Экспрессия генов в печени крыс, получавших с рационом комплекс ресвератрола и L-карнитина, в норме и при ожирении

Резюме

Введение в состав специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище биологически активных веществ с противовоспалительным и гиполипидемическим действием является одним из эффективных способов диетотерапии алиментарного ожирения и связанных с ним заболеваний.

Цель работы - изучить влияние сочетанного применения ресвератрола и L-карнитина (РК) на экспрессию генов, отвечающих за метаболизм углеводов, жиров и воспалительные реакции, в печени и почках крыс в норме и при диет-индуцированном ожирении.

Материал и методы. В течение 63 сут самцы крыс Вистар получали стандартный сбалансированный рацион или высокоуглеводный высокожировой рацион (ВУВЖР) с избытком общего жира (30%) и фруктозы (20% раствор вместо питьевой воды) или такие же рационы с добавлением РК в низкой (25 мг на 1 кг массы тела ресвератрола и 300 мг/кг L-карнитина) или высокой (50 и 600 мг/кг соответственно) дозах. Экспрессию генов (Khk, Gck, Pklr, Acaca, Acacb, Fasn, Scd, Srebf1, Mlxipl, Ppara, Pparg, Actb, Gapdh) в клетках печени оценивали методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени. Распределение тирозинаминотрансферазы (TAT), ядерного фактора, подобного эритроидному фактору 2 (NRF-2), и молекулы межклеточной адгезии 2-го типа (ICAM-2) в печени и почках исследовали методами конфокальной лазерной микроскопии и иммуногистохимии.

Результаты. Повышенная экспрессия Fasn (синтаза жирных кислот) у крыс, получавших ВУВЖР, снижалась под влиянием РК. Потребление РК вызывало уменьшение числа TAT-, NRF-2- и ICAM-2-позитивных клеток в печени крыс, получавших ВУВЖР, но оказывало противоположное влияние в почках. Потребление крысами РК в низкой дозе в составе ВУВЖР приводило к изменениям в профиле экспрессии изученных генов-маркеров, свидетельствующим о возможном гиполипидемическом действии, однако повышение экспрессии генов липогенеза в печени и возрастание содержания NRF-2 и ICAM-2 в ткани почек при потреблении РК в составе сбалансированного рациона не могут быть оценены как однозначно позитивные.

Заключение. Возможные негативные эффекты, вызванные, по всей видимости, взаимодействием биологически активных компонентов с различными механизмами действия, следует учитывать при разработке рецептур биологически активных добавок к пище и специализированных продуктов для диетотерапии ожирения.

Ключевые слова:ожирение, крысы, ресвератрол, карнитин, экспрессия генов, полимеразная цепная реакция, конфокальная микроскопия

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 17-16-01043 "Поиск эффекторных звеньев метаболизма, регулируемых алиментарными факторами при ожирении, для разработки инновационных специализированных пищевых продуктов").

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Для цитирования: Трусов Н.В., Семин М.О., Шипелин В.А., Апрятин С.А., Гмошинский И.В. Экспрессия генов в печени крыс, получавших с рационом комплекс ресвератрола и L-карнитина, в норме и при ожирении // Вопросы питания. 2021. Т 90, № 5. С. 25-37. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-5-25-37

Минорные биологически активные вещества (БАВ) пищи: ресвератрол (Рес, транс-3,5,4'-тригидро-ксистильбен) и L-карнитин [L-Кар, (3Я)-3-гидрокси-4-триметиламмонио-бутаноат] - рассматриваются в настоящее время как компоненты диетического лечебного питания и биологически активных добавок (БАД) к пище, предназначенных для включения в диету пациентов с ожирением и метаболическим синдромом. Имеется ряд экспериментальных и клинических подтверждений наличия у Рес как гиполипидемических [1], так и противовоспалительных [2] свойств. L-Кар, рекомендуемый в программах снижения массы тела и в спортивном питании в качестве "сжигателя жира", стимулирующего β-окисление жирных кислот [3, 4], помимо этого, способен проявлять противовоспалительные и нейропротекторные эффекты [5, 6]. При этом оба этих БАВ при поступлении в организм имеют, по современным представлениям, различные молекулярные мишени воздействия. Эффекты Рес реализуются преимущественно через его влияние на активность НАД-зависимой деацетилазы сиртуин-1 (Sirt1) [7], играющей ключевую роль в эпигенетической регуляции большого числа генов, в том числе связанных с обменом липидов и синтезом медиаторов воспаления [8, 9]. L-Кар, понижающий уровень свободных жирных кислот в плазме крови и в тканях, воздействует посредством этого на экспрессию генов PPAR-сигнальных путей, ответственных за регуляцию процессов липогенеза и пероксисомного окисления липидов [4].

Все перечисленное делает привлекательной перспективу совместного использования Рес и L-Кар в составе БАД к пище - специализированных пищевых продуктов для диетического лечебного питания и для питания спортсменов. В настоящее время в России и в странах Евразийского экономического союза зарегистрировано и находится в обороте не менее 7 видов такой пищевой продукции, содержащей оба эти компонента. Однако возможное взаимодействие Рес и L-Кар в диапазонах используемых доз при их влиянии на адипогенез, системные и центральные воспалительные процессы при ожирении охарактеризовано недостаточно, и существует необходимость его доклинического изучения с использованием биологических моделей.

Цель работы - исследование совместного введения ресвератрола и L-карнитина (РК) на экспрессию ключевых генов углеводного и липидного обмена в печени и тканевую локализацию ряда функционально значимых белков печени и почек крыс в норме и при индуцированном рационом ожирении.

Материал и методы

В эксперименте использовали 36 самцов крыс аутбредной линии Вистар, полученных в возрасте 8 нед из питомника филиала "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Работу с животными выполняли в соответствии с международными рекомендациями [10]. Дизайн эксперимента был одобрен комитетом по этике ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (протокол № 4 от 20.04.2017).

После 1-недельного карантина были сформированы 6 групп по 6 крыс в каждой. Средняя масса тела в группах достоверно не различалась (данные представлены в [11]). Крысы 1-й группы получали полусинтетический сбалансированный рацион (далее - СР) по AIN93M с некоторыми модификациями [12] и очищенную обратным осмосом питьевую воду, 2-й группы - СР с включением РК в расчетных суточных дозах по Рес и L-Кар 25 и 300 мг на 1 кг массы тела соответственно (низкая доза, далее - РКн), 3-й группы - СР с включением РК в расчетных дозах 50 и 600 мг на 1 кг массы тела соответственно (высокая доза, далее - РКв), 4-й группы - высокоуглеводный высокожировой рацион (далее - ВУВЖР) (30% по массе сухих веществ жира в форме смеси 1:1 рафинированного подсолнечного масла и свиного лярда, замена питьевой воды на 20% раствор фруктозы), 5-й группы - ВУВЖР с РКн, 6-й группы - ВУВЖР с РКв [11]. Крыс содержали по 2 особи в клетках из поликарбоната при 21 ±1 °С и режиме освещения 12/12 ч. Продолжительность кормления составила 9 нед. Для поддержания постоянства потребляемой дозы удельное содержание РК в корме при необходимости корректировали в соответствии с его фактическим потреблением.

На 64-е сутки с начала кормления крыс выводили из эксперимента путем декапитации под эфирной анестезией. Образцы тканей печени и почек отбирали стерильными хирургическими инструментами из нержавеющей стали, охлажденными до +2 °С на льду. Пробу печени делили на 2 части, первую немедленно замораживали при -70 °С до исследования методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Вторую часть печени, а также образцы почек использовали для получения гистологических микропрепаратов. При этом кусочки органов размером около 5x5x5 мм фиксировали в 3,7% растворе формальдегида в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,0, отмывали 24 ч в проточной воде, последовательно дегидратировали в спиртах концентрацией (70, 80, 90, 96 и 100%), смесях спирт-хлороформ (1:1) и хлороформ-парафин (1:1) при 37 °С, после чего заливали расплавленной гомогенизированной средой Histomix ("БиоВитрум", Россия) на основе парафина в заливочной станции EC 350 (Microm, Германия) при 56 °С. Срезы с парафиновых блоков толщиной 5 мкм выполняли на микротоме Мюгот НММ 355s (Мюгот, Германия), монтировали на предметные стекла для иммуногистохимического анализа (Thermo Fisher Scientific, США) и высушивали при 37 °С в течение 18 ч. После удаления парафина путем обработки указанными растворителями в обратной последовательности и регидратации в 0,01 М натрий-фосфатном буфере рН 7,4 (PBS) проводили окрашивание специфическими моноклональными кроличьими антителами против TAT крысы или мышиными моноклональными антителами против NRF-2 и ICAM-2 крысы и вторичными антивидовыми антителами, меченными Alexa Fluor 488 (Abcam, Великобритания), по методике фирмы-изготовителя, с последующим окрашиванием 4',6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлоридом (DAPI) (Abcam, Великобритания). Препараты изучали в лазерном конфокальном микроскопе LSM-710 (Zeiss, Германия) при увеличении x200 и длине волны возбуждения флуоресценции 405 нм (фиолетовый лазер). Микрофотографии образцов экспортировали в формате *.jpeg, после чего проводили морфометрический анализ флуоресцентных меток определяемых антигенов с использованием программы распознавания образов ImageJ® (US NIH, США).

В печени определяли экспрессию генов ферментов кетогексокиназы (Khk), глюкокиназы (Gck), пируват-киназы (Pklr), ацетил-КоА-карбоксилаз A и B (Acaca, Acacb), синтазы жирных кислот (Fasn), стеарил-КоА-десатуразы (Scd) и их транскрипционных регуляторов SREBP-1c (Srebfl), ChREBP (Mlxipl), PPARa (Ppara), PPARg (Pparg), β-актина (Actb) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Gapdh) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров и зондов (ДНК-Синтез, Россия). Реакционная смесь общим объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из 2 мкг тотальной РНК (разведение 1:10), 2,5 мкл 10-кратного Taq Turbo буфера для HS Taq ДНК-полимеразы (c 2,5 мМ MgCl2) (Евроген, Россия), 1 мкл (F+R) праймеров (10 мкМ), 0,5 мкл зонда FAM (10 мкМ), 1,0 мкл смеси dNTPs (10 мМ) (Евроген, Россия), 0,25 мкл HS Taq ДНК-полимеразы (5 ед/мкл) (Евроген, Россия), 17,25 мкл воды без нуклеаз (Thermo Scientific, США). Амплификацию проводили на приборе CFX 96 (Bio-Rad, США). Реакцию ПЦР для всех изучаемых генов проводили по следующей схеме: активация HS Taq ДНК-полимеразы при 95 °С в течение 3 мин; далее 45 циклов, каждый состоял из денатурации при 95 °С в течение 15 с и отжига праймеров (60 °С, 1 мин). Измерение флуоресценции выполняли в канале FAM. Экспрессию генов оценивали по значению порогового цикла (Ct - cycle threshold) и нормализовали относительно условно конститутивных генов сравнения Actb и Gapdh методом 2-ΔΔCt [13].

Статистическую обработку данных проводили с использованием трехфакторного дисперсионного анализа ANOVA, непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни в качестве post-hoc теста. Различия принимали за достоверные при вероятности принятия нуль-гипотезы p<0,05.

Результаты

Интегральные и морфологические показатели

Данные о влиянии применявшихся рационов на интегральные и морфологические показатели были подробно представлены в предыдущей публикации [11]. Было показано, что крысы всех групп на протяжении всего периода кормления постоянно прибавляли в массе тела, имели нормальный внешний вид, заболеваемость и гибель животных отсутствовала. При этом для крыс 2-й (СР + РКн) и 6-й (ВУВЖР + РКв) групп была характерна достоверно сниженная масса тела по сравнению с животными, соответственно, 1-й (СР) и 4-й (ВУВЖР) групп, не получавшими РК. Наибольшее влияние на массу тела животных оказывал состав основного рациона (СР или ВУВЖР), p<0,05 ANOVA по фактору "рацион". Крысы, получавшие ВУВЖР, потребляли в день в 1,3-1,5 раза больше энергии, чем животные, получавшие СР. У крыс, получавших ВУВЖР, отмечалось развитие фенотипа ожирения, что выражалось в достоверном возрастании средней относительной массы печени (на 15%) и межлопаточной бурой жировой ткани (на 36%), суммарной массы паховой и забрюшинной белой жировой ткани (на 26%). В плазме крови крыс БАД РК вызывала достоверное возрастание отношения активности аспартат- (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ), рассматриваемое как признак усиления катаболических реакций [14]. При этом абсолютные активности этих ферментов оставались в пределах нормальных значений для животных данного пола и возраста.

Дифференциальная экспрессия генов печени

Анализ методом ОТ-ПЦР дифференциальной экспрессии ключевых генов липидного и углеводного обмена в печени крыс (см. таблицу) показал, что потребление ВУВЖР приводило по сравнению с СР к статистически значимому росту экспрессии Khk (кетогексокиназа) и Acaca (ацетил-КоА-карбоксилаза А). Экспрессия Pklr (пируваткиназа) у крыс, получавших ВУВЖР, также, по-видимому, увеличивалась, а Acacb (ацетил-КоА-карбок-силаза В) и Srebfl (фактор транскрипции 1, связывающий регуляторный элемент стерола) - снижалась (p<0,05, ANOVA, по фактору "рацион"), однако при попарном сравнении групп эти различия не прослеживались. Экспрессия Gck (глюкокиназа), Acaca, Acacb и Fasn (синтаза жирных кислот) у крыс, получавших СР, возрастала под действием РКн, причем на фоне потребления ВУВЖР первые 3 эффекта отменялись, а четвертый менял знак на противоположный (p<0,05, ANOVA, по фактору "рацион х БАД"). Повышенный уровень экспрессии Acaca у крыс, получавших ВУВЖР (p<0,05 в сравнении с контролем), возвращался к нормальным значениям при введении в рацион низкой дозы БАД (РКн), несмотря на то, что у крыс, получавших СР, эта доза РК вызывала, напротив, усиление экспрессии. Влияния типа рациона и РК на экспрессию Mlxipl (ChREBP, белок, связывающий элементы, реагирующие на углеводы), Scd (стеарил-КоА-десатураза), Ppara и Pparg (рецепторы, активируемые пероксисомным пролифератором) в пределах погрешности экспериментальных данных не выявлено.

Относительные уровни экспрессии генов липидного и углеводного обмена в печени крыс (log2FC, M±m, n=4)

Relative expression levels of lipid and carbohydrate metabolism genes in rat liver (log2FC, M±m, n=4)

П р и м е ч а н и е. Надстрочные индексы - номера групп, различие с которыми статистически значимо, p<0,05, U-тест Манна-Уитни. Влияющие факторы (ANOVA, p<0,05): D - рацион; S - БАД; D*S - сочетание двух факторов. СР - сбалансированный рацион; ВУВЖР - высокоуглеводный высокожировой рацион; РКн - ресвератрол и L-карнитин, низкая доза; РКв - то же, высокая доза.

N o t e. Superscripts - numbers of groups, the difference with which is significant, p<0.05, Mann-Whitney U-test. Influencing factors (ANOVA, p<0.05): D - diet; S - supplement; D*S - a combination of two factors. BD - balanced diet; HFCD - high-fat high-carbohydrate diet; RCl - resveratrol and L-carnitine supplement, low dose; RCh - resveratrol and L-carnitine supplement, high dose.

Экспрессия антигенов в клетках печени и почек по данным конфокальной микроскопии

Тирозинаминотрансфераза

Как показала визуализация методом конфокальной микроскопии, TAT, играющая ключевую роль в обмене тирозина и производных от него катехоламинов, была экспрессирована в небольшом числе гепатоцитов (зеленая флуоресценция), где антиген ТАТ был локализован в цитоплазме клеток паренхимы, предположительно, в ассоциации с системой микротрубочек в виде мелких компактных включений (рис. 1А-В). В почках ТАТ-позитивные (ТАТ+) клетки выявлялись в цитоплазме эпителиальных клеток проксимальных канальцев, причем как размер цитоплазматических включений антигена, так и количество окрашиваемых клеток были значительно больше, чем в печени (рис. 1Г, Е). По данным морфометрического анализа (рис. 2А, Б) количество ТАТ+-клеток в печени было наибольшим у крыс, получавших ВУВЖР, и дозозависимо снижалось у них под влиянием РК, т.е. наблюдалась нормализация этого показателя. В почках также отмечалась тенденция к более высокой экспрессии ТАТ у крыс, получавших ВУВЖР (p<0,05, ANOVA, по фактору "рацион"). При этом достоверного влияния на антиген со стороны приема РК не выявлено.



Рис. 1. Репрезентативные микрофотографии препаратов органов крыс при иммуногистохимическом окрашивании на тирозинамино-трансферазу (ТАТ)

А - печень крысы из 1-й группы (СР); Б - печень крысы из 4-й группы (ВУВЖР); В - 30-изображение печени крысы из 5-й группы (ВУВЖР + РКн); Г - почка крысы из 4-й группы (ВУВЖР); Д - почка крысы из 6-й группы (ВУВЖР + РКв); Е - 30-изображение почки крысы из 6-й группы (ВУВЖР + РКв). Здесь и на рис. 3, 4: конфокальный микроскоп LSM-710 Zeiss, λвозб=405 нм (фиолетовый лазер), λэм=490 нм (зеленая флуоресценция); х200. Стрелки - ТАТ-позитивные клетки; СР - сбалансированный рацион; ВУВЖР - высокоуглеводный высокожировой рацион; РКн - ресвератрол и L-карнитин, низкая доза; РКв - ресвератрол и L-карнитин, высокая доза.

Fig. 1. Representative micrographs of preparations of rat’s organs stained for tyrosine aminotransferase (TAT)

A - rat liver from group 1 (B0); B - liver of a rat from group 4 (HFC0); C - 30-image, liver, rat from group 5 (HFC0 + RCl); 0 - kidney, rat from group 4 (HFC0); E - kidney, rat from group 6 (HFC0 + RCh); F - 30 image, kidney of a rat from group 6 (HFC0 + RCh). Here and in Fig. 3, 4: LSM-710 Zeiss confocal microscope, λex=405 nm (violet laser), λem=490 nm (green fluorescence); x200. Arrows -TAT-positive cells; B0 - balanced diet; HFC0 - high-fat high-carbohydrate diet; RCl - resveratrol and L-carnitine supplement, low dose; RCh - resveratrol and L-carnitine supplement, high dose.

Рис. 2. Результаты морфометрического анализа экспрессии тирозинаминотрансферазы (ТАТ) (А, Б), ядерного фактора, подобного эритроидному фактору 2 (NRF-2) (В, Г) и молекулы межклеточной адгезии 2-го типа (ICAM-2) (Д, Е) в печени (А, В, Д) и почках (Б, Г, Е) крыс (M±m)

По оси абсцисс - группа животных; по оси ординат - число позитивных клеток в поле зрения. Число проб: по 3 микропрепарата в группе, каждый в 3 полях зрения (n=9). D - рацион; S - биологически активные добавки к пище; D*S - сочетание 2 факторов. Статистически значимое отличие (р<0,05): * - по отношению к 1-й группе - СР (сбалансированный рацион); # - по отношению к 4-й группе - ВУВЖР (высокоуглеводный высокожировой рацион); ° - по отношению к соответствующей группе на СР.

Fig. 2. Results of morphometric analysis of the expression of tyrosine aminotransferase (TAT) (A, B), nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF-2) (C, D) and intercellular adhesion molecule type 2 (ICAM-2) (E, F) in the liver (A, C, E) and kidneys (B, D, F) of rats (M±m)

The X-axis is the group of animals; the Y-axis is the number of positive cells in the field of view. Number of samples: 3 micropreparations per group, each in 3 fields of view (n=9). D - diet; S - supplement; D*S - diet * supplement. Statistically significant (р<0.05): * - in relation to group 1 - BD (balanced diet); # - in relation to group 4 - HFCD (high-fat high-carbohydrate diet); ° - in relation to the corresponding group on BD.

Ядерный фактор, подобный эритроидному фактору 2

Антиген NRF-2 был выявлен в печени и почках всех крыс исследованных групп, получавших СР, ВУВЖР и РК с этими рационами (рис. 3).

Рис. 3. Репрезентативные микрофотографии препаратов органов крыс при иммуногистохимическом окрашивании на ядерном факторе, подобном эритроидному фактору 2 (NRF-2)

А - печень крысы из 2-й группы (СР + РКн); Б - печень крысы из 5-й группы (ВУВЖР + РКн); В - 3D-изображение печени крысы из 3-й группы (СР + РКв); Г - почка крысы из 6-й группы (ВУВЖР + РКв); Д - почка крысы из 3-й группы (СР + РКв); Е - 3D-изображение почки крысы из 1-й группы (СР).

Fig. 3. Representative micrographs of preparations of rat’s organs stained for nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF-2)

A - rat liver from group 2 (BD + RCl); B - liver of a rat from group 5 (HFCD + RCl); C - 3D image, liver, rat from group 3 (BD + RCh); D - kidney, rat from group 6 (HFCD + RCl); E - kidney, rat from group 3 (BD + PCh); F - 3D image, rat kidney from group 1 (BD).

Внутриклеточное распределение NRF-2, в отличие от ТАТ, характеризовалось в печени накоплением в околоядерной области клеток паренхимы с образованием сферической оболочки вокруг ядра, а при высоком уровне экспрессии - непосредственно в ядре (где происходило наложение флуоресценции NRF-2 и DAPI с образованием голубого свечения). В почках крыс основным местом экспрессии NRF-2 были подоциты стенок капсул Шумлянского-Боумена и эндотелиоциты капилляров клубочков с локализацией преимущественно в ядрах клеток, при высоком уровне экспрессии - также клетки эпителия проксимальных канальцев, где метка диффузно локализовалась в цитоплазме. Морфометрический анализ выявил тенденцию к снижению экспрессии NRF-2 у крыс, получавших ВУВЖР и РК, по сравнению с получавшими СР и РК (p<0,05, ANOVA, по фактору "рацион", рис. 2В). В почках крыс тип рациона не оказывал значимого влияния на содержание NRF-2, однако наблюдалась его повышенная экспрессия у крыс, получавших ВУВЖР с РКв (рис. 2Г).

Молекула межклеточной адгезии 2-го типа

В печени экспрессию ICAM-2 наблюдали в гепатоцитах, антиген был локализован как диффузно в цитоплазме, так и в виде концентрической каймы вдоль плазматической мембраны клеток (рис. 4А-В). В почках основным местом локализации ICAM-2 были эпителиоциты проксимальных почечных канальцев (рис. 4Г-Е). Морфометрический анализ числа ICAM-2+-клеток (рис. 2Д, Е) показал, что в печени повышенные уровни экспрессии антигена наблюдались у крыс, получавших ВУВЖР, причем под влиянием РК количество позитивных клеток дозозависимо снижалось в 1,5-2 раза (p<0,05), приближаясь к значениям, характерным для группы СР, т.е. наблюдалась нормализация содержания антигена. В почках крыс, получавших ВУВЖР, но не СР, напротив, введение РК приводило к увеличению числа ICAM-2+-клеток в 1,8-2 раза (p<0,05).

Рис. 4. Репрезентативные микрофотографии препаратов органов крыс при иммуногистохимическом окрашивании на молекулах межклеточной адгезии 2-го типа (ICAM-2)

А - печень крысы из 1-й группы (СР); Б - печень крысы из 4-й группы (ВУВЖР); В - 30-изображение печени крысы из 4-й группы (ВУВЖР); Г - почка крысы из 1-й группы (СР); Д - почка крысы из 5-й группы (ВУВЖР + РКн); Е - 30-изображение почки крысы из 2-й группы (СР + РКн).

Fig. 4. Representative micrographs of preparations of rat’s organs stained for intercellular adhesion molecule type 2 (ICAM-2)

A - rat liver from group 1 (B0); B - liver of a rat from group 4 (HFC0); C - 30-image, liver, rat from group 4 (HFC0); 0 - kidney, rat from group 1 (B0); E - kidney, rat from group 5 (HFC0 + RCl); F - 30 image, rat kidney from group 2 (B0 + RCl).

Обсуждение

Согласно полученным данным, у крыс, потреблявших ВУВЖР, повышалась по сравнению с контрольными значениями экспрессия в печени генов Acaca и (на уровне тенденции) Fasn, что вместе с фенотипической картиной ожирения [11] свидетельствует об усилении процессов липогенеза. В проведенном нами ранее исследовании [15] у наследственно тучных крыс Zucker Leprfa отмечали по сравнению с животными "дикого типа" аналогичное повышение экспрессии генов Acaca и Fasn, а также липогенных генов Mlxipl (ChREBP) и Ppara, влияние на которые в настоящем исследовании со стороны ВУВЖР не выявлено. Объяснением тому может являться более выраженная дизрегуляция процессов липогенеза в печени наследственно тучных крыс с гиперфагией, вызванной нарушенной рецепцией лептина, по сравнению с животными "дикого типа", потребляющими меньшие количества ВУВЖР, что согласуется с данными работ [15, 16]. С другой стороны, потребление ВУВЖР вызвало у крыс Вистар повышение экспрессии Khk (кетогексокиназа, известная также как фруктокиназа), что совпадает с данными [17], полученными при избытке фруктозы в рационе. Данный фермент, как известно, превращает фруктозу, поступающую с ВУВЖР, во фруктозо-1-фосфат, расщепляемый далее до треуглеродных фрагментов с их включением в процесс липогенеза [18].

В результате потребления модельной БАД РК крысами, находящимися на питании сбалансированным рационом, экспрессия Acaca, Acacb, Fasn, а также Gck статистически значимо увеличивалась, что видимым образом свидетельствует об усилении процессов липогенеза. Эти изменения, однако, никак не соответствовали сдвигам в биохимических показателях этих животных и степени накопления у них жировой ткани, как следует из ранее представленных данных [11]. Отчасти одной из причин этого может быть одновременное возрастание у животных, потреблявших РК, двигательной активности, определяемой по скорости перемещения в лабиринте [11]. Примечательно, что потребление ВУВЖР отменяло эти эффекты, и, более того, изменение в экспрессии Fasn под действием РК меняло свое направление на противоположное, т.е. отмечался рост экспрессии на фоне СР и подавление на фоне ВУВЖР. Этот результат показывает, что до определенной степени гиполипидемический эффект РК у крыс все-таки наблюдается, но только в условиях относительного избытка потребления жира и фруктозы. Выявленные противоречивые эффекты могут быть, предположительно, связаны с взаимодействием Рес и L-Кар, имеющих разные молекулярные мишени воздействия. Согласно данным [19], у мышей с опухолями L-Кар вызывал снижение экспрессии Fasn, но повышал Ppara. В высоких дозах L-Кар, вызывающий повышение уровней ацилкарнитинов в плазме крови, может оказывать провоспалительное действие [20]. Для Рес характерно подавление экспрессии Ppara и Pparg [21], Scd-1 и Fasn [22] в клеточных культурах, а также липогенных генов in vivo [23, 24].

Увеличение количества ТАТ+-клеток в паренхиме печени крыс, получавших ВУВЖР, свидетельствует об усилении метаболизма свободного тирозина, доступного для транспорта в головной мозг, следствием чего может стать снижение синтеза в стриатуме и гипоталамусе дофамина, опосредующего поддержание высокого уровня двигательной активности и энерготрат [25]. По данным [12], повышенное содержание дофамина в межсинаптических пространствах в стриатуме у крыс DATKO с нокаутом гена транспортера дофамина проявляется в снижении анаболических показателей (массы тела, относительной массы печени и абдоминальной жировой ткани). Введение РК в составе ВУВЖР, потребляемого крысами, привело к снижению экспрессии ТАТ, что могло выразиться в возрастании количества синтезируемого дофамина с повышением дофаминергической активности нейронов стриатума, усилением подвижности и энерготрат. При этом следует иметь в виду, что ген, кодирующий ТАТ, находится под контролем глюкокортикоидов [26], уровни которых могут реагировать на применяемые диетические манипуляции органоспецифическим образом.

Способность Рес (но не L-Кар) снижать экспрессию ICAM-2 известна из данных экспериментов на клеточных культурах [27], однако in vivo, как следует из результатов настоящей работы, это воздействие имеет органоспецифическую природу. Повышенная экспрессия ICAM, рассматриваемая как маркер воспаления при ожирении, регулируется факторами NRF-2 сигнального пути [28]. В свете этого согласованное повышение экспрессии ICAM-2 и NRF-2 в почках крыс при высокой дозе РК может рассматриваться как неблагоприятный фактор и согласуется с ранее выявленными нами признаками усиления старения в ткани почек, вызываемого приемом этой БАД [11].

Из представленных данных следует, что при включении комплексной модельной БАД РК в рацион животных ее влияние на гены ферментов липогенеза, во-первых, различается в зависимости от основного рациона. На фоне потребления СР РК вызывает усиление процессов липогенеза, судя по показателям экспрессии Acaca, Acacb и Fasn. Однако при сочетании потребления РК с ВУВЖР это как минимум не наблюдается или даже происходит подавление экспрессии отдельных липогенных факторов, как это видно на примере Fasn. Сходный эффект наблюдается и по количеству TAT+- и ICAM2+-клеток, значимое снижение которых в печени под влиянием РК наблюдается только у животных, получавших ВУВЖР. Во-вторых, указанный эффект РК оказывается органоспецифическим в том смысле, что приобретает противоположную направленность в почечной ткани. Антиадипогенные свойства Рес и L-Кар по отдельности, известные из литературы [1-4] и подтвержденные данными наших недавних исследований [29, 30], при их сочетании в составе РК, по крайней мере, не усиливаются, а в ряде случаев и взаимно нейтрализуются, что может указывать на антагонистическое взаимодействие продуктов экспрессии генов, являющихся мишенями действия обоих БАВ. Это относится в первую очередь к комплексу генов, отвечающих за синтез жирных кислот и развитие жировой ткани.

Заключение

Таким образом, как показало изучение экспрессии генов в печени и почках, совместное введение Рес и L-Кар в рацион крыс, страдающих ожирением, индуцированным потреблением ВУВЖР, в определенных условиях способно оказывать гиполипидемическое действие и проявлять противовоспалительный эффект в печени, а также модулировать ее нейрометаболическую функцию, опосредованную дофаминовыми системами, через регуляцию метаболизма тирозина. Однако, как показывает сравнение с известными данными литературы о гиполипидемическом и противовоспалительном действии входящих в РК компонентов при ожирении, синергического эффекта Рес и L-Кар не наблюдается, а в ткани почек на фоне потребления сбалансированного рациона имеет место даже определенный антагонизм этих компонентов комплексной БАД. Полученные результаты свидетельствуют о возможном взаимодействии Рес и L-Кар на уровне их влияния на экспрессию комплекса генов, отвечающих за процессы обмена липидов и аминокислот, причем характер этого взаимодействия зависит от применяемого основного рациона, а также является органоспецифическим. Детали влияния компонентов РК на генную экспрессию будут предметом дальнейшего транскриптомного исследования. Выявленные в настоящей работе эффекты дают основание предполагать, что применение минорных БАВ в составе комплексных БАД к пище и диетического лечебного питания у пациентов с ожирением и родственными состояниями следует сочетать с коррекцией состава основного рациона питания больных.

Литература

1. Rauf A., Imran M., Suleria H.A.R., Ahmad B., Peters D.G., Mubarak M.S. A comprehensive review of the health perspectives of resveratrol // Food Funct. 2017. Vol. 8, N 12. P. 4284-4305. DOI: https://doi.org/10.1039/c7fo01300k

2. Malaguarnera L. Influence of resveratrol on the immune response // Nutrients. 2019. Vol. 11, N 5. P. 946. DOI: https://doi.org/10.3390/nu11050946

3. Longo N., Frigeni M., Pasquali M. Carnitine transport and fatty acid oxidation // Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell. Res. 2016. Vol. 1863, N 10. P. 2422-2435. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2016.01.023

4. Panchal S.K., Poudyal H., Ward L.C., Waanders J., Brown L. Modulation of tissue fatty acids by L-carnitine attenuates metabolic syndrome in diet-induced obese rats // Food Funct. 2015. Vol. 6, N 8. P. 2496-2506. DOI: https://doi.org/10.1039/c5fo00480b

5. Wang S., Xu J., Zheng J., Zhang X., Shao J., Zhao L., Hao J. Anti-inflammatory and antioxidant effects of acetyl-l-carnitine on atherosclerotic rats // Med. Sci. Monit. 2020. Vol. 26. Article ID e920250. DOI: https://doi.org/10.12659/MSM.920250

6. Traina G. The neurobiology of acetyl-L-carnitine // Front. Biosci (Landmark Ed). 2016. Vol. 21. P. 1314-1329. DOI: https://doi.org/10.2741/4459

7. Ma S., Feng J., Zhang R., Chen J., Han D., Li X. et al. SIRT1 Activation by resveratrol alleviates cardiac dysfunction via mitochondrial regulation in diabetic cardiomyopathy mice // Oxid. Med. Cell. Longev. 2017. Vol. 2017. Article ID 4602715. DOI: https://doi.org/10.1155/2017/4602715

8. Saqib U., Kelley T.T., Panguluri S.K., Liu D., Savai R., Baig M.S. et al. Polypharmacology or promiscuity? Structural interactions of resveratrol with its bandwagon of targets // Front. Pharmacol. 2018. Vol. 9. P. 1201. DOI: https://doi.org/10.3389/fphar.2018.01201

9. Misawa T., Saitoh T., Kozaki T., Park S., Takahama M., Akira S. Resveratrol inhibits the acetylated-tubulin-mediated assembly of the NLRP3-inflammasome // Int. Immunol. 2015. Vol. 27. P. 425-434. DOI: https://doi.org/10.1093/intimm/dxv018

10. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : The National Academies Press, 2011.

11. Шипелин В.А., Шумакова А.А., Семин М.О., Трусов Н.В., Балакина А.С., Тимонин А.Н. и др. Влияние комплекса L-карнитина и ресвератрола на физиологические, биохимические и морфологические показатели крыс в норме и с алиментарным ожирением // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 1. С. 15-32. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-1-15-32

12. Apryatin S.A., Shipelin V.A., Trusov N.V., Mzhelskaya K.V., Evstratova V.S., Kirbaeva N.V. et al. Comparative analysis of the influence of a high-fat/high-carbohydrate diet on the level of anxiety and neuromotor and cognitive functions in Wistar and DAT-KO rats // Physiol. Rep. 2019. Vol. 7, N 4. Article ID e13987. DOI: https://doi.org/10.14814/phy2.13987

13. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method // Methods. 2001. Vol. 25, N 4. P. 402-408. DOI: https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262

14. Botros M., Sikaris K.A. The De Ritis ratio: the test of time // Clin. Biochem. Rev. 2013. Vol. 34. P. 117-130.

15. Мжельская К.В., Трусов Н.В., Апрятин С.А., Сото С.Х., Гмошинский И.В., Тутельян В.А. Влияние кверцетина на экспрессию генов ферментов углеводного и липидного обмена в печени у крыс с генетически обусловленным и алиментарным ожирением // Вопросы питания. 2019. Т. 88, № 2. С. 6-16. DOI: 10.24411/0042-8833-2019-10012

16. Buqué X., Martínez M.J., Cano A., Miquilena-Colina M.E., García-Monzón C., Aspichueta P. et al. A subset of dysregulated metabolic and survival genes is associated with severity of hepatic steatosis in obese Zucker rats // J. Lipid Res. 2010. Vol. 51, N 3. P. 500-513. DOI: https://doi.org/10.1194/jlr.M001966

17. Vilà L., Rebollo A., Ađalsteisson G.S., Alegret M., Merlos M., Roglans N. et al. Reduction of liver fructokinase expression and improved hepatic inflammation and metabolism in liquid fructose-fed rats after atorvastatin treatment // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2011. Vol. 251, N 1. P. 32-40. DOI: https://doi.org/10.1016/j.taap.2010.11.011

18. Rutledge A.C., Khosrow A. Fructose and the metabolic syndrome: pathophysiology and molecular mechanisms // Nutr. Rev. 2007. Vol. 65, N 6. Pt 2. P. S13-S23. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1753-4887.2007.tb00322.x

19. Jiang F., Zhang Z., Zhang Y., Pan X., Yu L., Liu S. L-Carnitine ameliorates cancer cachexia in mice partly via the carnitine palmitoyltransferase-associated PPAR-γ signaling pathway // Oncol. Res. Treat. 2015. Vol. 38, N 10. P. 511-516. DOI: https://doi.org/10.1159/000439550

20. Liu L., Zhang D.M., Wang M.X., Fan C.Y., Zhou F., Wang S.J. et al. The adverse effects of long-term l-carnitine supplementation on liver and kidney function in rats // Hum. Exp. Toxicol. 2015. Vol. 34, N 11. P. 1148-1161. DOI: https://doi.org/10.1177/0960327115571767

21. Dong W., Wang X., Bi S., Pan Z., Liu S. et al. Inhibitory effects of resveratrol on foam cell formation are mediated through monocyte chemotactic protein-1 and lipid metabolism-related proteins // Int. J. Mol. Med. 2014. Vol. 33, N 5. P. 1161-1168. DOI: https://doi.org/10.3892/ijmm.2014.1680

22. Ardid-Ruiz A., Ibars M., Mena P., Del Rio D., Muguerza B., Arola L. et al. Resveratrol treatment enhances the cellular response to leptin by increasing OBRb content in palmitate-induced steatotic HepG2 cells // Int. J. Mol. Sci. 2019. Vol. 20, N 24. P. 6282. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20246282

23. Lin H.C., Chen Y.F., Hsu W.H., Yang C.W., Kao C.H., Tsai T.F. Resveratrol helps recovery from fatty liver and protects against hepatocellular carcinoma induced by hepatitis B virus X protein in a mouse model // Cancer Prev. Res. (Phila). 2012. Vol. 5, N 7. P. 952-962. DOI: https://doi.org/10.1158/1940-6207.CAPR-12-0001

24. Mendes K.L., de Pinho L., Andrade J.M., Paraíso A.F., Lula J.F., Macedo S.M. et al. Distinct metabolic effects of resveratrol on lipogenesis markers in mice adipose tissue treated with high-polyunsaturated fat and high-protein diets // Life Sci. 2016. Vol. 153. P. 66-73. DOI: https://doi.org/10.1016/j.lfs.2016.04.014

25. Volkow N.D., Wang G.J., Baler R.D. Reward, dopamine and the control of food intake: implications for obesity // Trends Cogn. Sci. 2011. Vol. 15, N 1. P. 37-46. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tics.2010.11.001

26. Johansson M., Johansson N., Lund B.O. Xenobiotics and the glucocorticoid receptor: additive antagonistic effects on tyrosine aminotransferase activity in rat hepatoma cells // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2005. Vol. 96, N 4. P. 309-315. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1742-7843.2005.pto960406.x

27. Schwager J., Richard N., Widmer F., Raederstor D. Resveratrol distinctively modulates the inflammatory profiles of immune and endothelial cells // BMC Complement. Altern. Med. 2017. Vol. 17, N 1. P. 309. DOI: https://doi.org/10.1186/s12906-017-1823-z

28. Ahmed S.M., Luo L., Namani A., Wang X.J., Tang X. Nrf2 signaling pathway: pivotal roles in inflammation // Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2017. Vol. 1863, N 2. P. 585-597. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.11.005

29. Trusov N.V., Shipelin V.A., Mzhelskaya K.V., Shumakova A.A., Timonin A.N., Riger N.A. et al. Effect of resveratrol on behavioral, biochemical and immunological parameters of DBA/2J and tetrahybrid DBCB mice receiving diet with excess fat and fructose // J. Nutr. Biochem. 2021. Vol. 8. Article ID 108527. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jnutbio.2020.108527

30. Трусов Н.В., Мжельская К.В., Шипелин В.А., Шумакова А.А., Тимонин А.Н., Ригер Н.А. и др. Влияние l-карнитина на иммунологические, интегральные и биохимические показатели мышей, получающих рацион с избытком жира и фруктозы // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 2019. Т. 105, № 5. С. 619-633. DOI: https://doi.org/10.1134/S0869813919050121

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
РОСМЕДОБР 2021
Вскрытие
Медицина сегодня
Пост-релиз "Молекулярная диагностика"

Молекулярная диагностика на страже "биопорядка": как современные технологии позволяют выжить в век эпидемий Новые технологии молекулярной диагностики в эпоху COVID-19/пандемий Обеспечение массового экспресс-тестирования населения - приоритетная задача, которая поможет...

"Муковисцидоз: из детства во взрослую жизнь"

Всероссийская школа по Муковисцидозу с международным участием "Муковисцидоз: из детства во взрослую жизнь" С 24 по 25 ноября 2021 года профессионалы в области педиатрии, терапии, пульмонологии, гастроэнтерологии, эндокринологии, генетики, диетологии, микробиологии,...

Амбулаторный прием 24 ноября.

Коморбидность - бич современного общества и головная боль для каждого терапевта. Как минимизировать комбинации препаратов и, как следствие, побочных эффектов у больных с сочетанной патологией? Именно этот злободневный вопрос мы задали ведущим экспертам российского...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»