Изучение контаминации сухофруктов микотоксинами

Резюме

Токсины микроскопических грибов - микотоксины (МТ) - относятся к природным контаминантам растительного сырья и продуктов его переработки. Вследствие высокого содержания сахаров фрукты особенно подвержены грибной инвазии и накоплению МТ в процессе вегетации, высушивания и хранения. Содержание наиболее опасных МТ [афлатоксинов (AFLs) и охратоксина А (OTA)] в сухофруктах регламентируется в ряде стран. В России максимально допустимый уровень этих МТ в сухофруктах не установлен.

Цель - изучение загрязненности сухофруктов, представленных на потребительском рынке РФ, широким спектром МТ: регламентируемыми в пищевых продуктах растительного происхождения, их производными и структурными аналогами и эмерджентными МТ.

Материал и методы. Определено содержание 32 МТ в 54 образцах сушеных фиников (n=11), абрикосов (n=9), изюма (n=9), чернослива (n=7), инжира (n=6), яблок (n=3) и компотной смеси (n=9) методом обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии ультравысокого давления с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (УВЭЖХ-МС/МС) в режиме электрораспылительной ионизации (положительной и отрицательной) при атмосферном давлении и динамического мониторинга избранных переходов.

Результаты. Основными контаминантами среди регламентируемых МТ оказались OTА (частота обнаружения 10%) и фумонизины (FBs, 17%). Среди эмер-джентных МТ - фузариотоксины энниатин А (22%) и боверицин (15%), микофеноловая и циклопиазоновая кислоты (МРА и СРА, по 19%), альтернариатоксин тентоксин (17%). 2/з контаминированных образцов содержали 2 МТ и более.

Заключение. Для сухофруктов характерна совместная контаминация несколькими МТ. Характерным паттерном для изюма является сочетание ОТА и МРА, для инжира - FBs и CPA. На основании результатов исследования и данных литературы для сухофруктов актуален мониторинг загрязненности AFLs и ОТА, а для инжира - AFLs, ОТА, FBs и CPA.

Ключевые слова:микотоксин, безопасность пищевых продуктов, регламентируемые и эмерджентные микотоксины, продуценты микотоксинов, УВЭЖХ-МС/МС

Финансирование. Исследование выполнено при финансировании Российского научного фонда (проект № 18-16-00077 "Эмерджентные микотоксины в пищевых продуктах растительного происхождения: разработка методов анализа, изучение контаминации, видовая характеристика микромицетов-продуцентов, разработка гигиенических нормативов").

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Для цитирования: Чалый З.А., Киселева М.Г., Седова И.Б., Минаева Л.П., Шевелева С.А., Тутельян В.А. Изучение контаминации сухофруктов микотоксинами // Вопросы питания. 2021. Т 90, № 1. С. 33-39. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-1-33-39

Спрос на натуральные и "здоровые" продукты способствует росту потребления сухофруктов. По оценкам экспертов, ежегодный прирост рынка сухофруктов в России составляет 1-2%. Большая часть представленной на российском рынке продукции имеет импортное происхождение. Страны с тропическим и субтропическим климатом - наиболее крупные производители сухофруктов на мировом рынке. Турция поставляет большую часть сушеного инжира, абрикосов и изюма. Экспортерами фиников являются главным образом Ирак, Пакистан, Иран и Тунис, а чернослива - США, Чили и Аргентина. На российском рынке также присутствует продукция средней полосы и юга России (сушеные яблоки и груши). На территории стран Таможенного союза требования безопасности к сухофруктам (Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции") включают микробиологические нормативы и максимально допустимые уровни (МДУ) токсичных элементов: тяжелые металлы, пестициды и микотоксин патулин для сушеных яблок. Высокое содержание углеводов обусловливает подверженность этого вида пищевой продукции грибной инвазии и контаминации их вторичными метаболитами - микотоксинами (МТ). При этом контаминация микромицетами может происходить как в период вегетации (фитопатогены родов Alternaria и Fusarium), так и в период уборки и хранения (сапрофиты родов Aspergillus, Penicillium) [1, 2].

Для продукции стран с жарким и влажным климатом наиболее характерна контаминация микромицетами родов Aspergillus и Penicillium - продуцентами наиболее опасных МТ - афлатоксинов (AFLs) и охратоксина А (ОТА). Согласно данным литературы, они преимущественно накапливаются в сушеных финиках, инжире и изюме [3]. До половины образцов могут быть контаминированы AFLs и OTA, а содержание этих токсинов достигает десятков мкг/кг фиников [4-9], инжира [4-6, 8, 10-15], изюма [4-9, 13, 14], а также абрикосов [4, 5, 8, 9, 13], чернослива [4, 8]. Показано, что изюм может вносить существенный вклад в поступление ОТА с пищей [1]. Актуальность настоящего исследования обоснована увеличением потребления сухофруктов и отсутствием данных о загрязненности МТ сухофруктов, присутствующих на отечественном рынке.

Цель исследования - изучение загрязненности сухофруктов, представленных на потребительском рынке РФ, микотоксинами: дезоксиниваленолом (DON), фузарено-ном Х (4-ацетилниваленол, FusX), 3- и 15-ацетил-дезокси-ниваленолом (3- и 15-AcDON), неосоланиолом (NeoS), T-2 триолом (Т-2 triol), диацетоксискирпенолом (DAS), афлатоксинами B1, В2, G1 и G2 (AFL B1, В2, G1 и G2), альтенуеном (ALT), НТ-2 токсином (НТ-2), тентоксином (TE), Т-2 токсином (Т-2), цитреовиридином (CTV), OTA, стеригматоцистином (STC), α- и β-зеараленолом (α- и β-ZEL), зеараленоном (ZEA), альтернариолом (АОН), метиловым эфиром альтернариола (АМЕ), боверицином (BEA), энни-атинами А и В (ENN A, B) фумонизинами В1 и В2 (FB1 и FB2), ниваленолом (NIV), микофеноловой кислотой (MPA), цитринином (CIT), циклопиазоновой кислотой (CPA).

Материал и методы

Исследовано 54 образца сухофруктов: финики (11), абрикосы (9), изюм (9), чернослив (7), инжир (6), яблоки (3) и смесей сухофруктов (9 компотных смесей). Образцы сухофруктов были отобраны из розничной торговой сети Московского региона в 2019 г.

Определение 32 МТ проводили методом обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии ультравысокого давления с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (УВЭЖХ-МС/МС) в режиме электрораспылительной ионизации (положительной и отрицательной) при атмосферном давлении и динамического мониторинга избранных переходов. УВЭЖХ-система (Vanquish UHPLC) состояла из бинарного градиентного насоса, термостата колонок, автосамплера и была соединена с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором с подогреваемым источником (TSQ Endura), контроль осуществляли посредством ПО Xcalibur 4.0 QF2 Software (все Thermo Scientific, США).

Метод I (детектирование DON, FusX, 15-AcDON, 3-AcDON, NeoS, T-2 triol, DAS, AFL G2, ALT, AFL G1, HT-2, AFL B2, TE, AFL B1, T-2, CTV, β-ZEL, OTA, STC, α-ZEL, ZEA, AOH, AME, BEA, ENN B, FB1, ENN A, FB2). Хроматографическая колонка: Ascentis Express F5 100x3,0 мм, 2,7 мкм. Подвижные фазы: (А) вода : метанол (95:5, % об.); (В) метанол : вода (95:5, % об.), обе подкислены муравьиной кислотой (0,1% об.). Схема градиента: старт - 40% B, линейный рост до 95% В в течение 15 мин, до 22 мин - 95% В, линейное уменьшение до 40% В в течение 1 мин, уравновешивание до 27 мин.

Метод II (детектирование NIV, MPA, CIT, CPA). Хроматографическая колонка: Titan C18, 100x2,1 мм, 1,9 мкм.

Подвижные фазы: (А) вода, 5 мМ формиат аммония, рН 7; (В) метанол, 5 мМ формиат аммония. Схема градиента: старт - 5% B, линейный рост до 75% B в течение 10 мин, линейный рост до 95% B в течение 0,5 мин, до 15,5 мин - 95% В, линейное уменьшение до 5% В в течение 0,5 мин, уравновешивание до 19 мин.

В обоих методах скорость потока элюента -0,4 см3/мин; температура колонки - 25 °C; объем вводимой пробы - 5-10 мм3. Для увеличения чувствительности детектирования и уменьшения загрязнения источника использовали послеколоночный Т-сплиттер, обеспечивающий разделение потока 1:9, что соответствует потоку, подаваемому на масс-спектрометр, 0,04 см3/мин. Анализ образцов проводили в 3 повторностях. Для количественного определения использовали градуировки на соответствующей "чистой" матрице. Степень извлечения МТ варьировала от 60 до 91%, стандартное отклонение - 4,1-25,7% (n=3, концентрация МТ в искусственно загрязненной пробе соответствовала уровню 2,5 минимальной определяемой концентрации).

Использованы стандарты: AFL B1, AFL B2, AFL G1, AFL G2, STC, T-2, HT-2, DON, 3-AcDON, 15-AcDON, CIT, FB1, FB2, ZEA, α- и β-ZEL, α- и β-ZAL, OTA (чистота ≥98%), DAS, NIV (98,2%), FusX (98,7%) (Sigma Aldrich, США); AOH (99,3%), AME (99,77%), ALT (98%), BEA (99,31%), CTV (97%), CPA (98%), ENN A (99,68%), ENN B (99,62%), MPA (99,59%), NeoS (99%), триол Т-2 (99%), ТЕ (99,84%) (Fermentek, Израиль). Исходные растворы готовили в ацетонитриле (AFLs, STC, A и B трихотецены, кроме NeoS, CIT, ZEA и аналогов, OTA, MPA), метаноле (токсины Alternaria, ENNs и BEA, CTV, CPA, MPA, NeoS) или смеси ацетонитрила с водой, 50/50, об./об. (FB1, FB2) в концентрации 100 или 500 мкг/см3. Все исходные растворы хранили при -18 °C.

Подготовка образцов для анализа МТ. Представительную пробу сухофруктов 100-250 г измельчали в мясорубке (мякоть); в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 вносили 5 г образца и 6 см3 5% раствора уксусной кислоты. Далее перемешивали 30 с на микро-центрифуге-вортексе FVL-2400N (SIA BIOSAN, Латвия), обрабатывали в ультразвуковой ванне Elmasonic S 15H (Elma, Германия) в течение 10 мин, повторно перемешивали еще 30 с, при необходимости использовали гомогенизатор. Затем вносили 24 см3 ацетонитрила (в 2 приема, каждый раз тщательно перемешивая пробу) и повторно обрабатывали в ультразвуковой бане 10 мин, перемешивали 30 с на вортексе и центрифугировали с ускорением около 100g. К 1 см3 надосадочной жидкости добавляли 1 см3 воды (milli-Q) и повторно центрифугировали в течение 10 мин. Полученный супернатант в объеме 1 см3 вносили в хроматографическую виалу для анализа.

Результаты

При скрининге в сухофруктах были обнаружены 13 из 32 МТ (см. таблицу), в частности: ОТА - в 44% образцах изюма в количестве до 2,5 мкг/кг и в 1 из 9 образцов компотной смеси - 5,2 мкг/кг. 9% всех исследованных образцов содержали этот МТ. Фумонизины FВ1 и FВ2) были выявлены во всех исследованных видах сухофруктов, за исключением яблок и изюма. FB1 детектировали в инжире (до 67%), где его максимальное содержание достигало 81,3 мкг/кг, реже - в компотной смеси (22%), на уровне ниже предела количественного определения (ПКО). В 2 образцах чернослива в следовых количествах были обнаружены AFL B2 и G2, AFL B1 ни в одном из исследованных образцов не обнаружен. Среди эмерджентных МТ самая высокая частота обнаружения была зафиксирована для ENN A, MPA и СРА. ВЕА и вторичный метаболит Alternaria ТЕ были выявлены, соответственно, в 15 и 17% образцов. Наибольший спектр из всех исследованных МТ был выявлен в компотных смесях, что, по-видимому, обусловлено мультикомпонентным составом образцов. Среди монокомпонентных образцов в инжире обнаружено 6 МТ: фузариотоксины FBs, ENNs и BEA, а также метаболит Alternaria AOH и Penicillium - CPA. В образцах сушеных фиников, изюма и чернослива было обнаружено по 5 МТ, причем в финиках и черносливе - на уровне следовых количеств; в абрикосах и яблоках - по 2 МТ.

Контаминация исследованных образцов сухофруктов микотоксинами

Mycotoxins in the studied dried fruit samples

Примечание. * - N - количество исследованных образцов; ** - ПКО - предел количественного определения (<ПКО - следовые количества).

Сокращенные названия: афлатоксины Bl, В2, G1 и G2 (AFL Bl, В2, G1 и G2), охратоксин А (ОТА), фумонизины В1 и В2, их совместное присутствие (FBI и FB2, FBI + FB2)), энниатины А и В (ENN А и В), боверицин (ВЕА), тентоксин (ТЕ), альтернариол (AOFi), метиловый эфир альтернариола (АМЕ), микофеноловая кислота (МРА), циклопиазоновая кислота (СРА).

Note. * - N - total number of studied samples; ** - ПКО (LOQ) - limit of quantification, [<ПКО (<LOQ) - traces].

Abbreviations for mycotoxins: aflatoxins Bl, B2, G1 and G2 (AFL Bl, B2, G1 and G2), ochratoxin A (OTA), fumonisins Bl and B2 and their combinations (FBI, FB2 and FBI + FB2), enniatins A, В (ENN A, B), beauvericin (BEA), tentoxin (ТЕ), alternariol (AOFi), alternariol methyl ether (AME), mycophenolic acid (MPA), cyciopiazonic acid (CPA).

Обсуждение

В исследованных образцах сухофруктов обнаружены МТ: FBs, OTA, AFL В2 и G2. Частота обнаружения FB1 составила 17%; FB2 - 10%, OTA - 10%, AFL В2 и G2 выявлены в 1 пробе на уровне ниже ПКО. Среди эмерджентных МТ наиболее часто обнаруживались фузариотоксины ENN А (22%) и BEA (15%), вторичные метаболиты Penicillium и Aspergillus МРА и СРА (по 19%), токсин Alternaria TE (17%). 2/3 контаминированных образцов содержали 2 МТ и более.

Для изюма характерным паттерном оказалось сочетание ОТА и МРА, для инжира - фумонизинов и CPA. Исходя из уровней потребления сухофруктов [16] был оценен потенциальный вклад изюма и компотной смеси в величину поступления ОТА с пищей: для изюма он составил 2,3 нг на 1 кг массы тела в неделю (2% от условно переносимого недельного поступления ОТА с пищей, равного 100 нг на 1 кг массы тела в неделю [17]), для компотной смеси - 4,8 нг на 1 кг массы тела в неделю (5% от условно переносимого недельного поступления).

В ряде стран установлены максимальные уровни содержания МТ в сухофруктах. В странах Европейского союза МДУ для сухофруктов, предназначенных для их непосредственного потребления, составляют для AFL B1 - 2 мкг/кг, суммы афлатоксинов - 4 мкг/кг, в сухофруктах, предназначенных для дальнейшей переработки: AFL B1 - 5 мкг/кг, суммы AFL - 10 мкг/кг, в инжире: AFL B1 - 6 мкг/кг, суммы AFL - 10 мкг/кг и OTA в изюме - 10 мкг/кг [18, 19]. В Турции, одном из основных производителей сухофруктов, установлены менее жесткие требования по отношению к содержанию AFL B1 (10 мкг/кг) [20, 21] в этой продукции, чем в Европейском союзе. Как уже было отмечено выше, в России регламентируется только содержание патулина в сушеных яблоках.

Заключение

Таким образом, настоящая работа свидетельствует о достаточно широком распространении МТ в сухофруктах. В частности, в них обнаружены метаболиты Aspergillus (АFL В2 и G2), Penicillium (ОТА, MPA, CPA), Fusarium (FBs, ENN A и B, BEA), Alternaria (ТЕ, АОН, AME). Полученные данные указывают на необходимость расширения исследований по выявлению AFLs и ОТА в сухофруктах, AFLs, ОТА, FBs и CPA - в инжире, и в дальнейшем рассмотрения вопроса о введении МДУ этих МТ в сухофруктах.

Литература

1. Ефимочкина Н.Р., Седова И.Б., Шевелева С.А., Тутельян В.А.Токсигенные свойства микроскопических грибов // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2019. Т. 45, № 1. С. 6-33. DOI: https://doi.org/10.17223/19988591/45/1

2. Barkai-Golan R., Paster N. Mouldy fruits and vegetables as a source of mycotoxins: part 1 // World Mycotoxin J. 2008. Vol. 1, N 2. P. 147-159. DOI: https://doi.org/10.3920/WMJ2008.x018

3. Drusch S., Ragab W. Mycotoxins in fruits, fruit juices, and dried fruits // J. Food Prot. 2003. Vol. 66, N 8. P. 1514-1527. DOI: https://doi.org/10.4315/0362-028x-66.8.1514

4. Asghar M.A., Ahmed A., Zahir E., Asghar M.A., Iqbal J., Walker G. Incidence of aflatoxins contamination in dry fruits and edible nuts collected from Pakistan // Food Control. 2017. Vol. 78. P. 169-175. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.02.058

5. Luttfullah G., Hussain A. Studies on contamination level of aflatoxins in some dried fruits and nuts of Pakistan // Food Control. 2011. Vol. 22, N 3. P. 426-429. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2010.09.015

6. Rahimi E., Shakerian A. Ochratoxin A in dried figs, raisings, apricots, dates on Iranian retail market // Health. 2013. Vol. 5, N 12. P. 2077-2080. DOI: https://doi.org/10.4236/health.2013.512282

7. Han Z., Dong M., Han W., Shen Y., Nie D., Shi W. et al. Occurrence and exposure assessment of multiple mycotoxins in dried fruits based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry // World Mycotoxin J. 2016. Vol. 9, N 3. P. 465-474. DOI: https://doi.org/10.3920/WMJ2015.1983

8. Azaiez I., Font G., Mañes J., Fernández-Franzón M. Survey of mycotoxins in dates and dried fruits from Tunisian and Spanish markets // Food Control. 2015. Vol. 51. P. 340-346. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.11.033

9. Wei D., Wang Y., Jiang D., Feng X., Li J., Wang M. Survey of alternaria toxins and other mycotoxins in dried fruits in China // Toxins. 2017. Vol. 9, N 7. P. 200. DOI: https://doi.org/10.3390/toxins9070200

10. Erdoğan A., Gurses M., Sert S. Erzurum’da Satışa Sunulan Köme (Cevizli Pestil Sucuğu) ve Kuru İncirlerin Aflatoksin İçeriklerinin Saptanması // The Study for Aflatoxin Contamination of Köme (Dried Fruit Pulp Sausage with Walnut) and Dry Fig Samples Sold in Erzurum, Turkey // Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi. 2003. Vol. 34, N 1. P. 85-88.

11. Bulent K. Aflatoxins in hazelnuts and dried figs: occurrence and exposure assessment // Food Chem. 2016. Vol. 211. P. 8-16. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.04.141

12. Öztürk Yilmaz S. The contamination rate of aflatoxins in ground red peppers, dried figs, walnuts without shell and seedless black raisins commercialized in Sakarya City Center, Turkey // Ital. J. Food Sci. 2017. Vol. 29, N 4. P. 591-598.

13. Birkam C. Incidence of ochratoxin A in dried fruits and co-occurrence with aflatoxins in dried figs // Food Chem. Toxicol. 2009. Vol. 47, N 8. P. 1996-2001. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2009.05.008

14. Wang Yu., Nie J., Yan Zh., Li Zh., Cheng Y., Chang W. Occurrence and co-occurrence of mycotoxins in nuts and dried fruits from China // Food Control. 2018. Vol. 88. P. 181-189. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.01.013

15. Karbancioglu-Güler F., Heperkan D. Natural occurrence of ochratoxin A in dried figs // Anal. Chim. Acta. 2008. Vol. 617. P. 32‒36. DOI: https://doi.org/10.1016/j.aca.2008.01.009

16. Статистический бюллетень "Потребление продуктов питания в домашних хозяйствах" (по итогам обследования бюджетов домашних хозяйств). URL: https://rosstat.gov.ru/bgd/regl/b20_101/Main.htm

17. JECFA, 2007. Evaluation of certain food additives and contaminants (Sixty-eighth report) of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) // WHO Technical Report Series, 947. Geneva, Switzerland, 2007. P. 208.

18. Commission Regulation (EC) No 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs. 2006. P. 24.

19. Commission Regulation (EU) No 165/2010 of 26 February 2010 amending Regulation (EC) No 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards aflatoxins. 2010.

20. Turkish Food Codex, 2009. Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri Hakkında Tebliğde Değişiklik Yapılması Hakkında Tebliğ // Resmi Gazete. No. 2009/22. 16.02.2009.

21. Turkish Food Codex, 2008. Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri Hakkında Tebliğ // Resmi Gazete. No. 2008/26. 17.08.2008.

SCImago Journal & Country Rank
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Медицина сегодня
II Конференция онкологов Московской области Москва, 4 июня 2021 года

II Конференция онкологов Московской области Москва, 4 июня 2021 года Подмосковье в настоящее время - это регион, переживающий бурный прирост населения и активную урбанизацию. Эти процессы требуют изменений в организации оказания медицинской помощи, в первую очередь,...

Конференция "Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии".

Приглашаем вас принять активное участие в работе XII Международной конференции "Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии". Мероприятие пройдет 28-29 мая 2021 года в онлайн-формате. Конференция организована при поддержке Министерства...

"Репродуктивное здоровье и эпидемия COVID-19: год спустя" 8 июня 2021 г., онлайн

Конференция РАРЧ "Репродуктивное здоровье и эпидемия COVID-19: год спустя" 8 июня 2021 г., онлайн Коронавирусная инфекция внесла существенные коррективы в работу специалистов в области репродуктивного здоровья. За прошедший год мы преодолели множество совершенно необычных...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»