Синефрин в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции: биологическая активность, безопасность и методы анализа

Резюме

Синефрин является натуральным протоалкалоидом горького апельсина Citrus aurantium L, имеющим структурное сходство с эфедрином и адреналином. Синефрин в виде экстракта горького апельсина широко применяется в качестве ингредиента биологически активных добавок (БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (CПП), предназначенных для снижения массы тела и улучшения физической формы. Наряду с термогенным и липолитическим действием синефрин способен вызывать побочные эффекты со стороны сердечнососудистой системы, особенно в сочетании с кофеином и физической нагрузкой. Этот аспект актуален, поскольку основными потребителями продуктов для похудения являются лица с избыточной массой тела, которые подвержены риску развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Цель работы - гигиеническая оценка использования экстракта горького апельсина и синефрина в БАД к пище и СПП, которая включает анализ подходов к техническому регулированию в Российской Федерации и за рубежом, обзор данных по биологической активности, безопасности, способах фальсификации и методов определения цитрусовых протоалкалоидов.

Результаты. Адренергическое действие горького апельсина обусловлено присутствием R-(-)-n-синефрина, который составляет 90% и более от суммы протоалкалоидов. При производстве БАД к пище и СПП используются сухие экстракты плодов горького апельсина, стандартизованные по содержанию синефрина, которое может варьировать от 4 до 98%. Синефрин является слабым адренергическим агонистом, действующим преимущественно через β3-адренорецепторы, стимулируя липолиз. В связи с недостаточными данными о безопасности потребление синефрина регулируется в Российской Федерации и за рубежом. В Российской Федерации верхний допустимый уровень суточного потребления синефрина составляет 30 мг. Выявлены различные случаи фальсификации БАД к пище и СПП для снижения массы тела и питания спортсменов: недекларированное добавление синефрина в составе экстракта горького апельсина, добавление синтетического синефрина, его изомеров или аналогов. Основным методом определения синефрина и других биогенных аминов в БАД к пище и СПП является высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым и/или масс-детектированием.

Заключение. Приведенные в обзоре данные подтверждают целесообразность разработки официальной методики определения основных протоалкалоидов и проведения на его основе мониторинга БАД к пище и СПП на содержание синефрина и других цитрусовых протоалкалоидов.

Ключевые слова:синефрин, горький апельсин, БАД к пище, фальсификация, ВЭЖХ

Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания (тема 0529-2019-0058).

Конфликт интересов. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Для цитирования: Перова И.Б., Эллер К.И., Мусатов А.В., Тумольская Е.В. Синефрин в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции: биологическая активность, безопасность и методы анализа // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 6. С. 101-113. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-6-101-113

Синефрин является основным биогенным амином горького апельсина Citrus aurantium L., имеющим структурное сходство с эфедрином и адреналином. В незначительных концентрациях он может присутствовать в ряде других представителей цитрусовых Citrus spp. (мандарин, апельсин, лимон). Широкое применение синефрина в составе биологически активных добавок (БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (СПП) связывают с запретом в 2004 г. Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) использования травы эфедры и эфедрина в составе растительных препаратов и БАД к пище, предназначенных для снижения массы тела и спортивного питания. В качестве альтернативы эфедрину для БАД к пище и СПП, направленных на снижение жировой массы, подавление аппетита, повышение термогенеза, ускорение метаболизма, был предложен синефрин, обычно в виде экстракта горького апельсина. Наряду с термогенным и липолитическим действием экстракты горького апельсина и синефрин оказывают ряд побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы [1-4]. Этот аспект особенно актуален, поскольку целевая аудитория продукции для похудения - лица с избыточной массой тела и ожирением, подверженные риску развития сердечно-сосудистых заболеваний. Экстракт горького апельсина способен ингибировать изофермент цитохрома Р450 CYP3A4, поэтому не следует исключать взаимодействия с лекарственными препаратами (ЛП), приводящие к изменению их фармакодинамических свойств. Кроме того, синергизм, наблюдаемый при одновременном приеме синефрина с кофеином, особенно в сочетании с физической активностью, может привести к усилению таких побочных эффектов, как тахикардия и гипертензия. Другие активные компоненты, содержащиеся в экстракте горького апельсина, также могут усиливать побочные эффекты синефрина.

Цель настоящего обзора - гигиеническая оценка использования экстракта горького апельсина и синефрина в БАД к пище и СПП, которая включает анализ подходов к техническому регулированию в Российской Федерации и за рубежом, обзор данных о биологической активности, безопасности, способах фальсификации и методах определения цитрусовых протоалкалоидов.

Горький апельсин Citrus aurantium L.

Горький апельсин Citrus aurantium L. [таксономические синонимы C. aurantium L. subsp. aurantium и C. aurantium subsp. amara (Link) Engler], называемый также померанцем, кислым и севильским апельсином, - вид растений рода Citrus spp. семейства Рутовые (Rutaceae). Родиной горького апельсина считается ЮгоВосточная Азия, в настоящее время коммерческое культивирование горького апельсина проводится в Южной Европе, странах Средиземноморья, Карибского бассейна и США. Горький апельсин известен под различными местными народными названиями во многих странах мира, где он используется в кулинарии, парфюмерии и медицине. Плоды, кожура и эфирное масло применяются для приготовления мармеладов и других кондитерских изделий, сиропов, соков, ликеров, пива, горьких настоек, маринадов и приправ. Горький апельсин является источником многих коммерческих ингредиентов для парфюмерной промышленности, в том числе масла нероли и петигренового масла. В традиционной медицине стран Азии плоды горького апельсина в течение многих столетий использовались для лечения диспепсии.

Кожура горького апельсина содержит до 2,5% эфирного масла, основным компонентом которого является (R)-(+)-лимонен, производные кумаринов (меранзин, умбеллиферон, эпоксибергамоттин, бергаптен), гликозиды флаванонов и флавонолов с горьким (нарингин, неогесперидин, неоэриоцитрин) и негорьким (рутин, гесперидин, эриоцитрин) вкусами, полиметилированные флавоны (синенсетин, нобилетин, танжеретин и др.), а также тетранортритерпены (лимоноиды) [5, 6].

В плодах горького апельсина обнаружены фенэтанол- и фенэтиламины: октопамин, синефрин, тирамин, N-метилтирамин и горденин (рис. 1). По химической классификации их относят к биогенным аминам, или протоалкалоидам. Основным действующим началом, обусловливающим адренергическое действие горького апельсина, считается п-синефрин, на долю которого приходится более 90% от суммы протоалкалоидов. По данным литературы, концентрация синефрина в сушеной кожуре и сушеных плодах горького апельсина варьирует в диапазоне от 0,05 до 3,1% [5-7]. Наибольшее количество синефрина было обнаружено в цедре неспелых плодов [6].

Рис. 1. Химические структуры биогенных аминов горького апельсина

Fig. 1. Chemical structures of bitter orange biogenic amines

Синефрин

По химической структуре синефрин (п-синефрин, ок-седрин, R-(-)-4-[1-гидрокси-2-(метиламино)этил]фенол) представляет собой вторичный метилфенэтаноламин с фенольным гидроксилом в п-положении (см. рис. 1). Наличие алифатической аминогруппы придает синефрину выраженные основные свойства. Хиральный атом углерода в 1' положении обусловливает существование синефрина в виде двух энантиомеров (S)- и (R)-конфигурации (рис. 2). Удельное вращение R-(-)-изомера в 0,5 н. растворе соляной кислоты составляет -55,6° [8].

Рис. 2. Энантиомеры синефрина

Fig. 2. Enantiomers of synephrine

В плодах горького апельсина и других цитрусовых содержится R-(-)-синефрин. В процессе переработки под действием высоких температур в кислой или щелочной средах может происходить рацемизация [9]. Полученный путем химического синтеза синефрин является рацематом.

При производстве БАД к пище и СПП используются сухие водно-спиртовые экстракты сушеных незрелых плодов или сушеной кожуры незрелых и зрелых плодов горького апельсина. Они стандартизируются по содержанию п-синефрина, которое может варьировать от 4 до 98% [5, 10]. В ряде случаев производители дополнительно стандартизируют экстракты горького апельсина по содержанию минорных протоалкалоидов (октопамина, горденина).

Применение горького апельсина в медицине

В Китайскую фармакопею включены 2 вида лекарственного растительного сырья горького апельсина: Fructus Aurantii (ZhiQiao) и Fructus Aurantii immaturus (ZhiShi). ZhiQiao представляют собой сушеные зрелые плоды, собранные в июле, ZhiShi - незрелые плоды, собранные в мае-июне (табл. 1). При этом каждый вид сырья нашел свое применение в клинической практике как средство для лечения функциональных заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Дозировка составляет от 3 до 10 г высушенных плодов в день в виде отвара.

Таблица 1. Фармакопейное лекарственное растительное сырье горького апельсина

Table 1. Bitter orange herbal drugs included in Pharmacopoeias

Фармакопейные статьи на незрелые (ZhiShi) плоды горького апельсина Fructus aurantii immaturus включены в Тайваньскую травяную фармакопею 2-го издания, на цедру - в Японскую фармакопею 17-го издания (см. табл. 1). Европейская фармакопея 7-го издания содержит монографии на цветки, масло цветков, эпикарп-мезокарп и настойку эпикарпа-мезокарпа горького апельсина (см. табл. 1). Незрелые плоды стандартизуют по содержанию синефрина, а зрелые - по содержанию флаванонгликозидов или эфирного масла.

В современной европейской фитотерапии кожура горького апельсина используется для стимуляции аппетита и лечения диспепсии и связанных с ней состояний. Согласно рекомендациям Немецкой комиссии Е при Федеральном институте лекарственных средств и медицинских устройств суточная доза для высушенной цедры составляет 4-6 г, для настойки - 2-3 г и для экстракта - 1-2 г [5].

Следует отметить, что традиционное применение горького апельсина в качестве средства для лечения функциональных заболеваний ЖКТ принципиально отличается от его применения в качестве ингредиента БАД к пище и СПП для снижения массы тела.

Синефрина тартрат (Окседрин, Симпатол, Симпалепт) зарегистрирован в качестве рецептурного лекарственного препарата для лечения астмы и гипотензии в ряде стран Европейского союза (ЕС). Дозировка для взрослых составляет 100-150 мг 3 раза в день, для детей в возрасте от 4 до 10 лет - 75-100 мг 3 раза в день, от 1 года до 4 лет - 50-75 мг 3 раза в день и 15-25 мг 3 раза в день для детей в возрасте от 3 мес.

Применение синефрина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции

На территории Таможенного союза с 2011 по 2020 г. зарегистрировано более 90 БАД к пище, в составе которых фигурирует синефрин. В большинство БАД к пище синефрин включен в виде экстракта плодов, кожуры плодов или семян горького апельсина. В отдельных случаях в состав БАД к пище входит синтетический синефрин в виде гидрохлорида. Количество синефрина в БАД к пище варьирует от следовых концентраций до 30 мг, иногда с примечанием "не более", поскольку согласно Приложению 5 Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) верхний допустимый уровень суточного потребления синефрина установлен на уровне 30 мг.

Механизм действия синефрина

Сходство синефрина с эндогенными агонистами адренорецепторов: адреналином и норадреналином - заключается в общем основном структурном элементе - фенэтиламине. Фенольные гидроксилы в ми п-положениях затрудняют прохождение через гематоэнцефалический барьер, поэтому влияние на центральную нервную систему (ЦНС) отсутствует. Синефрин, а также октопамин, горденин и фенилэфрин относятся к адреномиметикам прямого действия, поскольку на периферии напрямую связываются с адренорецепторами и активируют их. Адреналин и норадреналин также имеют фенольный гидроксил в м-положении, который, по данным исследований, способствует связыванию адренергических рецепторов, ответственных за сердечно-сосудистые эффекты, в то время как фенольный гидроксил в п-положении снижает связывание адренергических рецепторов [1]. Поэтому п-синефрин и п-октопамин являются более слабыми адренергическими агонистами, чем их м-изомеры: м-синефрин (фенилэфрин) и м-октопамин (норфенэфрин). При этом и м- и п-изомеры синефрина и октопамина на несколько порядков менее активны, чем норадреналин [6, 7, 11, 12]. Адренергическая активность R-(-)-энантиомеров в 1-3 раза выше, чем у соответствующих S-(+)-энантиомеров [6, 12].

Биологическая активность R-(-)-синефрина в 2 раза выше, чем у рацемата [13, 14]. Показана примерно на 1-2 порядка более высокая активность синефрина и октопамина в отношении α-адренорецепторов, чем в отношении β-адренорецепторов [6, 15]. Предполагается, что синефрин действует преимущественно через β3-адренорецепторы, стимулируя липолиз, в то время как м-синефрин действует через α-, β1 и β2-адренорецепторы, повышая артериальное давление и частоту сердечных сокращений (ЧСС) [15, 16].

Сочетание синефрина с кофеином усиливает эффект снижения массы тела [1-3, 11, 15, 16]. В жировой ткани находятся аденозиновые рецепторы А1, активация которых приводит к подавлению липолиза, повышению захвата глюкозы адипоцитами, снижению выброса нейротрансмиттеров. Кофеин является стимулятором ЦНС и сердечно-сосудистой системы, прежде всего за счет антагонистического действия на аденозиновые рецепторы. Кофеин способен также блокировать аденозиновые рецепторы А1 в жировой ткани и дополнительно активировать липолиз.

Фармакокинетика синефрина

После перорального приема человеком синефрин быстро и полностью абсорбируется. Максимальная концентрация в плазме крови достигается через 1-2 ч с периодом полужизни 2-3 ч [7, 16]. Приблизительно 80% синефрина экскретируется с мочой в течение суток. Всего 2,5% синефрина выводится в неизменном виде. Биотрансформация синефрина и октопамина происходит с участием моноаминооксидазы (МАО). Основным метаболитом синефрина в моче является п-гидроксиминдальная кислота (~53%), которая затем превращается в п-гидроксифенилгликоль в свободном виде или в виде конъюгатов с глюкуроновой или серной кислотами [7, 16]. Биодоступность синефрина при пероральном введении была более низкой, чем при внутривенном введении.

Горький апельсин ингибирует изофермент цитохрома Р450 CYP3A4 [1, 7, 16], участвующий в метаболизме целого ряда лекарственных средств (ЛС), среди которых блокаторы кальциевых каналов, антиаритмические средства, статины, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, силденафил. В результате потребления БАД к пище и СПП с экстрактом горького апельсина могут повыситься концентрации вышеперечисленных ЛС в крови, следовательно, возникает риск передозировки и токсического действия.

Одновременное потребление БАД к пище и СПП с экстрактом горького апельсина с ингибиторами МАО может привести к увеличению концентрации синефрина, а также других аминов в крови с соответствующими побочными эффектами.

Безопасность, побочные эффекты и токсичность

Прием БАД к пище и потребление СПП, содержащих экстракт горького апельсина, вызывает опасения в основном из-за возможных сердечно-сосудистых побочных эффектов, обусловленных более высоким содержанием синефрина по сравнению с пищевыми продуктами и традиционными отварами из плодов или кожуры горького апельсина [5-7, 11, 15].

В исследовании острой токсичности при пероральном приеме экстракта горького апельсина и синефрина наблюдались такие побочные эффекты, как снижение двигательной активности, затрудненное дыхание, слюноотделение, пилоэрекция и экзофтальм [13]. Все эффекты были обратимыми, возникали через 15 мин после приема и длились в течение 2-4 ч.

Подострая и субхроническая токсичность при пероральном приеме экстрактов горького апельсина (4-7,5% синефрина) и чистого синефрина (95-99%) изучались на мышах и крысах в течение 7-79 дней [5, 7, 13-16]. Синефрин в виде экстракта горького апельсина и чистого вещества в низких и средних дозах приводил к увеличению ЧСС, снижению гематокрита и общего белка в крови, в максимальных дозах (20-50 мг/кг в день) - к вентрикулярной аритмии, удлинению QRS-комплекса, повышению систолического и диастолического давления [5, 7, 15, 16]. Показано, что одновременный прием кофеина и физическая активность усиливают эффекты синефрина.

Хроническая, гено-, иммуно-, репродуктивная и онтогенетическая токсичность, а также канцерогенность для синефрина на сегодняшний день недостаточно изучены.

Подтвержденных данных о побочных эффектах экстракта горького апельсина и его компонентов немного. В 2003-2014 гг. в США, Канаде и Европе были опубликованы отчеты о побочных эффектах и случаях смерти при потреблении продуктов с экстрактом горького апельсина [7, 11, 12, 15-17]. Интерпретация результатов большинства отчетов затрудняется тем, что использованные многокомпонентные продукты содержали, кроме экстракта горького апельсина, эфедру, кофеин, их комбинацию, а также приемом других БАД к пище, ЛС и наркотиков, недостатком информации о состоянии здоровья и вредных привычках [7, 12, 15-17]. Только в единичных случаях причинно-следственная связь между приемом БАД к пище с экстрактом горького апельсина и возникновением побочных эффектов была оценена как "вероятная" или "весьма вероятная" [7, 17].

Количество клинических исследований влияния экстракта горького апельсина и синефрина на сердечно-сосудистую систему ограничено, а полученные данные неоднозначны. В нескольких работах сообщалось о повышении систолического и диастолического давления, а также ЧСС у здоровых нормотензивных людей при потреблении синефрина в составе экстракта горького апельсина, особенно в сочетании с кофеином [5, 7, 11, 12, 15-17]. Подавляющее большинство клинических исследований было проведено на здоровых людях с нормальным давлением, в то время как основными потребителями БАД к пище и СПП с экстрактом горького апельсина являются лица с избыточной массой тела, у которых артериальная гипертензия встречается чаще, чем среди лиц с нормальной массой тела.

Гигиеническое регулирование потребления синефрина

В связи с недостаточными данными о безопасности синефрин является объектом гигиенического регулирования во многих странах мира, в том числе в Российской Федерации.

Всемирное антидопинговое агентство (ВАДА) включило синефрин в программу мониторинга на 2021 г. с целью выявления способов злоупотребления им в спорте [18]. Октопамин входит в запрещенный список ВАДА [18]. В то же время некоторые национальные спортивные ассоциации запрещают использование как синефрина, так и октопамина [19].

Данные по существующему законодательству, регулирующему применение синефрина в различных странах, приведены в табл. 2.

Таблица 2. Гигиеническое регулирование потребления синефрина в различных странах

Table 2. Hygienic regulation of synephrine consumption in different countries

Анализ рисков фальсификации биологически активных добавок к пище и специализированной пищевой продукции

К возможным проблемам применения экстракта горького апельсина в БАД к пище и СПП относятся неправильная идентификация и фальсификация. В плане ботанической идентификации необходимо отличать экстракты горького апельсина Citrus aurantium L. ssp. aurantium L. от экстрактов бергамота Citrus aurantium L. spp. bergamia (Risso&Poit.) Engl., поскольку в плодах этих подвидов содержатся различные количества биологически активных веществ, в том числе п-синефрина и фуранокумаринов. БАД к пище для снижения массы тела являются одной из самых распространенных групп БАД к пище, используемых потребителями. В этой связи FDA оценивает риск фальсификации БАД к пище для снижения массы тела и спортсменов, содержащих синефрин, как высокий. В отношении синефрина существует несколько типов фальсификации: недекларированное добавление синефрина и других протоалкалоидов в составе экстракта горького апельсина в БАД к пище, добавление синтетического синефрина, его изомеров (например, м-синефрина) или аналогов.

По данным Европейской системы быстрого оповещения, для пищевых продуктов и кормов (RASFF) с 1998 по 2018 г. синефрин был вторым по распространенности недекларированным фармакологически активным веществом в БАД к пище после силденафила [22]. В БАД к пище, экспортируемых в ЕС из США, содержание синефрина составило 15-21 мг/г. Кроме синефрина были также найдены другие недекларированные биогенные амины: октопамин на уровне 107,5 мг/г и метилсинефрин на уровне 30,0-45,7 мг/г [23]. За 2019-2021 гг. на портале RASFF регулярно появляются сообщения о недекларированном добавлении синефрина в БАД к пище, о сочетании синефрина и кофеина в БАД к пище в странах, где их совместное присутствие в БАД или запрещено, или ограничено.

В 2020 г. опубликованы результаты исследования, проведенного в лаборатории Центра по безопасности пищи и прикладного питания (CFSAN, Center Food Safety and Applied Nutrition) [24]. Был проведен анализ 5 натуральных и 4 синтетических фенэтиламинов в 59 БАД к пище, содержащих сырье, экстракты и стандартизованные экстракты горького апельсина, а также чистые фенэтиламины из горького апельсина и/или их синтетические производные. Синефрин был найден во всех образцах (табл. 3). В ряде БАД к пище обнаружено высокое содержание аминов - до 160 мг синефрина, 130 мг октопамина, 60 мг горденина и 26 мг N-метилтирамина в суточной дозе, что существенно превышает установленные в Российской Федерации и ЕС безопасные уровни поступления этих веществ. В состав некоторых БАД к пище были включены даже ЛП метилсинефрин (оксилофрин) и изопропилоктопамин (БетафринТМ) в количестве соответственно до 240 и 76 мг/сут. Оксилофрин не встречается в природе и представляет собой синтетическое производное синефрина. Он зарегистрирован в некоторых странах, например в Великобритании, как рецептурный ЛП для стимуляции работы сердца и лечения гипотонии. Обычно терапевтическая суточная доза оксилофрина для взрослых составляет 16-40 мг, для детей и подростков 8-24 мг.

Таблица 3. Содержание натуральных и синтетических аминов в биологически активных добавках к пище (БАД), распространяемых в торговой сети США [по данным 24]

Table 3. Content of natural and synthetic amines in dietary supplements from USA market [according to 24]

П р и м е ч а н и е. Н/о - не обнаружено. Note: Н/о - not found.

Оксилофрин и другие синтетические амины запрещены для использования в БАД к пище в Российской Федерации, США, странах Европы, Австралии и Новой Зеландии. Оксилофрин также входит в запрещенный список ВАДА [18]. В составе БАД к пище он может обозначаться как "метилсинефрин", "синефрин" или маскироваться под растительный компонент - экстракт черно-кистной акации Vachellia rigidula (Benth.) Seigler&Ebinger.

Согласно опубликованным в Нидерландах результатам исследований, прием БАД к пище, содержащих оксилофрин, привел к возникновению 26 побочных эффектов, среди которых тошнота, рвота, тахикардия, аритмия и гипертония [24, 25].

На этикетках БАД к пище с экстрактом горького апельсина, произведенных в США и Европе, часто не декларируется наличие синефрина.

Потенциальную опасность для потребителей представляют незарегистированные в Российской Федерации БАД к пище и СПП, которые реализуются через интернет-магазины и торговые онлайн-площадки. В состав таких продуктов входят экстракты горького апельсина с содержанием синефрина 50% и более, синтетический синефрин, горденин, метилсинефрин под видом экстракта чернокустарниковой акации и другие запрещенные амины, а суточные дозы синефрина превышают 30 мг. В этой связи необходимо при проведении экспертизы разрабатывать и внедрять в практику работы контролирующих лабораторий методики анализа БАД к пище и СПП на содержание синефрина и родственных аминов.

Методы анализа синефрина в сырье, биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции

Для определения синефрина и других адренергических аминов в сырье, экстрактах, БАД к пище и СПП используют обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ ВЭЖХ) с диодно-матричным (ДМД) спектрофотометрическим [9, 10, 13, 26-35], флуориметрическим [27, 28, 31, 36, 37], электрохимическим [38] или масс-спектрометрическим (МС) детектированием [24, 31, 39-42], высокоэффективную тонкослойную хроматографию с денситометрией [43] и капиллярный электрофорез (КЭФ) со спектрофотометрическим и электрохимическим детектированием [44].

Наиболее распространенным методом количественного анализа синефрина и других биогенных аминов горького апельсина является ОФ ВЭЖХ. Разделение биогенных аминов проводится на колонках С18, С8 или колонках с сильным катионообменным сорбентом [13, 26, 45-47] в изократическом или градиентном режиме. Водный компонент подвижной фазы имеет сильнокислую (рН 2-3), нейтральную или слабощелочную реакцию среды (рН 7-8). Органические компоненты подвижной фазы включают ацетонитрил, метанол или их смеси. Проблемы, возникающие при анализе биогенных аминов, связаны с их относительно низким содержанием в сырье, выраженными основными свойствами, высокой полярностью и низким коэффициентом удерживания на колонках С18, малой интенсивностью и неселективностью поглощения в области ультрафиолетового (УФ)-спектра, характерной для многих ароматических соединений (220-230 и 270-280 нм). С целью оптимизации времени удерживания и улучшения формы пиков для анализа биогенных аминов часто применяется ионпарная ВЭЖХ. В качестве ион-парных реагентов используют додецилсульфат натрия [27-30, 32, 33], лаурилсульфат натрия [34] и гексансульфоновую кислоту [26, 35]. Проблемы недостаточного удерживания

и слабого сигнала синефрина в УФ-спектре, связанные с недостатком хромофорных групп, иногда решали с помощью пред- и постколоночной дериватизации [39, 40, 48]. В качестве дериватизующих агентов для синефрина и других аминов используют дансил хлорид, 9-флуо-ренилметилхлорформиат и о-фталевый альдегид. Описано также использование флуориметрического детектора, поскольку синефрин и другие биогенные амины цитрусовых обладают естественной флуоресценцией в УФ-области спектра с длинами волн возбуждения 270-280 нм и длинами волн эмиссии 300-320 нм [27, 28, 31, 36, 37].

В последнее десятилетие для анализа биогенных аминов цитрусовых широкое применение получила ВЭЖХ-МС с ионизацией электрораспылением и различными типами масс-анализаторов, среди которых времяпролетный, квадрупольный, тройной квадрупольный, квадрупольно-времяпролетный, ионная ловушка [24, 39-42]. Такой подход позволяет с высокой селективностью и чувствительностью идентифицировать и определять следовые количества биогенных аминов в сложных матриксах БАД к пище и СПП. Молекулярная масса синефрина составляет 167,21 г/моль. Детектирование синефрина в режиме полного сканирования положительных ионов проводится по протонированному псевдомолекулярному иону [M + H]+ с m/z 168 Да и дегидратированному протонированному псевдомолекулярному иону [M - H2O + H]+ с m/z 150 Да.

Определение энантиомеров синефрина проводят с помощью хиральных ВЭЖХ и КЭФ [40, 44, 48]. В первом случае разделение проводится с использованием хиральных колонок, во втором - циклодекстринов в буферном растворе.

Результаты определения синефрина в растительном сырье, экстрактах, биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции

В научных целях, а также для проведения исследования содержания синефрина в БАД к пище и СПП в рамках санитарно-эпидемиологической экспертизы была разработана оригинальная ион-парная ОФ ВЭЖХ-ДМД-методика. Извлечение синефрина из матриксов растительных экстрактов, БАД к пище и СПП проводили 50% водным метанолом на ультразвуковой бане при комнатной температуре. Субстанции синефрина и октопамина гидрохлорида растворяли в метаноле. В качестве неподвижной фазы использовали колонку Phenomenex Luna C18(2) 250x4,6 мм с размером частиц 5 мкм. Экспериментально подобранные условия оптимального хроматографического разделения синефрина и октопамина приведены в табл. 4.

Таблица 4. Условия определения синефрина и октопамина методом ион-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием (ДМД)

Table 4. Conditions for the determination of synephrine and octopamine by ion-pair reversed-phase HPLC (high-performance liquid chromatography) with diode-array detection

Хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина изображена на рис. 3А, извлечения из БАД к пище с экстрактом горького апельсина - на рис. 3Б.

Рис. 3. Хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина (А) и метанольного экстракта биологически активной добавки к пище с экстрактом горького апельсина (Б) при λ=224 нм

Fig. 3. Chromatogram of a mixture of standards of synephrine and octopamine (A) and methanol extract of dietary supplement containing bitter orange extract (B) at λ=224 nm

Разработанная методика прошла метрологическую аттестацию, получила статус методики измерений МИ (регистрационный № 21-12ФЦ/89-м от 07.09.2021) и была включена в соответствующий проект методических указаний МУК "Методика определения синефрина и октопамина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции".

Для подтверждения присутствия синефрина в ряде образцов дополнительно проводили ВЭЖХ-МС. Исследовано более 80 образцов, среди которых субстанции синефрина и октопамина гидрохлорида, экстракты горького апельсина, БАД к пище и СПП. Стандартизованные по содержанию синефрина экстракты горького апельсина соответствовали спецификации производителя (6, 8 или 10%, а в 4 образцах - 30%). Количество синефрина в БАД к пище и СПП варьировало от следовых количеств до 32 мг/капс, что превышает верхний допустимый уровень потребления 30 мг. В большинстве исследованных БАД к пище и СПП количество синефрина составляло 5-6 мг в 1 капсуле или таблетке и соответствовало адекватному суточному потреблению синефрина (5 мг). В 9 образцах БАД к пище и СПП синефрин не был обнаружен.

В одном образце экстракта горького апельсина были обнаружены октопамин и синефрин (6 и 10% соответственно). Другие минорные протоалкалоиды (тирамин, N-метилтирамин и горденин) присутствовали в ряде образцов в количествах на порядок и более меньших, чем синефрин.

Заключение

Приведенные данные подтверждают целесообразность разработки официальной методики анализа протоалкалоидов и проведения на ее основе мониторинга БАД к пище и СПП, предназначенных для контроля массы тела и спортивного питания, на содержание синефрина и других цитрусовых протоалкалоидов.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Stohs S.J. Safety, efficacy, and mechanistic studies regarding Citrus aurantium (bitter orange) extract and p-synephrine. Phytother Res. 2017; 31 (10): 1463-74. DOI: https://doi.org/10.1002/ptr.5879

2. Ruiz-Moreno C., Del Coso J., Giráldez-Costas V., González-García J., Gutiérrez-Hellín J. Effects of p-synephrine during exercise: a brief narrative review. Nutrients. 2021; 13 (1): 233. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13010233

3. Kaats G.R., Leckie R.B., Mrvichin N., Stohs S.J. Increased eating control and energy levels associated with consumption of bitter orange (p-synephrine) extract: a randomized placebo-controlled study. Nutr Diet Suppl. 2017; 9: 29-35. DOI: https://doi.org/10.2147/NDS.S136756

4. Di Lorenzo C., Ceschi A., Kupferschmidt H., Lüde S., De Souza Nascimento E., Dos Santos A., et al. Adverse effects of plant food supplements and botanical preparations: a systematic review with critical evaluation of causality. Br J Clin Pharmacol. 2015; 79( 4): 578-92. DOI: https://doi.org/10.1111/bcp.12519

5. EFSA Scientific Cooperation (ESCO) Working Group on Botanicals and Botanical Preparations. Advice on the EFSA guidance document for the safety assessment of botanicals and botanical preparations intended for use as food supplements, based on real case studies. EFSA J. 2009; 7 (9): 280. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2009.280

6. EFSA SC (EFSA Scientific Committee), 2014. Scientific Opinion on a Qualified Presumption of Safety (QPS) approach for the safety assessment of botanicals and botanical preparations. EFSA J. 2014; 12 (3): 3593. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2014.3593

7. Maisons-Alfort ANSES Opinion, Request No. 2012-SA-0200. OPINION of the French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safetyon the risks associated with the presence in food supplements of p-synephrine or ingredients obtained from Citrus spp. fruits containing this substance. 2014: 46 p. URL: https://www.anses.fr/en/system/files/NUT2012sa0200EN.pdf

8. Stewart I., Newhall W.F., Edwads G.L. The isolation and identification of l-synephrine in leaves and fruit of Citrus. J Biol Chem. 1964; 239 (3): 930-2. DOI: https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51679-3

9. Pellati F., Cannazza G., Benvenuti S. Study on the racemization of synephrine by off-column chiral high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 2010; 1217 (21): 3503-10. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2010.03.026.

10. Avula B., Upparapalli S.K., Navarrete A., Khan I.A. Simultaneous quantification of adrenergic amines and flavonoids in C. aurantium, various Citrus species, and dietary supplements by liquid chromatography. J AOAC Int. 2005; 88 (6): 1593-606.

11. BfR Opinion No. 004/2013. Health assessment of sports and weight loss products containing synephrine and caffeine. 2012: 29 p.

12. Food Standards Australia New Zealand (FSANZ). Risk assessment of oxedrine in foods intended to promote weight loss. 2015: 18 p.

13. Arbo M.D., Larentis E.R., Linck V.M., Aboy A.L., Pimentel A.L., Henriques A.T., et al. Concentrations of p-synephrine in fruits and leaves of Citrus species (Rutaceae) and the acute toxicity testing of Citrus aurantium extract and p-synephrine. Food Chem Toxicol. 2008; 46 (8): 2770-5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2008.04.037

14. Stohs S.J., Preuss H.J. Stereochemical and pharmacological differences between naturally occuring p-synephrine and synthetic p-synephrine. J Funct Foods. 2012; 4 (1): 2-5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jff.2011.09.004

15. Sawler S. Health Canada Synephrine, Octopamine Caffeine Health Risk Assessment (HRA) Report. 2013: 49 p.

16. Tiesjema B., Jeurissen S.M.F., de Wit L., Mol H., Fragki S., Razenberg L. Risk assessment of synephrine. RIVM Report 2017-0069. 2017: 54 р. DOI: https://doi.org/10.21945/RIVM-2017-0069

17. Blumenthal M. Bitter orange peel and synephrine: Part 1 & Part 2. 2005: 28 p. URL: http://abc.herbalgram.org/site/DocServer/Bitter_Orange_Peel_and_Synephrine.pdf?docID=221

18. URL: https://rusada.ru/substances/prohibited-list/

19. ESCO report: Advice on the EFSA guidance document for the safety assessment of botanicals and botanical preparations intended for use as food supplements, based on real case studies. EFSA J. 2009; 7 (9): 280. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2009.280; URL: https://www.ncaa.org/sport-science-institute/topics/2020-21-ncaa-banned-substances

20. URL: https://www.nutraingredients.com/Article/2018/03/22/Dutch-authorities-call-for-legal-limits-on-synephrine-in-food-supplements

21. URL: https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/compliance-actions-and-activities/warning-letters

22. Costa J.G., Vidovic B., Saraiva N., do Céu Costa M., Del Favero G., Marko D., et al. Contaminants: a dark side of food supplements? Free Radic Res. 2019; 53 (Suppl 1): 1113-35. DOI: https://doi.org/10.1080/10715762.2019.1636045

23. EU-28: Exporting Food Supplements to the European Union. 2017. GAIN Report No. E17004.

24. Pawar R.S., Sagi S., Leontyev D. Analysis of bitter orange dietary supplements for natural or synthetic phenethylamines by LC-MS/MS. Drug Test Anal. 2020; 12: 1241-51. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.2871

25. Cohen P.A., Avula B., Venhuis B., Travis J.C., Wang Y.H., Khan I.A. Pharmaceutical doses of the banned stimulant oxilofrine found in dietary supplements sold in the USA. Drug Test Anal. 2017; 9 (1): 135-42. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.1976

26. Roman M.C., Betz J.M., Hildreth J. Determination of synephrine in bitter orange raw materials, extracts, and dietary supplements by liquid chromatography with ultraviolet detection: single-laboratory validation. J AOAC Int. 2007; 90 (1): 68-81.

27. Lorenzo C.D., Santos A.D., Colombo F., Moro E., Dell’Agli M., Restani P. Development and validation of HPLC method to measure active amines in plant food supplements containing Citrus aurantium L. Food Control. 2014; 46: 136-42. DOI: https://doi.org/10.1016/J.FOODCONT.2014.05.017

28. Putzbach K., Rimmer C.A., Sharpless K.E., Sander L.C. Determination of Bitter Orange alkaloids in dietary supplements standard reference materials by liquid chromatography with ultraviolet absorbance and fluorescence detection. J Chromatogr A. 2007; 1156 (1-2): 304-11. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.12.027.

29. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China 2010 (English edition). 2010.

30. Taiwan Herbal Pharmacopoeia. 2th edition (English version). 2016: 44-5.

31. Sander L.C., Putzbach K., Nelson B.C., Rimmer C.A., Bedner M., Thomas J.B., et al. Certification of standard reference materials containing bitter orange. Anal Bioanal Chem. 2008; 391 (6): 2023-34. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-008-2074-0

32. Schaneberg B.T., Khan I.A. Quantitative and qualitative HPLC analysis of thermogenic weight loss products. Pharmazie. 2004; 59 (11): 819-23.

33. Ohta I., Mizunuma S., Yasuda T., Ohsawa K. Determination of synephrine in oriental pharmaceutical decoctions containing Evodiae fructus by ion-pair high-performance liquid chromatography. Yakugaku Zasshi. 1994; 114 (1): 33-8 (in Japanese). DOI: https://doi.org/10.1248/yakushi1947.114.1_33

34. Evans R.L., Siitonen P.H. Determination of caffeine and symphatomimetic alkaloids in weight loss supplements by high performance liquid chromatography. J Chromatogr Sci. 2008; 46 (1): 61-7. DOI: https://doi.org/10.1093/chromsci/46.1.61

35. Wagner H., Püls S., Barghouti T., Staudinger A., Melchart D. Chromatographic fingerprint analysis of herbal medicines. Volume 5. Thin-Layer and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs. Springer, 2018: 43-4. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-319-67062-1

36. Kim J.H., Kwak B.M., Ahn J.H., Park J.-S. Simultaneous determination of synephrine and N-methyltyramine in orange fruit and juice from Korean market by UPLC-FLD. Korean J Food Sci Technol. 2014; 46 (3): 276-82. DOI: http://dx.doi.org/10.9721/KJFST.2014.46.3.276

37. Pryce K., Samuel D., Lagares E., Myrthil M., Bess F., Harris A., et al. Presence of octopamine and an octopamine receptor in Crassostrea virginica. In vivo (Brooklyn). 2015; 37 (1): 16-24.

38. Li Q., Huang C., Huang Y. Sensitive determination of synephrine by flow-injection chemiluminescence. Luminescence. 2006; 21 (1): 43-8. DOI: https://doi.org/10.1002/bio.881

39. Liu Y., Xu F., Zhang Z., Yang C., Song R., Tian Y. Analysis of synephrine in da-cheng-qi decoction by HPLC employing precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate. J Chromatogr Sci. 2009; 47 (10): 925-30. DOI: https://doi.org/10.1093/chromsci/47.10.925

40. Kobayashi Y., Yato M., Ito R., Saito K. Enantioselective determination of synephrine in health food products by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Chromatography. 2020; 41: 39-44. DOI: https://doi.org/10.15583/jpchrom.2019.024

41. Tang Q., Zhang R., Zhou J., Zhao K., Lu Y., Zheng Y., et al. The levels of bioactive ingredients in Citrus aurantium L. at different harvest periods and antioxidant effects on H2O2-induced RIN-m5F cells. J Sci Food Agric. 2021; 101 (4): 1479-90. DOI: https://doi.org/10.1002/jsfa.10761

42. Bai Y., Zheng Y., Pang W., Peng W., Wu H., Yao H., et al. Identification and comparison of constituents of Aurantii fructus and Aurantii fructus immaturus by UFLC-DAD-triple TOF-MS/MS. Molecules. 2018; 23 (4): 803. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules23040803

43. Shawky E. Determination of synephrine and octopamine in bitter orange peel by HPTLC with densitometry. J Chromatogr Sci. 2014; 52 (8): 899-904. DOI: https://doi.org/10.1093/chromsci/bmt113

44. Avula B., Upparapalli S.K., Khan I.A. Enantiomeric separation of adrenergic amines in Citrus species, related genera and dietary supplements by capillary electrophoresis. Chromatographia. 2005; 62 (3): 151-7. DOI: https://doi.org/10.1365/s10337-005-0598-4

45. Yi Y.N., Cheng X.M., Liu L.A., Hu G.Y., Wang Z.T., Deng Y.D., et al. Simultaneous determination of synephrine, arecoline, and norisoboldine in Chinese patent medicine Si-Mo-Tang oral liquid preparation by strong cation exchange high performance liquid chromatography. Pharm Biol. 2012; 50 (7): 832-8 DOI: https://doi.org/10.3109/13880209.2011.637505

46. Zhang Y., Jiao B. Simultaneous determination of six protoalkaloids in Chinese local varieties of loose-skin mandarins and sweet oranges by strong cation exchange-high performance liquid chromatography. Food Anal Methods. 2019; 12: 677-86. DOI: https://doi.org/10.1007/s12161-018-1401-0

47. URL: https://www.sielc.com/Application-HPLC-Separation-of-Octopamine-and-Synephrine-on-Primesep-200-column.html

48. Tanaka S., Sekiguchi M., Yamamoto A., Aizawa S.I., Sato K., Taga A., et al. Separation of synephrine enantiomers in citrus fruits by a reversed phase HPLC after chiral precolumn derivatization. Anal Sci. 2019; 35 (4): 407-12. DOI: https://doi.org/10.2116/analsci.18P441

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
РОСМЕДОБР 2021
Вскрытие
Медицина сегодня
Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии.

28-29 апреля 2022 г. в Екатеринбурге состоится IX Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии (ЕАКО). Свое название конференция получила неслучайно, ведь именно в городе, расположенном на границе Европы и Азии, раз в два года встречаются офтальмологи из разных регионов...

Актуальные вопросы нейроофтальмологии,

Уважаемые коллеги! 28 января 2022 года состоится XXI научно-практическая нейроофтальмологическая конференция " Актуальные вопросы нейроофтальмологии. Поражение зрительного нерва: взгляд офтальмолога, невролога, вирусолога-ифекциониста, нейрохирурга " Конференция посвящается...

Конгресс, посвященный Всемирному дню борьбы с ожирением.

В Москве пройдет Конгресс, посвященный Всемирному дню борьбы с ожирением, с международным участием С 28 февраля по 2 марта 2022 года пройдет научно-образовательное мероприятие для врачей - Конгресс, посвященный Всемирному дню борьбы с ожирением. Ожирение представляет одну из...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»