Интенсивность процессов окислительной модификации белков женского и коровьего молока

Резюме

Грудное молоко является источником всех эссенциальных компонентов питания, необходимых для полноценного роста и развития ребенка, поэтому необходимо постоянное изучать его состав и физико-химические свойства, чтобы адаптировать заменители женского молока. Адаптированные молочные смеси производят преимущественно из коровьего молока, приближая их нутриентный состав к женскому грудному молоку, адаптируя его в соответствии с потребностями детского организма. Однако технологические процессы производства молочных продуктов способствуют активации окислительных реакций, нарушению конформации белка.

Цель исследования - сравнить интенсивность образования карбонильных производных белков женского и коровьего молока при спонтанном и металл-катализированном окислении.

Материал и методы. Объектом исследования служили образцы зрелого молока здоровых кормящих матерей (n=12), в качестве сравнения использовали образцы молока питьевого ультрапастеризованного для детского питания (n=8). Интенсивность окислительной модификации белков молока определяли спектрофотометрически по реакции взаимодействия карбонильных производных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона в нативной пробе биологического материала и при индукции in vitro окисления белков по реакции Фентона добавлением растворов FeSO4 и пероксида водорода. Содержание небелковых сульфгидрильных групп определяли после осаждения белка спектрофотометрически с 5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой.

Результаты. По интенсивности спонтанного (базисного) окисления не выявлено значительных различий между показателями женского грудного и коровьего молока. Установлены существенные различия в содержании карбонильных производных аминокислотных остатков белков женского и коровьего молока при металл-катализируемом окислении. Инкубация с ионами железа в 1,5-2,5 раза повышает образование как альдегидных, так и кетоновых производных белков коровьего молока, регистрируемых в видимом и ультрафиолетовом спектре. В коровьем молоке при спонтанном окислении и при индукции окисления металлом процентное содержание альдегид-динитрофенилгидразонов ниже, чем в грудном молоке, и, наоборот, существенно выше доля кетон-динитрофенилгидразонов - поздних маркеров окислительной деструкции белков. Содержание небелковых сульфгидрильных групп в коровьем молоке в 2 раза меньше, чем в свежем женском молоке. Значительное превышение в коровьем молоке по сравнению с грудным содержания альдегид-динитрофенилгидразонов (в 2 раза) и кетон-динитрофенилгидразонов (в 2,6 раза) при металл-катализированном окислении белков указывает на более низкий уровень антиокислительных резервов коровьего молока. Подтверждением этого является сниженный уровень небелковых сульфгидрильных групп.

Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости повышения антиоксидантного статуса молочных продуктов для детского питания.

Ключевые слова:грудное молоко; коровье молоко; окислительная модификация белков; металл-катализированное окисление белков; карбонильные производные; сульфгидрильные группы

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Высокогорский В.Е., Соколова М.А., Антонов О.В.; сбор данных - Соколова М.А., Розенфельд Ю.Г., Комарова А.А.; статистическая обработка данных - Соколова М.А., Подольникова Ю.А.; написание текста - Соколова М.А., Высокогорский В.Е.; редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.

Для цитирования: Соколова М.А., Высокогорский В.Е., Розенфельд Ю.Г., Антонов О.В., Комарова А.А., Подольникова Ю.А. Интенсивность процессов окислительной модификации белков женского и коровьего молока // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 4. С. 83-89. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-4-83-89

Биологическая ценность и уникальность грудного молока для новорожденных общепризнана и не вызывает сомнений. В то же время довольно часто возникают ситуации, когда лактационная способность женщины нарушена или отсутствует. В результате эпидемиологического исследования установлено, что только 77% новорожденных находятся исключительно на грудном вскармливании, к 1-му месяцу жизни прекращают получать грудное молоко 25,2% детей, ко 2-му - 16,9%, к 3-му - 14,3%, к 4-му - 14,5%. К 3-му месяцу получали адаптированные молочные смеси 55% детей, к 4-му - 70% [1, 2]. Поскольку именно грудное молоко является источником всех эссенциальных компонентов питания, необходимых для полноценного роста и развития ребенка, необходимо постоянно изучать его состав и физико-химические свойства, чтобы адаптировать заменители женского молока [3, 4]. Адаптированные молочные смеси производят преимущественно из коровьего молока, приближая их нутриентный состав к женскому молоку, адаптируя его в соответствии с потребностями детского организма [5, 6]. Однако различные факторы (высокие температуры, свет, ионы металлов) при технологических процессах производства молочных продуктов способствуют активации окислительных реакций, нарушению конформации белка [7-9]. Свободные радикалы могут генерировать окислительные модификации, к которым особенно восприимчивы белки из-за их высокого содержания и реакционной чувствительности к окислителям [8]. Эти реакции способны приводить как к фрагментации белка, так и к агрегации посредством ковалентных поперечных связей или гидрофобных взаимодействий. По мнению P.A. Finot, такие изменения могут приводить к нарушению усвояемости белка, его биодоступности, снижению пищевой ценности с возможными неблагоприятными последствиями для роста и развития младенцев [10].

Основными участками модификации белка являются боковые цепи аминокислот. Особенно чувствительны к окислению серосодержащие аминокислоты: цистеин, метионин [8, 11]. Тепловое воздействие может привести к образованию агрегатов сывороточных белков молока, прежде всего β-лактоглобулина [12, 13]. Боковые цепи многих алифатических аминокислот, особенно аргинина, лизина, треонина и пролина, посредством необратимых процессов могут быть преобразованы в гидропероксиды, спирты и карбонилы, именно поэтому для оценки степени окисления белка используется количественное определение спиртов и карбонилов [8]. Карбонильные производные белков более стабильны, в отличие от продуктов пероксидного окисления липидов, и являются надежными маркерами окислительного стресса [14]. При исследовании уровня карбонилов и других продуктов окисления аминокислот установлены значительные модификации белков в процессе производства детских молочных смесей из коровьего молока [15].

Потерю белком каталитической активности и увеличение чувствительности к протеолитической деградации вызывает металл-катализируемое окисление (МКО) белков, которое приводит к дезаминированию отдельных аминокислотных остатков белков, превращению их в карбонильные производные. Увеличение содержания карбонильных производных при МКО белков указывает на истощение резервных возможностей биологической системы, поэтому сравнение уровня окислительной модификации белков женского молока и пастеризованного молока имеет важное значение для выбора направления адаптации детских молочных смесей с целью повышения их антиокислительных свойств.

Различные технологические факторы пастеризации коровьего молока оказывают существенное воздействие на его структуру и свойства как основного материала для изготовления молочных смесей. Высокие температуры вызывают разрушение полифенолов, в значительной степени определяющих антиокислительную активность молока [16], снижение антиокислительной активности подтверждается повышением интенсивности хемилюминесценции [17], активацией перекисного окисления липидов [18]. Однако наиболее надежным маркером оксидантного стресса, окислительных повреждений является уровень карбонильных производных белков. Особенности строения белковой молекулы позволяют считать их одной из основных ловушек активных форм кислорода, регистрация содержания карбонильных производных является наиболее распространенным методом анализа окислительной модификации белков [19]. Накопление активных карбонильных соединений приводит к развитию карбонилового стресса [20]. Уровень карбонильных производных белков оценивается по двум параметрам: в нативной пробе биологического материала и при индукции in vitro окисления белков по реакции Фентона добавлением растворов FeSO4 и пероксида водорода - МКО белков. МКО белков приводит к дезаминированию отдельных аминокислотных остатков белков, превращению их в карбонильные производные, потере белком каталитической активности и увеличению чувствительности к протеолитической деградации. Увеличение содержания карбонильных производных при МКО белков указывает на истощение резервных возможностей биологической системы, поэтому сравнение уровня окислительной модификации белков женского молока и пастеризованного молока имеет важное значение для выбора направления адаптации детских молочных смесей с целью повышения их антиоксидантных свойств.

В детских молочных смесях обнаружено повышенное содержание карбонилов, образование как восстанавливаемых (дисульфидных), так и невосстанавливаемых внутренних связей в белках, присутствие модифицированных аминокислот, значительного уровня рацемизированных (D-) аминокислот [15]. Поскольку для производства молочных смесей для детского питания используется чаще всего коровье молоко, представляется важным выяснить интенсивность процессов окислительной модификации белков пастеризованного молока коров.

Цель исследования - сравнить интенсивность образования карбонильных производных белков женского и коровьего молока при спонтанном и металл-катализированном окислении.

Материал и методы

Исследованы 12 образцов зрелого молока, взятого через 1-6 мес после родов у некурящих здоровых матерей, среднего возраста 28 лет, которые рожали в срок и кормили грудью своих детей начиная с первого дня после родов. Все участники были полностью проинформированы о процедуре и дали свое письменное добровольное информированное согласие на участие. Для сравнения проведен анализ 8 образцов коровьего молока питьевого ультрапастеризованного для детского питания "Тема" (ОАО "Юнимилк", Россия, ТУ 10.86.10-076-13605199), в 100 г содержится 3,2 г жира, 3,0 г белка. Расчет всех исследуемых показателей проведен на 1 мг белка.

Окислительную модификацию белков молока оценивали по методу A.Z. Reznick, L. Parker в модификации Е.Е. Дубининой и соавт. [20], основанному на реакции взаимодействия карбонильных производных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Спектры поглощения альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) регистрировали на спектрофотометре UNICO 2800 (United Products & Instruments, США).

Уровень карбонильных производных белков оценивается по двум параметрам: в нативной пробе биологического материала и при индукции in vitro окисления белков по реакции Фентона добавлением растворов FeSO4 и пероксида водорода - МКО белков.

После инкубации молока с 10 мМ раствором FeSO4 и 0,3 мМ H2O2 в течение 15 мин при 37 °С определяли интенсивность МКО белков для выявления резервных возможностей антиокислительной системы молока. Содержание АДНФГ определяли по оптической плотности в ультрафиолетовой части спектра при длинах волн 230, 254, 270, 280, 356 нм, а уровень КДНФГ - при 363 и 370 нм и в области видимого света для АДНФГ - при 428 и 430 нм и для КДНФГ - при 434, 524, 530, 535 нм. По полученным значениям экстинкций рассчитывали площадь под кривой, выраженной в условных единицах на 1 г белка, в соответствии с рекомендациями М.А. Фоминой и соавт., по способу комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях [21].

Содержание небелковых сульфгидрильных групп в коровьем и грудном молоке определяли по модифицированной методике Z. Chen и соавт. [15].

При оценке значимости полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез с применением программы Statistica 6. Проверку на соответствие выборок нормальному закону распределения проводили, используя критерий Шапиро-Уилка. В связи с отсутствием согласия данных с нормальным распределением на уровне значимости р<0,05, результаты представлены в виде медианы (Me) и диапазона между нижним (LQ, 25-й процентиль) и верхним (UQ, 75-й процентиль) квартилями. Различия между значениями показателей в сравниваемых группах оценивали с помощью непараметрического U-критерию Манна-Уитни для малых групп. Различия считали статистически значимыми при достигнутом уровне р<0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что интенсивность спонтанного (базисного) окисления не имеет значительных различий между показателями грудного и коровьего молока, оцениваемой как по АДНФГ, так и по КДНФГ. Однако соотношение между этими карбонильными производными имеет статистически значимые различия (табл. 1). Причем как в грудном, так и в коровьем молоке преобладают альдегидные производные над кетоновыми. Процентное соотношение АДНФГ в грудном молоке в 1,25 раза превышает данный показатель коровьего молока. В противоположность этому процентное содержание КДНФГ в грудном молоке в 2,4 раза ниже, чем в коровьем молоке.

Такое отличие процентного соотношения за счет увеличения вторичных карбонильных производных в результате спонтанного окисления может быть обусловлено накоплением кетоновых производных аминокислотных остатков при хранении, пастеризации, воздействии света и т.д. Поскольку накопление АДНФГ является ранним признаком окислительного повреждения белков, их значительное преобладание в грудном молоке характеризует, вероятно, начальный этап деструкции белковых молекул [22], а некоторое повышенное процентное содержание КДНФГ в коровьем молоке отражает развитие этих процессов при воздействии технологических факторов.

Существенные различия в содержании карбонильных производных аминокислотных остатков белков женского и коровьего молока установлены при индукции свободнорадикальных процессов ионами железа и пероксидом водорода по реакции Фентона. Значительно в большей степени добавление ионов железа вызывает образование как альдегидных, так и кетоновых производных белков коровьего молока, регистрируемых в видимом и ультрафиолетовом спектре, показатели которых превышают данные грудного молока в 1,5-2,5 раза (табл. 2).

Общий уровень карбонильных производных при МКО белков коровьего молока значительно больше в сравнении с данными грудного молока. Примечательно, что как при спонтанном, так и при индуцированном окислении преобладает содержание альдегидных производных белков и коровьего, и грудного молока, однако процентное соотношение различается. В коровьем молоке, как и при спонтанном окислении, в результате индукции окисления металлом процентное содержание АДНФГ ниже, чем в грудном молоке, и, наоборот, существенно выше доля КДНФГ - поздних маркеров окислительной деструкции белков [22], что подтверждает предположение о дополнительном развитии окислительных повреждений при пастеризации и воздействии других абиотических факторов. Индукция окислительных процессов за счет металл-катализируемой реакции происходит на ограниченном участке, стимулируя локальную окислительную деструкцию аминокислотных остатков [23]. Необратимое изменение структуры аминокислотных радикалов ароматических аминокислот с образованием карбонильных производных белков является причиной вторичного повреждения липидов и нуклеиновых кислот.

Для снижения интенсивности необратимой окислительной модификации белковых макромолекул возможно использование механизма защиты SH-групп белков посредством глутатионилирования. Так, показано, что сульфгидрильные группы цистеина могут быть защищены S-глутатионилированием [24]. Значимость глутатионового звена в антиоксидантной защите белков молока подтверждается нашими результатами определения уровня небелковых сульфгидрильных групп, основную долю которых составляет глутатион (табл. 3).

Содержание небелковых сульфгидрильных групп в коровьем молоке почти в 2 раза меньше, чем в свежем женском молоке, что может быть вызвано воздействием различных технологических факторов. При низком уровне сульфгидрильных групп в коровьем молоке наблюдается повышенное содержание всех фракций карбонильных производных белков при МКО в сравнении с данными грудного молока.

Заключение

Значительное превышение в коровьем молоке в сравнении с грудным содержания АДНФГ (в 2 раза) и КДНФГ (в 2,6 раза) при МКО белков свидетельствует о более низком уровне антиокислительных резервов коровьего молока. Подтверждением этого является сниженный уровень небелковых сульфгидрильных групп. Дезаминирование аминокислотных радикалов и образование карбонильных производных при МКО белков сопровождается потерей белком каталитической активности и увеличением чувствительности к протеолитической деградации [22]. Процессы карбонилирования аминокислот в пищевых белках чаще рассматриваются как негативные реакции, приводящие к нарушению функции белка, снижению усвояемости и потери пищевой ценности. Однако имеются указания на то, что последствия карбонилирования могут отличаться в зависимости от длительности и тяжести окислительных процессов [25]. Мягкое целенаправленное карбонилирование в конкретных белках может вызывать физиологические реакции для сохранения антиоксидантной защиты, активации оборота белка и вероятной модуляции иммунной системы. Массивное карбонилирование, вызывающее деградацию и агрегации белка, может блокировать оборот белка и вызывать тяжелые состояния [25]. Тем более важен вопрос о повышении антиоксидантного статуса молочных продуктов для детского питания [15]. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения связи процессов карбонилирования белков и качества молочных продуктов, путей предупреждения активации свободнорадикальных процессов, снижения интенсивности образования карбонильных производных в коровьем молоке, адаптации детских молочных смесей к грудному молоку.

Литература

1. Тутельян В.А., Батурин А.К., Конь И.Я., Кешабянц Э.Э., Старовойтов М.Л., Сафронова А.М. и др. Характер питания детей грудного и раннего возраста в Российской Федерации: практика введения прикорма // Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2009. Т. 88, № 6. С. 77-83.

2. Сибирякова Н.В., Чапрасова О.А., Каргина А.А., Абдурахимова П.М. Распространенность грудного вскармливания // CHRONOS: мультидисциплинарные науки. 2021. Т. 6, № 11 (61). С. 25-26.

3. Захарова И.Н., Мачнева Е.Б., Облогина И.С. Грудное молоко - живая ткань! Как сохранить грудное вскармливание? // Медицинский совет. 2017. № 19. С. 24-29. DOI: https://doi.org/10.21518/2079-701X-2017-19-24-29

4. WHO. Healthy Diet. Fact Sheet No. 394. Geneva : WHO, 2018.

5. Гаппаров М.М., Левачев М.М. Питание детей первого года жизни: взгляд нутрициолога // Вопросы питания. 2001. № 4. С. 23-27.

6. Верещагина Т.Г. Современные принципы адаптации детских молочных смесей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2009. № 4. С. 11-14. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/sovremennye-printsipy-adaptatsii-detskih-molochnyh-smesey

7. Gathercole J., Reis M.G., Agnew M. et al. Molecular modification associated with the heat treatment of bovine milk // Int. Dairy J. 2017. Vol. 73. Р. 74-83. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2017.05.008

8. Davies M.J. Protein oxidation and peroxidation // Biochem. J. 2016. Vol. 73, N 7. Р. 805-825. DOI: https://doi.org/10.1042/BJ20151227

9. Щербакова Ю.В. Влияние тепловой обработки на компоненты антиоксидантной системы молока и его интегральную антиоксидантную активность : автореф. дис. - канд. биол. наук. Москва, 2011.

10. Finot P.A. The absorption and metabolism of modified amino acids in processed foods // J. AOAC Int. 2005. Vol. 88, N 3. Р. 894-903. DOI: https://doi.org/10.1093/jaoac/88.3.894

11. Schoneich C. Sulfur radical-induced redox modifications in proteins: analysis and mechanistic aspects // Antioxid. Redox Signal. 2017. Vol. 26, N 8. Р. 388-405. DOI: https://doi.org/10.1089/ars.2016.6779

12. Kramer A.C., Thulstrup P.W., Lund M.N., Davies M.J. Key role of cysteine residues and sulfenic acids in thermal- and H2O2-mediated modification of beta-lactoglobulin // Free Radic. Biol. Med. 2016. Vol. 97. Р. 544-555. DOI: https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.07.010

13. Bielecka M., Cichosz G., Czeczot H. Antioxidant, antimicrobial and anticarcinogenic activities of bovine milk proteins and their hydrolysates - a review // Int. Dairy J. 2022. Vol. 127. Article ID 105208. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2021.105208

14. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D., Milzani A., Colombo R. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress // Clin. Chim. Acta. 2003. Vol. 329. P. 23-38. DOI: https://doi.org/10.1016/S0009-8981(03)00003-2

15. Chen Z., Leinisch F., Greco I., Zhang W., Shu N., Chuang Ch. Y. et al. Characterisation and quantification of protein oxidative modifications and amino acid racemisation in powdered infant milk formula // Free Radic. Res. 2019. Vol. 53, N 1. P. 68-81. DOI: https://doi.org/10.1080/10715762.2018.1554250

16. Шидловская В.П., Юрова Е.А. Антиоксидантная активность ферментов// Молочная промышленность. 2011. № 12. С. 48-49.

17. Высокогорский В.Е., Игнатьева Г.В. Хемилюминесцентный анализ пастеризованного молока // Пищевая промышленность. 2012. № 10. С. 34-36.

18. Высокогорский В.Е., Веселов П.В. Оценка антиокислительных свойств козьего и коровьего молока // Вопросы питания. 2010. Т. 79, № 1. С. 56-58.

19. Cai W., Gao Q.D., Zhu L., Peppa M., He C., Vlassara H. Oxidative stress-inducing carbonyl compounds from common foods: novel mediators of cellular dysfunction // Mol. Med. 2002. Vol. 8, N 7. P. 337-346. DOI: https://doi.org/10.1007/BF03402014

20. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов Г.Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии. 1995. Т. 41, № 1. С. 24-26.

21. Фомина М.А., Абаленихина Ю.В. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях : методические рекомендации / ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава. Рязань : РИО РязГМУ, 2014. 60 с.

22. Шахристова Е.В. Степовая Е.А., Иванов В.В., Носарева О.Л., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Окислительная модификация белков и система глутатиона в адипоцитах при сахарном диабете// Бюллетень сибирской медицины. 2014. Т. 13, № 3. С. 84-90.

23. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. Санкт-Петербург : Медицинская пресса, 2006. 400 с. ISBN 5-85474-072-9.

24. Kehm R., Baldensperger T., Raupbach J., Höhn A. Protein oxidation-formation mechanisms, detection and relevance as biomarkers in human diseases // Redox Biol. 2021. Vol. 42. Article ID 101901. DOI: https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.101901

25. Estévez M., Díaz-Velasco S., Martínez R. Protein carbonylation in food and nutrition: a concise update // Amino Acids. 2022. Vol. 54. Р. 559-573. DOI: https://doi.org/10.1007/s00726-021-03085-6

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Вскрытие
Медицина сегодня
Съезд хирургов ФМБА России

Съезд хирургов ФМБА России " Высокотехнологичная медицинская помощь: концепция безопасности и единого хирургического пространства " 14-15 октября 2022 года, г. Санкт-Петербург Впервые в истории хирургическая безопасность будет изучена столь подробно! Отныне "S afe surgery "...

Председатель организационного комитета 17-го Национального конгресса терапевтов - министр здравоохранения Российской Федерации - Михаил Альбертович Мурашко

Председатель организационного комитета 17-го Национального конгресса терапевтов - министр здравоохранения Российской Федерации - Михаил Альбертович Мурашко В программе конгресса запланированы более 150 образовательных секций, симпозиумов, клинических разборов, мастер-классов...

Представляем оргкомитет 17-го Национального конгресса терапевтов

Уважаемые коллеги! Представляем оргкомитет 17-го Национального конгресса терапевтов (с международным участием) , который состоится 12-14 октября в МВЦ "Крокус Экспо" (павильон 3, Зал 20, г. Москва). · Президент Российского научного медицинского общества терапевтов,...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»