные растворители. Основываясь на физико-химических свойствах сибутрамина, можно сделать вывод, что ВЭЖХ с использованием УФ-детектора является наиболее специфичным и чувствительным аналитическим методом его контроля [14, 18, 19].

Рис. 1. Структурная формула сибутрамина

Fig. 1. The structural formula of sibutramine

Цель исследования - разработка и валидация аналитической методики определения сибутрамина в БАД к пище методом ВЭЖХ, включающая определение специфичности, линейности, правильности и прецизионности, пределов обнаружения и количественного определения в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации IV издания (ГФ XIV) с целью проведения контроля качества БАД к пище.

Материал и методы

Объектами исследования были стандарт сибутрамина гидрохлорида (Tocris, Великобритания) и в качестве модели - не содержащая сибутрамин многокомпонентная БАД к пище сложного состава растительного происхождения "Модельформ" (ООО "Промомед Рус", Россия), что было подтверждено отсутствием пика на уровне 5 мин при анализе исследуемых БАД к пище, не содержащих сибутрамин.

Раствор стандартного образца готовили растворением навески стандартного образца сибутрамина массой 0,010 г (точная навеска) в 10 мл метанола с дальнейшим 10-кратным разведением.

Для приготовления модельных смесей в отдельные мерные колбы помещали содержимое одной капсулы БАД к пище и определенное количество сибутра-мина (табл. 1), растворяли в 8 см3 метанола 100% (J.T. Baker, Польша), перемешивали, экстрагировали на ультразвуковой водяной бане. После доведения объема до метки растворителем и перемешивания центрифугировали при 15 000 об/мин с помощью ультрацентрифуги "Eppendorf" 5424 (Eppendorf, Германия). При необходимости проводили разведения (см. табл. 1).

Таблица 1. Приготовление модельных смесей

Table 1. Preparation of model mixtures

Определение проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в режиме изократического элюирования. Для хроматографирования использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф "Agilent 1100" (Agilent Technologies, США) с УФ-детектором. В качестве неподвижной фазы использовали хроматографическую колонку из нержавеющей стали С18 NUCLEOSIL (Macherey-Nagel, Германия) размером 4,6x150 мм, размер частиц сорбента - 5 мкм. Подвижная фаза содержит 0,05 М формиатный буфер pH 4,0 (аммония формиат - Honeywell, Германия; муравьиная кислота - Sigma-Aldrich, США) и ацетонитрил (PanReac AppliChem, Германия) в соотношении 40:60 (по объему).

Условия хроматографического разделения: скорость потока - 1 см3/мин; температура термостата колонки - 40 °C; длина волны детектирования - 225 нм; объем пробы - 5 мкм3; время анализа - 8 мин. Примерное время удерживания - 5 мин.

Диапазон измеряемых концентраций: 0,01-20,0 мг/г.

Результаты и обсуждение

Методика была валидирована на основании полученных результатов и их последующей статистической обработки, которую проводили в соответствии с Общей фармакопейной статьей "Статистическая обработка результатов эксперимента. ОФС.1.1.0013.15" (ГФ XIV) и руководством [20]. Оценивали аналитическую методику по показателям специфичности, линейности, правильности, прецизионности в соответствии с Общей фармакопейной статьей "Валидация аналитических методик. ОФС.1.1.0012.15" (ГФ XIV) [20].

Специфичность метода ВЭЖХ была доказана на основании полученных хроматограмм модельных смесей известного состава (сибутрамина и БАД к пище) и используемого растворителя (рис. 2).

При выбранных условиях время удерживания сибутрамина составляет 5 мин (см. рис. 2В), других компонентов БАД к пище - от 1,2 до 2 мин (см. рис. 2Б). Отсутствует наложение мешающих пиков из матрикса БАД (см. рис. 2Г).

Рис. 2. Хроматограмма, полученная методом высокоэффективной жидкостной хроматографии растворителя (А), биологически активной добавки к пище (Б), стандартного раствора сибутрамина (0,1 мг/см3) (В) и модельной смеси № 3 (Г)

По оси абсцисс - время удерживания, мин; по оси ординат - интенсивность сигнала, мВ.

Fig. 2. High performance liquid chromatography chromatogram of solvent (А); dietary supplements (B); sibutramine standard solution (0.1 mg/ml) (C) and model mixture N 3 (D)

Abscissa axis - retention time in min; ordinate axis - detector response, mAU.

Пригодность хроматографической системы определения сибутрамина методом ВЭЖХ оценивали путем многократного анализа стандартного образца сибутрамина: фактор удерживания соединения составил 2,222 (>2,0), эффективность колонки (N) - 5776 теоретических тарелок (>5000), асимметрия пика (Т) сибутрамина - 0,939 (не превышает 1,5). Таким образом, была подтверждена пригодность хроматографической системы.

Линейность методики была исследована на 5 модельных смесях с содержанием исследуемого вещества от 80 до 120% от предполагаемого номинального значения, тем самым определяется аналитическая область методики (рис. 3).

Коэффициент корреляции R2 составил 0,9993 (>0,9950) при у = 9297,2х + 186,08 - концентрация (мг/см3), у - площадь пика].

Правильность методики была продемонстрирована определением степени извлечения сибутрамина, введенного в модельные смеси.

Из данных табл. 2 следует, что извлечение сибутрамина из модельных смесей в условиях эксперимента проходит полностью, относительная ошибка единичного определения не превышает 1,5% (0,46%). Доверительный интервал X ± ΔХ (99,55±0,46)% включает 100%, расчетное значение критерия Стьюдента (tрасч. = 2,47) меньше табличного (tтабл. = 2,8), а следовательно, методика правильна, систематическая ошибка отсутствует.

Таблица 2. Результаты определения правильности методики количественного определения сибутрамина в биологически активных добавках к пище

Table 2. The results of determining the correctness of the methodology for the quantitative determination of sibutramine in dietary supplements

Рис. 3. График линейной зависимости площади пика (S) от концентрации (С) сибутрамина в модельных смесях

Fig. 3. The graph of the linear dependence of the peak area (S) on the concentration (C) of sibutramine in model mixtures

Для оценки прецизионности (сходимости) результатов был рассчитан коэффициент вариации (RSD), не превышающий 1% (0,91%).

Заключение

По результатам, полученным при проведении валидации методики количественного определения сибутрамина в БАД к пище, установлено, что разрабатываемая методика отвечает требованиям специфичности, правильности и прецизионности (сходимости), предъявляемым к методикам количественного определения.

Основываясь на представленных данных, методику количественного определения сибутрамина можно рассматривать как пригодную для контроля качества БАД к пище для снижения массы тела.

Литература

1. Федеральная служба государственной статистики. URL: https://www.gks.ru/ (дата обращения: 17.03.2020)

2. Регистр лекарственных средств России. URL: https://www.rlsnet.ru/ (дата обращения: 17.03.2020)

3. Суханова А.М., Перова И.Б., Родионова Г.М. и др. Использование сибутрамина в лекарственных препаратах и БАД к пище анорексигенного действия // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2019. Т. 8, № 1. С. 97-101.

4. Ершова Е.В., Кошмилова К.А., Галиева М.О. Сибутрамин: мифы и реальность // Ожирение и метаболизм. 2014. № 4. С. 12-17.

5. Longo M., Zatterale F., Naderi J. et al. Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications // Int. J. Mol. Sci. 2019. Vol. 20, N 9. P. 2358. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20092358

6. Mechcatie E. Abbott pulls weight-loss drug sibutramine from market // Skin Allergy News. 2010. Vol. 41, N 11. P. 10.

7. Руяткина Л.А., Руяткин Д.С. Ожирение: "перекрестки" мнений, знаний и возможностей // Другие проблемы эндокринологии. 2020. № 7. P. 108-120. DOI: https://doi.org/10.21518/2079-701X-2020-7-108-120

8. Chen K.Y., Brychta R.J., Abdul Sater Z. et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity // J. Biol. Chem. 2020. Vol. 295, N 7. P. 1926-1942. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.REV119.007363

9. Aguilera C., Labbe T., Busquets J. et al. Obesity: risk factor or primary disease? // Rev. Med. Chil. 2019. Vol. 147, N 4. P. 470-474. DOI: https://doi.org/10.4067/S0034-98872019000400470

10. World Health Statistics 2018: Monitoring Health for the SDGs, Sustainable Development Goals. World Health Organization, 2018. P. 18-20.

11. Logvinova O., Kuznetsova P., Tsvetkova E. Study of the effect of sibutramine on central mechanisms of regulation of eating behavior in patients with obesity by means of fMRI. Preliminary results // Endocrine Abstracts. 2020. Vol. 70. P. 311. DOI: https://doi.org/10.1530/endoabs.70.AEP311

12. Smith G.I., Mittendorfer B., Klein S. Metabolically healthy obesity: facts and fantasies // J. Clin. Invest. 2019. Vol. 129, N 10. P. 3978-3989. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI129186

13. Zhong Y., Sun C., Xiong J. et al. Simultaneous determination of eight adulterants in weight management supplements and herbs by HPLC-DAD and LC-MS/MS // J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2017. Vol. 40, N 12. P. 640-648. DOI: https://doi.org/10.1080/10826076.2017.1343730

14. Zaharieva Z., Tanev D., Danalev D. Development and validation of HPLC/DAD method for simultaneously determination of six prohibited substances in model matrices // Acta Chromatogr. 2019. Vol. 32, N 4. P. 1-5. DOI: https://doi.org/10.1556/1326.2019.00749

15. Wang D., Man R., Shu M. et al. Detection of sibutramine and phenolphthalein in functional foods using capillary electrophoresis // Anal. Methods. 2016. Vol. 8, N 3. P. 621-626. DOI: https://doi.org/10.1039/C5AY02973B

16. Strano-Rossi S., Colamonici C., Botrè F. Detection of sibutramine administration: a gas chromatography/mass spectrometry study of the main urinary metabolites // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007. Vol. 21, N 6. P. 79-88. DOI: https://doi.org/10.1002/rcm.2807

17. Monakhova Y.B., Kuballa T., Löbell-Behrends S. et al. Standardless 1H NMR determination of pharmacologically active substances in dietary supplements and medicines that have been illegally traded over the Internet // Drug Test. Anal. 2013. Vol. 5, N 6. P. 400-411. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.1367

18. Kamardi T., Fidrianny I., Musadad A. Development of analytical method for identification of sibutramine hydrochloride in traditional medicine using solid phase extraction: high-perfomance liquid chromatography // Asian J. Pharm. Clin. Res. 2016. Vol. 9, N 6. P. 201-209. DOI: https://doi.org/10.22159/ajpcr.2016.v9i6.14174

19. Hammadi R., Amer Almardini M. A fully validated HPLC-UV method for quantitative and qualitative determination of six adulterant drugs in natural slimming dietary supplements // Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res. 2014. Vol. 29, N 1. P. 171-174.

20. Береговых В.В. (ред.). Валидация аналитических методик для производителей лекарств. Москва : Литтерра, 2008. 132 c.

SCImago Journal & Country Rank
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Медицина сегодня
II Конференция онкологов Московской области Москва, 4 июня 2021 года

II Конференция онкологов Московской области Москва, 4 июня 2021 года Подмосковье в настоящее время - это регион, переживающий бурный прирост населения и активную урбанизацию. Эти процессы требуют изменений в организации оказания медицинской помощи, в первую очередь,...

Конференция "Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии".

Приглашаем вас принять активное участие в работе XII Международной конференции "Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии". Мероприятие пройдет 28-29 мая 2021 года в онлайн-формате. Конференция организована при поддержке Министерства...

"Репродуктивное здоровье и эпидемия COVID-19: год спустя" 8 июня 2021 г., онлайн

Конференция РАРЧ "Репродуктивное здоровье и эпидемия COVID-19: год спустя" 8 июня 2021 г., онлайн Коронавирусная инфекция внесла существенные коррективы в работу специалистов в области репродуктивного здоровья. За прошедший год мы преодолели множество совершенно необычных...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»