Оценка рисков для здоровья ферментного препарата - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы из Aspergillus awamori Xyl T-15

Резюме

Внедрение методов производства пищевой продукции с использованием микробного синтеза, в том числе генетически модифицированных (ГМ) микроорганизмов, на современном этапе позволяет увеличить объемы производства и снизить себестоимость пищевой продукции. Вместе с тем такая продукция в соответствии с ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции" относится к "продукции нового вида" и может быть размещена на рынке только после проведения оценки рисков для населения. Ранее в Российской Федерации в превентивном порядке была разработана методология оценки безопасности такой пищевой продукции. Появление новых данных и методов исследований в последние годы сделало необходимым совершенствование системы оценки рисков здоровью этой категории пищевой продукции.

Цель исследования - разработка подходов по совершенствованию системы оценки рисков пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза, на примере ГМ-штамма Aspergillus awamori Xyl T-15 и продуцируемого им ферментного препарата (ФП) - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы.

Материал и методы. В экспериментальных исследованиях использовали мышей линии ICR (CD-1) и крыс линии Wistar (самцов и самок). Проведены исследования вирулентности, способности к диссеминации внутренних органов ГМ-штамма Aspergillus awamori Xyl T-15. В отношении ФП - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы - проведены исследования острой и подострой (в течение 80 сут) токсичности.

Результаты. Представленные экспериментальные данные позволяют сделать заключение об авирулентности штамма A. awamori Xyl T-15, отсутствии у него способности к диссеминации внутренних органов. ФП (комплекс глюкоамилазы и ксиланазы из A. awamori Xyl T-15) обладает низкой пероральной острой токсичностью для крыс (LD50>5000 мг/кг). ФП при внутрижелудочном введении в дозах 10, 100 и 1000 мг на 1 кг массы тела в течение 80 сут не оказывал неблагоприятного влияния на скорость прибавки массы тела животных, показатели тревожности и когнитивной функции, а также на ряд изученных биохимических показателей. В дозе 100 мг на 1 кг массы тела и более отмечаются изменения в относительной массе органов (легкие, почки, надпочечники), небольшие по величине сдвиги в показателях эритропоэза и лейкоцитарной формуле, в дозе 1000 мг на 1 кг массы тела - усиление окислительной деструкции ДНК. Наиболее выраженным и дозозависимым является влияние ФП на апоптоз гепатоцитов. По этому показателю величина максимальной недействующей дозы (NOAEL) для ФП не превышает 100 мг на 1 кг массы тела в расчете на белок. Главным органом-мишенью токсического действия ФП является печень.

Заключение. Полученные данные делают необходимым проведение дополнительного анализа рисков возможного негативного действия ФП, а именно исследование его воздействия на микробиоценоз кишечника и иммунный статус подопытных животных, анализ наличия детерминант патогенности и антибиотикорезистентности ДНК селективных маркерных генов у штамма A. awamori Xyl T-15 с использованием методов полимеразной цепной реакции и секвенирования ДНК.

Ключевые слова:продукция нового вида, ферментный препарат, генетически модифицированный микроорганизм, штамм-продуцент, вирулентность, токсиколого-биохимические исследования

Финансирование. Исследование проведено за счет субсидии на выполнение государственного задания № 0529-2019-0057.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Для цитирования: Багрянцева О.В., Гмошинский И.В., Шипелин В.А., Цурикова Н.В., Шевелева С.А., Шумакова А.А., Мусаева А.Д., Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Сото Х.С., Минаева Л.П., Седова И.Б., Селифанов А.В., Соколов И.Е., Колобанов А.И., Хотимченко С.А. Оценка рисков для здоровья ферментного препарата - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы из Aspergillus awamori Xyl T-15 // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 3. С. 28-39. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-3-28-39

Современные биотехнологии интенсивно внедряются в процессы глубокой переработки сырья с получением разнообразного спектра пищевой продукции, включая диетические лечебные и функциональные пищевые продукты, пищевые добавки, ароматизаторы, спирт. Согласно законодательству Евразийской экономической комиссии (ЕАЭС) и Российской Федерации, такая продукция относится к продукции нового вида (Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции"), и ее использование не исключает определенные риски здоровью населения. Вместе с тем существующая в ЕАЭС и в Российской Федерации система оценки рисков и подтверждения соответствия установленным требованиям промышленных штаммов-продуцентов и пищевой продукции микробного синтеза нуждается в совершенствовании [1].

Цель исследования - обоснование необходимости актуализации системы оценки рисков использования пищевой продукции нового вида, производимой при помощи микробного синтеза, на примере рекомбинантного штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori Xyl T-15, являющегося продуцентом амилазы, ксиланазы и ряда других гликолитических ферментов.

Материал и методы

В соответствии с паспортом генетически модифицированный (ГМ) штамм A. awamori Xy 1-Т-15 получен на основе мутантного штамма-реципиента A. awamori ВУДТ-2 1000У (ВКМ F 3765), являющегося продуцентом глюкоамилазы, путем встраивания гена ксиланазы из штамма-донора Penicillium canescens (XylA) [2, 3]. Штамм A. awamori Xyl T-15 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. ГК. Скрябина РАН за № 4278D [2, 3].

С целью получения ферментного препарата (ФП) штамм A. awamori Xyl T-15 культивировали в питательной среде, изготавливаемой на основе кукурузной или пшеничной муки - 240 г/л. Условия культивирования в соответствии с паспортом штамма: рН среды 5,2-6,0; температура роста - 35 °С, продолжительность культивирования - 192 ч. Активность (продуктивность) штамма: глюкоамилолитическая активность - 400 ед/мл; ксиланазная активность - 100 ед/мл.

ФП - комплекс глюкоамилазы и ксиланазы предлагается для использования в спиртовой и хлебопекарной промышленности, а также при производстве кормов для животных с однокамерным желудком и птиц [2].

В экспериментальных исследованиях использовали аутбредных мышей линии ICR (CD-1) и крыс линии Wistar (самцов и самок), полученных из питомника "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Работу выполняли в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики [4] согласно ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами" и приказу Минздрава России от 01.04.2016 № 199н "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики".

Определение вирулентности ГМ-штамма A. awamori Xyl T-15 в эксперименте in vivo проводили в соответствии с МУК 2.3.2.1830-04 "Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов" путем определения средневирулентной дозы (LD50) для мышей ICR (CD-1) обоих полов массой тела 18-20 г в возрасте от 4 до 6 нед. Опытным группам мышей (8 самцов и 8 самок) вводили внутрибрюшинно (в/б) по 1 см3/20 г массы тела суспензии конидий штамма A. awamori Xyl T-15 в концентрации 1х109 КОЕ/см3. В контрольных группах (8 самцов и 8 самок) мышам в/б вводили по 1 см3/20 г массы тела стерильного апирогенного 0,9% раствора NaCl. На протяжении последующих 9 сут наблюдали за состоянием здоровья подопытных животных, определяли число летальных исходов. На 10-й день после введения суспензии конидий проводили эвтаназию путем ингаляции CO2.

Определение способности к диссеминации внутренних. органов ГМ-штамма A. awamori Xyl T-15 [5, 6] проводили с использованием 2 групп по 8 самцов и 2 групп по 8 самок крыс Wistar с исходной массой тела соответственно 230±10 и 200±10 г. После недельной адаптации к условиям вивария 1-й группе самцов и 1-й группе самок крыс вводили внутрижелудочно (в/ж) через зонд по 1 см3 (на 100 г массы тела) суспензии штамма A. awamori Xyl T-15 в концентрации 1Х1011 КОЕ/см3. В контрольных группах крысам вводили в/ж по 1 см3 (на 100 г массы тела) стерильного апирогенного 0,9% раствора NaCl. На 7-е сутки эксперимента проводили СО2-эвтаназию животных и вскрытие в асептических условиях.

Для оценки способности к диссеминации внутренних органов A. awamori Xyl T-15 проводили посев крови, отпечатков легких, сердца, печени, селезенки и почек на плотную среду Сабуро в стерильных условиях. Посевы отпечатков внутренних органов инкубировали в термостате при температуре 25±1 °С в течение 5 сут. Идентификацию микроорганизмов проводили путем изучения морфологии колоний, микроскопии мазков и определения дифференциально-диагностических биохимических свойств в соответствии с [6].

В эксперименте по изучению острой токсичности ФП-комплекса глюкоамилазы и ксиланазы использовали 2 группы по 8 самцов и 2 группы по 8 самок крыс с исходной массой тела соответственно 230±10 и 200±10 г. После недельной адаптации к условиям вивария 1-й группе самцов и 1-й группе самок крыс вводили ФП в виде водного раствора однократно в/ж через зонд в суммарной дозе 5,0 г на 1 кг массы тела в расчете на белок. Наблюдение за состоянием животных осуществляли в течение 6 ч после введения ФП и далее ежесуточно на протяжении 13 сут в соответствии с ГОСТ 32644-2014 "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности". Животных выводили из эксперимента на 14-е сутки путем ингаляции CO2 и проводили обзор органов грудной клетки, брюшной полости и черепа.

В эксперименте по изучению подострой токсичности использовали 4 группы крыс по 16 самцов с исходной массой тела 80±10 г. После недельной адаптации крысы 1-4-й групп получали в течение последующих 80 сут полусинтетический сбалансированный рацион по AIN-93 в условиях неограниченного доступа и в/ж ежесуточно ФП в расчетных дозах 0 (контроль); 10; 100 и 1000 мг на 1 кг массы тела в 0,15 М водном растворе NaCl. Воду для питья получали в установке обратного осмоса "Milli-RO" (Waters, США).

В ходе наблюдения ежедневно оценивали количество потребленного корма, общее состояние животных; массу тела определяли с недельными интервалами. На 50, 51 и 71-е сутки опыта оценивали уровень тревожности и когнитивную функцию, используя тест "Условный рефлекс пассивного избегания" (УРПИ) [7]. Сбор суточной мочи выполняли на 78-е сутки опыта, помещая животных в метаболические клетки.

Животных выводили из эксперимента на 80-е сутки после 16-часового голодания путем обескровливания из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. За 3 ч до эвтаназии части крыс (от 9 до 10 особей) вводили в/ж через зонд овальбумин (ОВА) в дозе 2 г на 1 кг массы тела для последующего изучения проницаемости стенки кишки. Определяли массу внутренних органов (печень, почки, селезенка, сердце, легкие, тимус, надпочечники, головной мозг, гонады), отбирали кровь для исследования концентрации антигенного ОВА, гематологических и биохимических показателей, печень - для определения содержания небелковых тиолов и количества гепатоцитов в апоптозе. Содержание антигенного ОВА в сыворотке крови определяли с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного теста согласно МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов". Всасывание ОВА в кровь (в % от введенной дозы) рассчитывали исходя из предположения, что масса крови крысы составляет 6% от массы тела и с учетом величины гематокрита.

Биохимические показатели сыворотки крови (концентрация глюкозы, триглицеридов, холестерина общего и в составе липопротеинов высокой плотности, общего белка, альбуминов, глобулинов, креатинина, мочевины, мочевой кислоты, активность печеночных трансаминаз и щелочной фосфатазы) определяли на биохимическом анализаторе "Konelab 20i" (Thermo Fischer Scientific, Финляндия).

Гематологические показатели определяли в цельной крови стандартными методами на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (Beckman Coulter, США) с набором реагентов (Beckman Coulter, Франция). Апоптоз гепатоцитов изучали на проточном цитофлуориметре "FC 500" (Beckman Coulter International S.A., Австрия) с использованием технологии окрашивания гепатоцитов в суспензии флуоресцентными реагентами FITC-аннексином V и 7-амино-актиномицином (7-AAD) [8]. Содержание креатинина в моче определяли колориметрическим методом с пикриновой кислотой, селена - флуориметрическим методом с 2,3-диаминонафталином [9]. Содержание небелковых тиолов печени (в пересчете на глутатион) определяли спектрофотометрическим методом с реактивом Эллмана. Степень окислительного повреждения ДНК оценивали по экскреции с мочой 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-oxo-G), который определяли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке С18 с трехуровневым квадрупольным масс-спектрометрическим детектором [10].

Исследование ФП на отсутствие в нем ДНК штамма-продуцента, а также ДНК маркеров антибиотикоустойчивости и ДНК селективных маркерных генов проведено ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России в соответствии с МУК 2.3.2.1830-04 "Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов". Согласно Техническому регламенту Таможенного союза ТР ТС 029/2012 "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов, технологических вспомогательных средств" и МУ 2.3.2.1935-04 "Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги" проведен анализ образцов ФП на содержание свинца; микотоксинов (афлатоксин В1, стеригматоцистин, Т-2 токсин, зеараленон, охратоксин А) методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием (МС/МС); на микробиологическую безопасность и содержание жизнеспособных клеток штамма-продуцента стандартными методами.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета IBM SPSS 23.0 (IBM, США). Расчет включал определение выборочного среднего, стандартной ошибки. Вероятность принятия нуль-гипотезы о совпадении распределений сравниваемых выборок устанавливали согласно критерию Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и ANOVA. Достоверность различия долевых показателей оценивали с использованием точного U-критерия Фишера и многомерного критерия х2 Пирсона. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

Характеристика штамма Aspergillus awamori Xyl Т-15 продуцента ферментного препарата

Исследование вирулентности штамма A. awamori Xyl T-15 для самцов и самок мышей линии ICR на протяжении 10 сут наблюдения после в/б введения микроорганизма в дозе 1х109 КОЕ не выявило летальности и заболеваемости мышей опытной группы. Таким образом, максимально возможная для в/б введения доза культуры A. awamopri Xyl T-15 (1х109 КОЕ/г) не вызывала гибели экспериментальных животных.

Изучение возможности к диссеминации внутренних органов штаммом A. awamori Xyl T-15 после его в/ж введения самцам и самкам крыс в дозе 1011 КОЕ на 100 г массы тела в течение последующих 12 сут не выявило летальности и признаков заболеваемости животных. Посевы полученных в ходе эксперимента органов на среду Сабуро не обнаружили роста вводимого штамма A. awamori Xyl-T-15, следовательно, данный штамм, по-видимому, не способен к диссеминации (инвазии из кишечника во внутренние органы).

Исследование острой токсичности ферментного препарата

В результате однократного в/ж введения ФП в дозе 5000 мг на 1 кг массы тела самцам и самкам крыс Wistar в течение последующих 13 сут летальности, заболеваемости животных не выявлено. Вскрытие, проведенное на 14-е сутки, показало наличие кистозных изменений яичников у 5 самок. Таким образом, среднелетальная доза ФП для самцов и самок крыс (LD50) заведомо превышает 5000 мг на 1 кг массы тела.

Исследование подострой токсичности ферментного препарата в 80-суточном эксперименте

Физиологические показатели. В эксперименте с в/ж введением ФП самцам крыс на протяжении всего периода кормления отмечена гибель по одному животному во 2, 3 и 4-й группах соответственно на 32, 14 и 15-е сутки. Вскрытие погибших крыс показало, что причиной смерти была двусторонняя пневмония. Остальные крысы всех групп имели нормальный внешний вид, подвижность, состояние кожного (шерстного) покрова и слизистых оболочек. Другая заболеваемость отсутствовала.

Результаты исследования когнитивной функции (уровня тревожности, кратковременной и долговременной памяти) в тесте УРПИ (табл. 1) не выявили статистически значимых изменений в уровне тревожности и кратковременной памяти животных, получавших ФП во всех трех дозах. У крыс, получавших ФП в дозе 10 мг на 1 кг массы тела (2-я группа), отмечено улучшение функции долговременной памяти по сравнению с контролем. При двух других дозах такой эффект отсутствовал. Таким образом, в/ж введение ФП крысам в течение 50-71 сут не оказывает неблагоприятного действия на уровень тревожности и когнитивную функцию, оцениваемые в тесте УРПИ.

Таблица 1. Результаты оценки тревожности и когнитивной функции крыс в тесте "Условный рефлекс пассивного избегания

Table 1. Results of the assessment of anxiety and cognitive function of rats in the conditioned passive avoidance reflex

П р и м е ч а н и е. * - находится в обратной зависимости с уровнем тревожности; ** - число животных, не зашедших в темный отсек при втором тесте (через 1 сут); *** - число животных, не зашедших в темный отсек при третьем тесте (через 21 сут); # - различие с контрольной группой значимо (p=0,014), точный U-критерий Фишера.

N o t e s. * - inverse dependence to the level of anxiety; ** - the number of animals that did not enter the dark compartment during the second test (within 1 day); *** - the number of animals that did not enter the dark compartment during the third test (within 21 days); # - the difference with the control group is significant (p=0.014), Fisher’s exact U-test.

На протяжении всего времени эксперимента крысы всех групп стабильно прибавляли в массе тела. Масса тела крыс четырех групп при выведении из эксперимента (на 80-е сутки) достоверно не различалась (рис. 1).

Рис. 1. Изменение массы тела крыс на протяжении эксперимента

* - данные после 16-часового голодания (при выведении из эксперимента).

Fig. 1. Changes in body weight of rats during the experiment

* - data after 16-hour fasting (when withdrawning from the experiment).

Результаты определения относительной (в % от массы тела) массы внутренних органов крыс свидетельствуют о том, что при минимальной дозе ФП (2-я группа) отмечается увеличение относительной массы селезенки в 1,4 раза, однако при дальнейшем увеличении дозы ФП этот эффект нивелируется (табл. 2). Начиная с дозы 100 мг/кг (3-я группа) происходит статистически значимое снижение средней массы легких в 1,2 раза, а при дозе 1000 мг/кг - почек на 13,3% и надпочечников в 1,6 раза. Таким образом, значимое влияние ФП на массу внутренних органов наблюдается начиная с дозы 100 мг на 1 кг массы тела.

Таблица 2. Относительная масса органов крыс при выведении из эксперимента (M±m, %)

Table 2. Relative mass of rat organs at the end of the experiment (M±m, %)

П р и м е ч а н и е. * - различие с контрольной группой достоверно (р<0,05), t-тест Стьюдента с поправкой Levene. N o t e. * - the difference with the control group is significant (p<0.05), Student’s t-test with Levene correction.

Различие между группами недостоверно (p>0,05, ANOVA, по фактору "доза" для 1-4-й групп; p>0,05, U-критерий Манна-Уитни при сравнении показателей 2-4-й групп с 1-й группой).

Fig. 2. Individual values of antigenic ovalbumin absorption into the blood 3 hours after intragastric tube administration when assessing the permeability of the rat intestine wall for protein macromolecules

The difference between the groups is insignificant (p>0.05, ANOVA, by the factor “dose" for groups 1-4; p>0.05, U-Mann-Whitney test when comparing groups 2-4 with group 1).

При выведении животных из эксперимента всасывание в кровь антигенного ОВА, позволяющее оценить проницаемость стенки кишки крыс для белковых макромолекул, составило в контрольной группе крыс (1,6±0,6)х10-5%, что типично для животных данного возраста [4]. При в/ж введении ФП не оказывал значимого влияния на этот показатель (рис. 2).

Рис. 2. Индивидуальные значения всасывания в кровь антигенного овальбумина через 3 ч после внутрижелудочного зондового введения при оценке проницаемости стенки кишки крыс для белковых макромолекул

Различие между группами недостоверно (p>0,05, ANOVA, по фактору ≪доза≫ для 1-4-й групп; p>0,05, U-критерий Манна-Уитни при сравнении показателей 2-4-й групп с 1-й группой).

Fig. 2. Individual values of antigenic ovalbumin absorption into the blood 3 hours after intragastric tube administration when assessing the permeability of the rat intestine wall for protein macromolecules The difference between the groups is insignificant (p>0.05, ANOVA, by the factor “dose” for groups 1-4; p>0.05, U-Mann-Whitney test when comparing groups 2-4 with group 1).

Биохимические показатели. Результаты, представленные на рис. 3, свидетельствуют, что в/ж введение ФП во всех исследованных дозах не оказывает сколько-нибудь выраженного влияния на содержание небелковых тиолов печени (см. рис. 3А), экскрецию с мочой селена (см. рис. 3Б) и креатинина (см. рис. 3В). Биохимические показатели сыворотки крови у животных, получавших ФП, не отличались от контрольных значений, за исключением небольшого (на 6%), но статистически значимого (р<0,05, U-тест Манна-Уитни) повышения уровня альбуминов при дозе ФП 1000 мг на 1 кг массы тела. Как следует из данных рис. 3Г, при наибольшей из доз ФП (1000 мг/кг) наблюдается статистически значимое (р<0,05) возрастание экскреции с мочой 8-oxo-G, являющегося маркером окислительного повреждения ДНК.

Рис. 3. Биохимические показатели крыс, M±m

А - содержание небелковых тиолов печени (в пересчете на восстановленный глутатион); Б - суточная экскреция креатинина; В - удельная суточная экскреция селена; Г - удельная суточная экскреция 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина; * - p<0,05 по сравнению с 1-й группой, U-критерий Манна-Уитни.

Fig. 3. Biochemical parameters of rats, M±m

A - the content of non-protein liver thiols (in terms of reduced glutathione); B - daily excretion of creatinine; C - daily excretion of selenium; D - daily excretion of 8-oxo-2-deoxyguanosine; * - p<0.05 compared with group 1, Mann-Whitney U-test.

Гематологические показатели. При минимальной дозе ФП (10 мг/кг) во 2-й группе отмечается статистически значимое (p<0,05) повышение по сравнению с контролем содержания лимфоцитов [с 9,15±0,96х109 (контроль) до 12,3±1,1х109 л-1] и снижение эозинофилов [с 2,20±0,34х108 (контроль) до 1,7±0,27х108 л-1], однако при дальнейшем увеличении дозы ФП этот эффект не воспроизводится. При дозе 100 мг на 1 кг массы тела статистически значимо (с амплитудой 5%) снижается общее число эритроцитов и гематокрит. При дозе 1000 мг/кг эти эффекты сохраняются, но для эритроцитов только на уровне тенденции (p<0,10). При дозе ФП 1000 мг/кг отмечено статистически значимое возрастание в 1,7 раза содержания базофилов [с 0,280±0,071 (контроль) до 0,500±0,083%]. Таким образом, потребление ФП в дозе до 100 мг на 1 кг массы тела не оказывает значимого по величине (выходящего за пределы вариабельности физиологической нормы) и дозозависимого влияния на гематологические показатели; при дозе 1000 мг/кг основной затронутой клеточной популяцией являются базофилы.

Апоптоз гепатоцитов. Как следует из данных, представленных на рис. 4, потребление ФП дозозависимо влияет на показатели апоптоза гепатоцитов: начиная с дозы 100 мг на 1 кг массы тела, у получавших ФП крыс статистически значимо (p<0,05) увеличивается количество клеток AnV+7AAD+ ("поздний" апоптоз) и некрозных клеток (AnV-7AAD+). При дозе 1000 мг на 1 кг массы тела дополнительно выявляются значимое (p<0,05) снижение количества живых гепатоцитов (AnV-7AAD-), возрастание количества клеток на ранней стадии апоптоза (AnV+7AAD-) и общего количества гепатоцитов в апоптозе. Таким образом, при воздействии ФП на животных, начиная с дозы 100 мг на 1 кг массы тела, наблюдается дозозависимое усиление апоптоза гепатоцитов.

Рис. 4. Влияние внутрижелудочного введения ферментного препарата на апоптоз клеток печени крыс, M±m

А - живые клетки (AnV-7AAD-); Б - ранний апоптоз (AnV+7AAD-); В - поздний апоптоз (AnV+7AAD+); Г - сумма клеток в раннем и позднем апоптозе; Д) некроз (AnV-7AAD+). * - p<0,05 по сравнению с 1-й группой, U-критерий Манна-Уитни.

Fig. 4. Influence of intragastric administration of the enzyme preparation on apoptosis of rat liver cells, M±m

A - living cells (AnV-7AAD-); B - early apoptosis (AnV+7AAD-); C - late apoptosis (AnV+7AAD+); D - the sum of cells in early and late apoptosis; E) necrosis (AnV-7AAD+). * - p<0.05 compared with group 1, U-Mann-Whitney test.

Молекулярно-генетические исследования ФП показали отсутствие в нем ДНК A. awamori Xyl T-15, ДНК маркеров антибиотикоустойчивости и ДНК селективных маркерных генов, гомологичных участкам генов Amp, Ori, TetO, Erm, LacZ. В ФП не выявлено содержание микотоксинов (стеригматоцистина, афла-токсина В1, Т-2 токсина, НТ-2 токсина, зеараленона, охратоксина А, фумонизинов В1, В2) в пределах чувствительности применяемого метода, живых клеток штамма A. awamori, патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Обсуждение

В соответствии с законодательством в пищевой промышленности разрешается использование безопасных для здоровья штаммов микроорганизмов. Вместе с тем в процессе мутагенеза или трансгенеза генотип штамма-продуцента может быть значительным образом изменен, что может привести к приобретению им свойств патогенности, вирулентности, токсигенности и антибиотикорезистентности, и, следовательно, к негативному действию на микробиоценоз кишечника и иммунный статус организма. Производимая при помощи микробного синтеза пищевая продукция может быть в недостаточной степени очищена от ДНК штамма-продуцента и продуктов его метаболизма. Для представителей рода Aspergillus и Penicililum характерна продукция целого ряда микотоксинов, таких как охратоксины А, В, С, все виды афлатоксинов, фумонизины, глиотоксин, HC-токсин, ловастатин, 6-метилсалициловая кислота, цитринин, циклопиазоновая кислота и др., а также антибиотиков [11]. При этом далеко не все микотоксины и антибиотики анализируются при оценке безопасности ферментных препаратов. В этой связи необходимо проводить оценку рисков как штамма-продуцента, так и продуцируемой им пищевой продукции (Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 029/2012 "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов, технологических вспомогательных средств") [1, 12, 13].

Проведенные исследования показали, что максимально возможные для в/б введения дозы суспензии конидий культуры A. awamopri Xyl T-15 (1х109 КОЕ) не вызывали гибели экспериментальных животных. При этом в соответствии с МУК 2.3.2.1830-04 "Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов" ГМ-микроорганизмы считаются авирулентными, если LD50 - 5х108 КОЕ и более. Штамм A. awamopri Xyl T-15 не обладает инвазивными свойствами, что подтверждается отсутствием диссеминации им внутренних органов.

Ферментный препарат - комплекс глюкоамилазы и ксиланазы из A. awamori Xyl T-15 - обладает низкой пероральной острой токсичностью для крыс (LD50>5000 мг/кг, V класс опасности, согласно ГОСТ 32644-2014 "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности". В подостром эксперименте продолжительностью 80 сут в/ж введение ФП в различных дозах, в том числе существенно аггравированных по сравнению с возможными сценариями его присутствия в пищевой продукции, не отражалось на когнитивной функции крыс. ФП не оказывал выраженного влияния на обмен селена и экскреторную функцию почек. В дозе не более 100 мг/кг ФП оказывал минимальное воздействие на состояние системы кроветворения и состав лейкоцитов периферической крови, биохимические показатели сыворотки крови. Поступление ФП в организм не сопровождалось нарушением барьерной функции кишки в отношении белковых макромолекул. Наиболее чувствительным к действию ФП органом животных была печень, что выразилось в усилении апоптоза клеток при дозе ≥100 мг/кг. В наибольшей из доз ФП (1000 мг/кг) повышал у крыс экскрецию с мочой 8-oxo-G, что указывает на усиление процессов окислительной деструкции ДНК, предположительно, вследствие развития апоптоза. Величина максимальной недействующей дозы поступления ФП с пищевой продукцией составляет, по данным проведенных экспериментов, <100 мг на 1 кг массы тела в сутки, однако она нуждается в уточнении по результатам проведения исследований влияния ФП на состояние микробиоценоза кишечника и иммунный статус животных.

В Российской Федерации в превентивном порядке разработаны нормативные документы, содержащие требования к продукции микробного синтеза, разработан и применяется ряд межгосударственных и национальных стандартов, устанавливающих требования к ферментным препаратам, получаемым различными способами, и методам определения их активности [1]. Вместе с тем в последнее десятилетие накоплен достаточно большой опыт регулирования использования данного вида пищевой продукции. При этом в соответствии с требованиями Международного комитета экспертов Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН/Всемирной организации здравоохранения по пищевым добавкам (JECFA) заключение о безопасности производственных микроорганизмов дается на уровне их вида с учетом эмпирических данных отсутствия токсичности продуктов, получаемых при помощи микробного синтеза [14]. Такой подход не позволяет исключить высокого риска здоровью населения при использовании данной пищевой продукции, поскольку свойства разных штаммов, принадлежащих к одному виду, в значительной степени могут отличаться друг от друга. В ряде стран оценка рисков как штаммов-продуцентов, так и продуцируемой ими пищевой продукции может проводиться без использования токсикологических экспериментов на животных [15-17]. Приведенные в статье данные обосновывают необходимость оценки рисков пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза, с учетом результатов проводимых in vivo и in vitro экспериментов, в том числе при помощи методов полимеразной цепной реакции и секвенирования ДНК, характеризующих наиболее точно риски использования как штамма-продуцента, так и продуцируемой ими пищевой продукции.

Заключение

Представленные экспериментальные данные позволяют сделать заключение об авирулентности штамма A. awamori Xyl T-15, отсутствии у него способности к диссеминации внутренних органов. Решение о возможном использовании ФП - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы - в пищевой и сельскохозяйственной промышленности может быть принято только после проведения молекулярно-генетического анализа рекомбинантного штамма A. awamori Xyl T-15 (ВКМ F-4278D) с целью выявления детерминант антибиотикорезистентности, анализа воздействия ФП на кишечный микробиоценоз и иммунный статус организма экспериментальных животных.

Проведение данных исследований обусловлено необходимостью совершенствования установленной в Российской Федерации системы оценки пищевой продукции, получаемой с использованием технологических микроорганизмов. Существующая несогласованность позиции JECFA и Европейского агентства безопасности пищевой продукции (EFSA) [18] в вопросе оценки рисков ферментных препаратов и их штаммов-продуцентов показывает особую актуальность проведения этой работы. Так, JECFA [12] признает микроорганизм безопасным продуцентом пищевой продукции на видовом уровне (и, следовательно, можно обойтись без их дальнейшего токсикологического исследования), основываясь на эмпирических данных об отсутствии токсичности продуктов, получаемых при помощи микробного синтеза. В соответствии с нашими данными, а также данными EFSA [18] такой подход не гарантирует безопасности этих видов пищевой продукции для населения. EFSA рассматривает безопасность микроорганизма на уровне штамма с учетом всех изменений в структуре его ДНК и условий его использования [15-17]. Особенно это касается рекомбинантных штаммов, полученных методами генной инженерии. Вместе с тем схема оценки рисков технологических микроорганизмов и продуцируемой ими пищевой продукции, принятая EFSA, допускает возможность их допуска только на основе проведения тестов ex vivo и in vitro, при наличии данных полногеномного секвенирования, подтверждающего факт отсутствия в ДНК кластеров генов, ответственных за продукцию токсичных метаболитов, и детерминант антибиотикоустойчивости, а также остатков векторной ДНК и маркеров отбора, применяемых в процессе генной инженерии. Возможность такого подхода обосновывается этическими вопросами проведения экспериментов in vivo, а также их высокой стоимостью. Представленные в статье данные показали неприемлемость такого подхода и обязательность проведения экспериментов с использованием экспериментальных животных, поскольку применение метода аналогий безопасности штаммов, имеющих общий штамм-реципиент, и продуцируемой ими пищевой продукции на основе анализа данных об их токсичности только для различных линий культур клеток, может привести к недооценке рисков здоровью населения продукции микробного синтеза.

Литература

1. Багрянцева О.В. Обоснование необходимости разработки мероприятий по управлению рисками, связанными с использованием пищевой продукции, производимой при помощи микробного синтеза // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 2. С. 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10017

2. Рожкова А.М., Середа А.С., Цурикова Н.В., Нуртаева А.К., Семенова М.В., Римарева Л.В. и др. Создание системы экспрессии гетерологичных генов на основе рекомбинантного штамма гриба Aspergillus awamori // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47, № 3. С. 308-317.

3. Римарева Л.В., Цурикова Н.В., Костылева Е.В., Середа А.С. Рекомбинантный штамм мицелиального гриба Aspergillus awamori - продуцент комплекса ферментов глюкоамилазы и ксиланазы. Пат. РФ № 2457246, приоритет от 21.03.2011.

4. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : National Academies Press, 2011.

5. Пивоваров Ю.П., Мялина Л.И., Королик В.В. и др. Критерии оценки патогенных свойств штаммов-продуцентов, предлагаемых для использования в промышленности микробиологического синтеза. Методические указания. Москва, 1992. 22 с.

6. Гаузе Г.Ф. Определитель актиномицетов: роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. Москва : Книга по Требованию, 2014. 248 с. ISBN 978-5-458-47107-7.

7. Loskutova L.V., Dubrovina N.I., Markel’ A.L. Comparative analysis of the persistence of a conditioned passive avoidance reflex in rats with different forms of inherited hypertension // Neurosci. Behav. Physiol. 2007. Vol. 37, N 6. P. 577-582. DOI: https://doi.org/10.1007/s11055-007-0055-y

8. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопросы питания. 2011. Т. 80, № 3. С. 25-30.

9. Голубкина Н.А. Флуориметрический метод определения селена // Журнал аналитической химии. 1995. Т. 50, № 8. С. 492-497.

10. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection // Pharmacol. Res. 2002. Vol. 46, N 2. P. 129-131. DOI: https://doi.org/10.1016/s1043-6618(02)00080-4

11. Gallo A., Ferrara M., Perrone G. Phylogenetic study of polyketide synthases and nonribosomal peptide synthetases involved in the biosynthesis of mycotoxins // Toxins. 2013. Vol. 5. P. 717-742. DOI: https://doi.org/10.3390/toxins5040717

12. Guidance on the risk assessment of genetically modified microorganisms and their products intended for food and feed use // CAC/GL 46-2003. 13 p. URL: http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/en/

13. Guidance on the risk assessment of genetically modified microorganisms and their products intended for food and feed use // EFSA J. 2011. Vol. 9, N 6. Article ID 2193. 54 p. URL: http://www.efsa.europa.eu

14. Principles and methods for the risk assessment of chemicals in food. Environmental health criteria 240. World Health Organization, 2009. Updated in 2020. 34 p. ISBN: 9789241572408.

15. Ricci A., Allende A., Bolton D., Chemaly M., Davies R., Gironeset R. et al. Statement on the update of the list of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 7: suitability of taxonomic units notified to EFSA until September 2017. EFSA BIOHAZ Panel (EFSA Panel on Biological Hazards) // EFSA J. 2018. Vol. 16, N 1. Article ID 5131. 43 p. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5131

16. Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavailability of nutrient from the sources // EFSA J. 2018. Vol. 16, N 6. Article ID 5294. 35 р. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5294.

17. Silano V., Baviera B.J.M., Bolognesi C., Bruschweiler B.J., Cocconcelli P.S., Crebelli R. et al. Statement on the characterisation of microorganisms used for the production of food enzymes. EFSA CEP Panel (EFSA Panel on Food Contact Materials, Enzymes and Processing Aids) // EFSA J. 2019. Vol. 17, N 6. Article ID 5741. 13 p. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2019.5741

18. Analysis of JECFA’s draft guideline on "Evaluation of enzyme preparations used in the manufacture of foods" // EFSA Supporting publication 2020. EN-1795. 8 p. DOI: https://doi.org/10.2903/sp.efsa.2020.EN-1795

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Медицина сегодня
Конгресс "Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии"

21-й Всероссийский научно-практический конгресс "Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии" Этой осенью российские и зарубежные офтальмологи специалисты соберутся в Москве на одном из самых значимых и масштабных профессиональных мероприятий в...

Пост-релиз 17-й Международный Междисциплинарный Конгресс по Аллергологии и Иммунологии.

3 дня, 45 симпозиумов и рекордная явка в онлайне: как прошел 17-й Международный Междисциплинарный Конгресс по Аллергологии и Иммунологии С 23 по 25 июня в Москве на площадке конгресс-зала Radisson Slavyanskaya проходил 17-й Международный Междисциплинарный Конгресс по...

XIV Региональный научно-образовательный форум "Мать и Дитя"

XIV Региональный научно-образовательный форум "Мать и Дитя" и Пленум Правления Российского общества акушеров-гинекологов 28-30 июня 2021 года состоится в очном формате XIV Региональный научно-образовательный форум "Мать и Дитя" и Пленум Правления Российского общества...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»