Влияние сочетанного недостатка витаминов D, группы В, кальция и магния в рационе крыс на обеспеченность микронутриентами и биохимические показатели плазмы крови

Резюме

Сочетанный недостаток витаминов D, группы В, кальция и магния характерен для рациона российского населения. Ранее было показано, что устранение дефицита витаминов группы В является необходимым условием реализации витамином D своих биологических функций.

Цель исследования - изучить влияние сочетанного недостатка витаминов D и группы B, кальция и магния в рационе крыс на биомаркеры микронутриентной обеспеченности и биохимические показатели плазмы крови.

Материал и методы. Крысы-самцы Wistar с исходной массой тела 66±1 г были разделены на 5 групп: 1-ю - контрольную (К) составили животные, которые в течение 28 сут получали полусинтетический рацион (ПР), а у крыс 4 опытных групп в течение 23 сут вызывали сочетанный недостаток витаминов D и группы В, кальция и магния, уменьшая в 5 раз содержание витаминов в витаминной смеси и в 2 раза - минеральных веществ в солевой смеси ПР. В течение последующих 5 сут проводили восполнение рационов: у животных 2-й группы (+В+D+Ca+Mg) по уровню всех микронутриентов, 3-й группы (-В+D+Ca+Mg) - по содержанию витамина D, кальция и магния, 4-й группы (+В+D-Ca-Mg) - по уровню витаминов; рацион 5-й группы (-В-D-Ca-Mg) не восполняли. Витамины В1 и В2 в печени, головном мозге и моче, рибофлавин в плазме крови и 4-пиридоксиловую кислоту в моче определяли флуориметрическими методами, концентрацию 25(ОН)D в плазме крови - иммуноферментным методом, концентрацию витаминов А и Е в плазме крови, печени и головном мозге крыс - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, биохимические показатели крови - на биохимическом анализаторе.

Результаты. У крыс 5-й группы с дефицитом всех микронутриентов (-В-D-Ca-Mg) отмечалось повышение в плазме крови концентрации железа в 3,4 раза (p<0,05), активности щелочной фосфатазы - в 1,7 раза (p<0,10), снижение в 1,8 раза (p<0,05) активности аланинаминотрансферазы на фоне повышения уровня α-токоферола в плазме крови на 26,7% (p<0,05) и в печени в 2,0 раза (p<0,05) относительно показателей контрольных животных, не прошедших стадию дефицита микронутриентов (К), или после ликвидации дефицита (+В+D+Ca+Mg). Недостаток в рационе витаминов группы В, сохраняющийся в ходе коррекции дефицита витамина D, кальция и магния в рационе крыс 3-й группы (-В+D+Ca+Mg), тормозил возврат повышенного уровня глюкозы, железа, триглицеридов, общего холестерина, α-токоферола, повышенной активности щелочной фосфатазы и сниженной активности АЛТ до уровня у животных контрольной группы и/или получавших восполненный по всем недостающим микронутриентам рацион (+В+D+Ca+Mg).

Заключение. Сочетанный дефицит нескольких микронутриентов приводил к изменению биохимических показателей крови. Сниженное поступление кальция и магния в ходе коррекции недостатка в рационе витаминов D и группы В может оказывать негативное влияние на обеспеченность организма витамином B2. Даже при нормальном содержании витамина Е в рационе сочетанный дефицит нескольких других микронутриентов оказывал влияние на обмен этого витамина (повышение уровня витамина Е в печени и плазме крови животных). Хронический сочетанный алиментарный дефицит витаминов группы В, кальция и магния, являющийся характерным для рациона российского населения, снижает биодоступность витамина D, что обосновывает целесообразность применения витаминно-минеральных комплексов.

Ключевые слова:витамин D; витамины группы В; кальций; магний; сочетанный недостаток; коррекция витаминно-минерального статуса; плазма крови; печень; головной мозг; крысы

Финансирование. Научно-исследовательская работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема № FGMF-2022-0002).

Конфликт интересов. Вржесинская О.А. является научным редактором и ответственным секретарем редакции журнала "Вопросы питания", остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Бекетова Н.А., Кошелева О.В., Вржесинская О.А., Коденцова В.М., постановка эксперимента, сбор и обработка материала - Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Гусева Г.В., Кошелева О.В., Леоненко С.Н., Сокольников А.А., Зорин С.Н., статистическая обработка и написание текста - Бекетова Н.А., редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.

Для цитирования: Бекетова Н.А., Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Кошелева О.В., Сокольников А.А., Гусева Г.В., Леоненко С.Н., Зорин С.Н., Жилинская Н.В. Влияние сочетанного недостатка витаминов D, группы В, кальция и магния в рационе крыс на обеспеченность микронутриентами и биохимические показатели плазмы крови // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 6. С. 37-49. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-37-49

По данным эпидемиологических исследований, рацион питания российского населения, включая детское, характеризуется сниженным содержанием ряда эссенциальных микронутриентов: в основном витаминов D и группы В, а также минеральных веществ - кальция и магния [1-4]. Так, по результатам выборочного наблюдения (2018 г.) среднее суточное потребление кальция и магния, витаминов В2 и ниацина лицами в возрасте 14-19 лет (женщины, имеющие детей до 3 лет), составило соответственно 31-62 и 51-71%, 49-68 и 53-78% от рекомендуемого [1]. Ограниченное потребление морской рыбы жирных сортов, являющейся важным источником витамина D, низкая эффективность его эндогенного синтеза из-за недостаточной инсоляции обусловливают сниженную обеспеченность этим витамином, выявляемую у 50-92% взрослого населения трудоспособного возраста и у детей [2-4].

Как известно, основной функцией витамина D является поддержание постоянной концентрации кальция и фосфора в крови. Однако недостаток витамина D связан не только с изменением обмена кальция и фосфора, приводящим к нарушению ремоделирования костной ткани, но и ассоциируется с повышением риска развития онкологических, сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний, эндокринных нарушений, а также тяжести течения коронавирусной инфекции COVID-19 [3, 5, 6]. Экстраскелетные эффекты витамина D реализуются его активным метаболитом 1,25(OH)2D (кальцитриол) - стероидным гормоном, который контролирует гены, участвующие в пролиферации клеток, дифференцировке тканей, ангиогенезе и воспалении [7].

Как показали исследования [8, 9], в образовании как транспортной [25(OH)D], так и гормональных форм [1,25(OH)2D] витамина D существенная роль принадлежит микронутриентам, в том числе витаминам группы В (В2, В6), необходимым для ферментативного гидроксилирования холекальциферола, осуществляемого под действием 25-гидроксилазы (CYP27A1) и 1-α-гидроксилазы (CYP27B1). К снижению концентрации гидроксилированных активных метаболитов витамина D также приводит дефицит магния, который действует как кофактор в ферментативных реакциях метаболизма в печени и почках [10, 11]. Магний-зависимые белки митохондрий участвуют в метаболизме витаминов B2, PP, B5 и миоинозита [12]. В экспериментах на крысах показано, что недостаточное потребление кальция, магния и йода может нарушать не только минеральный, но и витаминный статус организма [13].

Несмотря на имеющиеся свидетельства метаболической взаимозависимости микронутриентов в организме, некоторые рекомендации по профилактике дефицита витамина D предусматривают только прием его повышенных доз (1000-2000 МЕ/сут) отдельно или в сочетании с кальцием (500 мг/сут) [14, 15]. При этом не учитывается важность оптимизации обеспеченности организма другими микронутриентами, участвующими в образовании гормонально-активной формы витамина D.

Цель исследования - изучение в эксперименте in vivo влияния сочетанного недостатка витаминов D, группы B, кальция и магния в рационе крыс на биомаркеры микронутриентной обеспеченности организма и биохимические показатели плазмы крови.

Материал и методы

Экспериментальные животные - крысы-самцы стока Wistar с исходной массой тела 40-50 г - были получены из питомника лабораторных животных Филиала "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Исследования на животных выполняли в соответствии с требованиями ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами". Протокол исследования был утвержден комитетом по этике ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии".

Животных содержали по 2 особи в прозрачных клетках из поликарбоната в контролируемых условиях окружающей среды (температура 20-24 °C, относительная влажность 45-65%, в режиме освещения 12/12 ч) на подстилке из сосновых опилок. Животные получали корм ad libitum и имели свободный доступ к дистиллированной воде.

В течение 5 сут карантина все животные (n=43) получали полноценный полусинтетический рацион (ППР), содержащий 20% казеина пищевого кислотного, 63% кукурузного крахмала, 4,5% масла подсолнечного рафинированного дезодорированного, 4,5% лярда, 3,5% стандартной солевой смеси, 2% микрокристаллической целлюлозы, 1% сухой витаминной смеси, 0,30% L-цистеина, 0,25% холина битартрата и 0,95% сахарозы. Уровень всех витаминов и минеральных веществ в витаминной и солевой смесях ППР соответствовал адекватному (100% АУП) для растущих крыс [16].

По окончании карантина крысы были рандомизированно по массе тела (66±1 г) разделены на 2 группы (см. рисунок): контрольную, животные которой на протяжении всего эксперимента (28 сут) содержались на ППР (1-я группа - К; n=9), и исходную опытную, в которую были включены остальные крысы (n=34), получавшие в течение 23 сут корм с уменьшенным в 5 раз содержанием в витаминной смеси витамина D (холекальциферола) и всех витаминов группы В, а также сниженным в 2 раза по сравнению с таковым в ППР уровнем кальция и магния в солевой смеси.

По окончании I этапа (создание сочетанного микронутриентного дефицита) животные исходной опытной группы были рандомизированно по массе тела (198±4 г) распределены на подгруппы (далее - 2-5-я опытные группы). Рацион крыс 2-й группы (+B+D+Ca+Mg) был восполнен по уровню витамина D, всех недостающих витаминов группы В и минеральных веществ до 100% от такового в витаминной и солевой смесях ППР; 3-й группы (-В+D+Ca+Mg) - по содержанию витамина D и минеральных веществ на фоне продолжающегося дефицита всех витаминов группы В; рацион 4-й группы (+В+D-Ca-Mg) был скорректирован только по уровню витаминов D и группы В при сохранении недостатка кальция и магния; крысы 5-й группы (-В-D-Ca-Mg) продолжили получать дефицитный по микронутриентам корм.

Содержание кальция и магния в казеине составило соответственно 769 и 2,1 мг/100 г, а в дистиллированной воде, используемой для приготовления рационов и питья животных, - 2,0 и 0,094 мг/л. С учетом вклада казеина содержание кальция и магния в расчете на 100 г сухого ППР составило соответственно 655 и 51 мг, а в "дефицитном" по минеральным веществам рационе - 61,8 и 50,6% от такового в ППР. Дополнительный вклад в поступление кальция и магния за счет дистиллированной воды (около 10 мл/сут на крысу) был незначительным, поскольку не превысил 0,1% от суммарного потребления этих микронутриентов с дефицитным кормом.

Учитывая, что в среднем содержание фосфора в казеине составляет 900 мг/100 г [17], или 1,8 г в расчете на 1 кг корма крыс (54% от суммарного поступления фосфора с рационом), расчетное молярное соотношение кальция и фосфора в ППР и в дефицитном по минеральным веществам корме составило примерно 1,5 (1-3-я группы) и 0,9 (4-5-я группы).

В ходе эксперимента средневзвешенная масса корма в расчете на 1 крысу составила 14,4±0,6 г/сут.

Сбор мочи за 18 ч проводили на 27-е сутки эксперимента, помещая крыс в индивидуальные метаболические клетки, лишая животных пищи и предоставляя дистиллированную воду без ограничения.

Предварительно анестезированных эфиром крыс выводили из эксперимента декапитацией. Собранную с гепарином после декапитации животного кровь центрифугировали в течение 15 мин при 500 g, отбирали плазму и хранили при температуре -20 °С. Выделенные органы (печень и целый головной мозг) взвешивали, замораживали, а после лиофилизации измельчали и хранили до анализа при -20 °С.

Витамины В1 и В2 в органах и моче, рибофлавин в плазме крови, а также 4-пиридоксиловую кислоту (4-ПК) в моче определяли флуориметрически [18, 19], ретинол, пальмитат ретинола (витамин А) и α-токоферол (витамин Е) в плазме крови и органах крыс - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [18, 20]. В плазме крови определяли концентрацию 25(ОН)D и остеокальцин иммуноферментным методом с использованием наборов 25-Hydroxy Vitamin D EIA и Rat-MID Osteocalcin EIA (Immunodiagnostic Systems Ltd, Великобритания); биохимические показатели крови и мочи - на биохимическом анализаторе KoneLab 200i (Thermo Scientific, Финляндия).

Статистическую обработку данных проводили с помощью SPSS Statistics 20.0 (IBM, США). Для характеристики вариационного ряда рассчитывали среднее арифметическое (M) и стандартную ошибку среднего (m). Статистическую значимость различий выборок рассчитывали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни для независимых переменных. Различия считали статистически значимыми при р≤0,05, на уровне тенденции - при 0,05<p<0,10.

Результаты

В ходе эксперимента общее состояние всех животных, внешний вид и поведение при осмотре были удовлетворительными. Пребывание в течение 23 сут на дефицитном рационе сопровождалось тенденцией к снижению массы тела крыс на 6,6% (р=0,056) относительно животных контрольной группы (212±4 г). На 28-е сутки у крыс 3, 4 и 5-й опытных групп, в корме которых сохранялся какой-либо вариант недостатка микронутриентов, масса тела оказалась статистически значимо ниже показателя в контроле соответственно на 8,2 (р=0,015), 10,9 (р=0,020) и 7,0% (р=0,019), что косвенно свидетельствовало о развитии алиментарного дефицита. Лишь у животных, получавших в ходе коррекции дефицита полностью восполненный рацион (2-я группа), масса тела восстановилась до таковой в контрольной группе (256±3 г).

Абсолютные массы печени и целого головного мозга крыс контрольной и всех опытных групп статистически значимо не различались (р>0,05), составив в среднем 8,4±2,0 и 1,71±0,03 г.

Биохимические показатели плазмы крови

Как видно из данных табл. 1, на фоне алиментарного дефицита витаминов и минеральных веществ в плазме крови крыс дефицитной 5-й группы концентрация железа и активность витамин D-зависимой щелочной фосфатазы (ЩФ) оказались статистически значимо выше в 3,4 и 1,7 раза соответствующих показателей контроля; активность витамин В6-зависимой аланинаминотрансферазы (АЛТ) была достоверно ниже в 1,8 раза таковой в контрольной группе, концентрация мочевой кислоты была меньше в 1,5 раза показателя животных 4-й группы (р≤0,05) при отсутствии достоверных различий у последних с уровнем мочевой кислоты в контроле. Уровни биомаркеров липидного обмена - общего холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ) - у крыс этой группы превысили таковые в контрольной группе на 12%, однако различие не было статистически значимым (р>0,10). При этом следует отметить, что колебания этих показателей не выходили за пределы физиологической нормы, за исключением концентрации железа, превысившей верхнюю границу нормы [21].

Биохимические показатели плазмы крови животных после восполнения рациона по всем дефицитным микронутриентам (2-я группа) полностью восстановились и статистически значимо не отличались от таковых в контрольной группе, за исключением сниженной на 4,7% концентрации кальция (см. табл. 1).

У крыс 3-й группы, на фоне дефицита всех витаминов группы В, концентрация в плазме крови ТГ и ХС превысила показатели в контроле соответственно на 29,3 и 10,5%, глюкозы - на 15,3%; как и у животных дефицитной 5-й группы отмечалось, хотя и выраженное в меньшей степени, повышение относительно контроля уровня железа, активности ЩФ и снижение активности АЛТ.

При сохранении недостатка кальция и магния в корме, восполненном по содержанию витаминов D и группы В, концентрация мочевины (биомаркер катаболизма белка) в плазме крови животных 4-й группы была статистически значимо ниже на 17,6%, магния - на 10,6%, а содержание железа было выше в 1,9 раза соответствующих показателей контрольной группы, находясь в рамках физиологических колебаний [21].

Концентрация в плазме крови крыс всех опытных групп лактатдегидрогеназы, общего белка, остеокальцина, фосфора не отличалась от таковых в контроле, составивших соответственно: 1000±66 МЕ/л, 63,0±1,4 г/л, 2,86±0,10 мМ, 1059±53 нг/мл (в табл. 1 не показаны).

Таким образом, сочетанный дефицит нескольких микронутриентов приводил к изменению биохимических показателей крови, а добавление в корм всех недостающих микронутриентов восстанавливало нарушенные показатели.

Витамин D

Согласно данным табл. 2, у крыс дефицитной 5-й группы концентрация в плазме крови транспортной формы витамина D - 25(ОН)D - была статистически значимо в 2,4 раза ниже показателя животных контрольной группы, что свидетельствовало о развитии у них выраженного дефицита этого витамина.

После пребывания животных опытных групп на дефицитном рационе с последующим полным (2-я группа) или неполным (3-я и 4-я группы) восполнением этого дефицита уровень 25(ОН)D в плазме крови хотя и превысил показатель 5-й группы в 1,8-1,9 раза (р<0,01), однако оказался статистически значимо ниже уровня этого биомаркера в контроле соответственно на 22,5 (р=0,012), 26,5 (р=0,008) и 23,3% (р=0,038); причем различия между показателями опытных 2-4-й групп отсутствовали (р>0,05). Таким образом, полного устранения недостатка витамина D в течение 5 сут не произошло.

Витамины группы В

У крыс 5-й группы к концу эксперимента (на 28-е сутки) развился алиментарный дефицит витаминов группы В, о чем свидетельствовали сниженные относительно контроля (1-я группа) показатели: концентрация рибофлавина в плазме крови в 2,2 раза, экскреция тиамина, рибофлавина и 4-ПК с мочой соответственно в 3,0, 25,1 и 3,1 раза (см. табл. 2), содержание витаминов В1 и В2 в печени в 4,3 и 1,5 раза, уровня витамина В1 в целом мозге на 30,8% (табл. 3).

У животных 2-й группы после восполнения недостатка микронутриентов в корме до адекватного уровня концентрация рибофлавина в плазме крови, содержание витамина В2 в печени (см. табл. 2 и 3), а также витамина В1 в целом головном мозге (см. табл. 3) не отличалось от такового у крыс контрольной группы (р>0,05). В то же время другие биомаркеры обеспеченности витаминами группы В у этих животных оказались сниженными: экскреция с мочой рибофлавина, тиамина и 4-ПК была статистически значимо меньше в 1,7, 2,4 и 1,5 раза, а содержание витамина В1 в печени - в 1,8 раза относительно соответствующего показателя крыс, получавших полноценный рацион. Таким образом, полной ликвидации недостатка витаминов группы В в течение 5 сут также не произошло.

У животных 3-й группы сохранение дефицита витаминов группы В (20% АУП) в корме, восполненном на II этапе эксперимента по содержанию витамина D, кальция и магния до 100% от АУП, подтверждалось ожидаемо сниженными показателями обеспеченности витаминами группы В относительно таковых у животных, как получавших адекватное количество витаминов группы В постоянно (1-я группа), так и в ходе полного восполнения рациона (2-я группа). Так, у крыс 3-й группы уровень биомаркеров В-витаминного статуса был статистически значимо ниже соответствующих показателей крыс в 1-й и 2-й группах: концентрация рибофлавина в плазме крови - в 2,3-2,4 раза, содержание этого витамина в печени - в 1,4 и 1,3 раза, его экскреция с мочой - в 44,0 и 26,6 раза; содержание тиамина в печени - в 5,8 и 3,3 раза, в головном мозге - на 25,0 и на 22,0%, его экскреция с мочой - в 4,4 и 1,8 раза; экскреция с мочой 4-ПК - в 4,2 и 2,9 раза.

Показатели обеспеченности витаминами группы В животных, рацион которых был восполнен по содержанию витаминов на фоне алиментарного недостатка кальция и магния (4-я группа), не отличались от таковых у крыс, получавших восполненный и по этим макроэлементам корм (2-я группа).

Витамины А и Е

Дефицит изученных микронутриентов в рационе и его последующая коррекция не оказывали влияния на биомаркеры обеспеченности витамином А в плазме крови и в печени; исключением была тенденция снижения содержания пальмитата ретинола в печени животных дефицитной 5-й группы на 30,1% (р=0,052) относительно показателя у крыс 2-й группы (см. табл. 2 и 3).

На фоне сочетанного дефицита в рационе микронутриентов содержание α-токоферола в плазме крови крыс 5-й группы было статистически значимо выше на 26,7% такового у животных 2-й группы (см. табл. 2), а в печени - в 2,0 раза выше показателя в контроле (см. табл. 3). У крыс 3-й группы, в корме которых на II этапе эксперимента сохранялся дефицит витаминов группы В, концентрация α-токоферола в плазме крови была статистически значимо выше на 27,7% показателя животных 2-й группы, получавших в ходе коррекции полноценный рацион, достоверно не отличаясь от показателя дефицитных животных 5-й группы. У крыс опытных 2-4-й групп, после восполнения рациона витамином D уровни витамина Е в печени статистически значимо не отличались от такового в контрольной группе. При полном восполнении сочетанного недостатка микронутриентов в рационе содержание α-токоферола в плазме крови, печени и мозге крыс 2-й группы не отличалось от соответствующих показателей в контрольной группе (см. табл. 2 и 3).

Примечательно, что на фоне сочетанного дефицита кальция и магния в рационе (4-я группа) коррекция дефицита витамина D при адекватном поступлении витаминов группы В сопровождалась статистически значимым повышением содержания α-токоферола в головном мозге на 31,9% (р=0,014) относительно такового во 2-й группе, а также на 20,0% (р=0,052) по сравнению с показателем в контроле, но не отражалось на уровне этого витамина в плазме крови и в печени.

Таким образом, даже при нормальном содержании витаминов А и Е в рационе сочетанный дефицит нескольких других микронутриентов оказывал влияние на обмен этих витаминов.

Обсуждение

Биохимические показатели плазмы крови

В рационах крыс 4-й и 5-й групп имелось неблагоприятное снижение в 1,7 раза соотношения кальция и фосфора относительно таковой величины в корме животных остальных групп. Ранее экспериментально было показано, что при молярном соотношении в рационе кальция и фосфора ниже 1,3 у крыс-самок в течение

6 нед развивается нефрокальциноз [16]. Напротив, у крыс-самцов при неоптимальном соотношении в корме кальция и фосфора (<1,3), даже на фоне дефицита магния, самостоятельно индуцирующего нефрокальциноз, патологические изменения в почках наблюдались лишь при содержании в корме фосфора более 5 г/кг [22]. В нашем эксперименте уровень фосфора в корме крыс-самцов всех групп, в том числе 4-й и 5-й групп, составлял около 3 г/кг; следовательно, развитие нефрокальциноза у животных на фоне недостатка в корме кальция и магния в течение 4 нед маловероятно. Однако, как видно из табл. 1, у животных дефицитной 5-й группы активность в плазме крови ЩФ превысила в 1,7 раза показатель контрольной группы. Согласно данным литературы повышенная активность в плазме крови ЩФ, наряду с дефицитом витамина
D, является прокальцифицирующим фактором; причем при адекватном потреблении витамина D повышенная активность ЩФ снижается [23, 24]. Действительно, у крыс, получавших в ходе коррекции рацион, восполненный по содержанию витамина D (2-я и 4-я опытные группы), активность ЩФ не отличалась от таковой в контрольной группе. В то же время коррекция дефицита витамина D на фоне сохраняющегося недостатка витаминов группы В (3-я группа) не позволило нормализовать активность ЩФ до таковой в контроле. Примечательно, что недостаток витаминов группы В в рационе крыс в ходе коррекции дефицита витамина D на фоне адекватного содержания в рационе кальция и магния не влиял на активность ЩФ [25]; это свидетельствует о принципиальном отличии используемой нами экспериментальной модели от предыдущего опыта [25], проведенного на фоне адекватного поступления кальция и магния, и, таким образом, в меньшей степени отражающего реальное состояние сочетанной витаминно-минеральной недостаточности у российского населения.

По данным табл. 1, дефицит витаминов группы В в корме, восполненном по содержанию витамина D, кальция и магния до адекватного уровня (3-я группа) в течение 5 сут, не позволил нормализовать повышенный уровень глюкозы, ХС и ТГ в плазме крови крыс (также имевший место у животных дефицитной 5-й группы, однако не достигший уровня значимости вследствие значительного колебания индивидуальных данных) до показателей в контроле. Сходный эффект отмечался в предыдущем эксперименте: пребывание дефицитных по витаминам D и группы В крыс на рационе, восполненном только по содержанию витамина D до адекватного уровня, сопровождалось повышением концентрации глюкозы на 15,0% (р<0,05), ХС и холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) - на 14,7 и 15,9% (р<0,10) от таковой у животных, получавших корм, полноценный по содержанию всех витаминов [25]. В целом результаты накапливающихся исследований свидетельствуют о синергетическом участии витаминов группы В в поддержании регулирующей роли витамина D в обмене углеводов и липидов.

Отмечаемое некоторое повышение гликемии, по-видимому, объясняется известным нарушением при дефиците витамина D секреции инсулина, регулирующего гомеостаз глюкозы [4, 26], а также эффектом дефицита витаминов группы В [25]. Биологический механизм влияния витамина D на метаболизм липидов к настоящему времени до конца не выяснен, однако эпидемиологические исследования, в том числе и у детского населения, не страдающего ожирением, указывают на обратную связь между концентрацией в сыворотке крови 25(ОН)D и уровнем липидов - ХС и ТГ [4, 27, 28]. Данные о влиянии дефицита витаминов группы В на липидный обмен противоречивы. Так, экспериментально было показано, что полное исключение из витаминной смеси рациона крыс витаминов В1, В2, В6 сопровождалось снижением концентрации в плазме крови ХС и холестерина ЛПВП и повышением концентрации холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) [29]; у крыс с дефицитом рибофлавина уровни ХС и ТГ были снижены в плазме крови и увеличены в печени [30]. Однако у практически здоровых лиц и пациентов выявлялась обратная связь концентрации в сыворотке крови витамина В12 с уровнем ХС, холестерина ЛПНП и ТГ [31, 32].

Недостаток кальция и магния в рационе, восполненном по содержанию витаминов (4-я группа), не оказывал влияния на диагностически значимые биомаркеры нарушения липидного обмена (см. табл. 1). Полученный результат не согласуется с имеющимися в литературе данными о статистически значимом повышении уровня ТГ, ЛПНП, ХС, аполипопротеина В и снижении концентрации ЛПВП у крыс, содержавшихся в условиях алиментарного дефицита магния в течение 7 нед [33], что, по-видимому, связано с тем, что в нашем эксперименте проводилось не полное исключение микронутриента из солевой смеси, а лишь сокращение его количества в 2 раза по сравнению с контролем.

Выраженное повышение концентрации железа в плазме крови крыс, отмечаемое при сочетанном витаминно-минеральном дефиците (5-я группа), и в несколько меньшей степени - в ходе коррекции дефицита витамина D в условиях сохраняющегося недостатка витаминов группы В (3-я группа), а также кальция и магния (4-я группа), согласуется как с ранее полученными собственными результатами по изучению влияния на биохимические показатели одновременного дефицита всех 13 витаминов [34] или только витаминов группы В [25], так и с данными других авторов, отмечавших накопление железа в печени крыс при дефиците витамина В6 [35]. Кроме того, у крыс, получавших корм с сочетанным дефицитом 13 витаминов, отмечалось повышение уровня малонового диальдегида в плазме крови примерно на 15%, в печени - в 2,4 раза [34], что, по-видимому, было связано с усиленным образованием при избытке железа активных форм кислорода, участвующих в развитии окислительного стресса [36]. В целом полученные данные свидетельствуют о том, что хронический дефицит витаминов группы В, так же как и недостаток кальция и магния, сохраняющиеся при восполнении дефицита только витамина D, замедляют восстановление повышенного уровня железа в плазме крови, который, по-видимому, отражает нарушение гомеостаза железа.

В эксперименте не удалось выявить влияния сочетанного дефицита витаминов D и группы В, кальция и магния на уровень в плазме крови витамин D-зависимого белка - остеокальцина: статистически значимые различия по этому показателю у животных 5-й и контрольной групп отсутствовали. Кроме того, наши результаты не согласуются с ранее полученными данными о снижении концентрации остеокальцина в плазме крови крыс на фоне дефицита витаминов группы В [25]. Данное противоречие, по-видимому, объясняется связью между содержанием остеокальцина и уровнем 25(ОН)D при более глубоком дефиците витамина D: концентрация 25(ОН)D в плазме крови крыс опытной и контрольной групп, находясь в диапазоне 8-10 нг/мл [25], была ниже таковой в нашем исследовании (см. табл. 2).

Витамин D

Результаты ранее проведенного эксперимента свидетельствуют, что при адекватном содержании кальция и магния в рационе концентрация 25(ОН)D в плазме крови животных в результате коррекции дефицита витамина D на фоне адекватного поступления витаминов группы В восстанавливалась до нормального уровня; при этом биомаркеры обеспеченности витаминами В1, В2 и В6 в плазме крови, в моче и в печени также не отличались от соответствующих показателей у животных, получавших полноценный рацион [25]. Результаты, полученные в нашем эксперименте (см. табл. 2 и 3), отличаются от ранее описанных данных, согласно которым при полном восполнении рациона по всем дефицитным микронутриентам в течение сопоставимого промежутка времени не удалось полностью ликвидировать недостаток витаминов группы В: экскреция тиамина, рибофлавина, 4-ПК, содержание витамина В1 в печени крыс остались статистически значимо сниженными относительно контроля; как следствие, неполное устранение В-витаминного дефицита, по-видимому, повлекло замедление восстановления концентрации 25(ОН)D в крови до нормального уровня. Таким образом, сопоставление настоящего и предыдущего исследования [25] показывает принципиальное отличие коррекции дефицита витамина D на фоне сопутствующего дефицита в рационе витаминов группы В, кальция и магния. Кроме того, различия могут быть обусловлены более краткой по продолжительности коррекцией дефицита витамина D - 5 сут против 7 сут в предыдущем опыте [25].

В целом результаты исследования свидетельствуют, что хронический сочетанный алиментарный дефицит витаминов группы В, кальция и магния, являющийся характерным для рациона российского населения, снижает биодоступность витамина D при коррекции дефицита профилактическими дозами этих нутриентов.

Витамины группы В

Ранее в исследованиях на экспериментальных животных нами отмечались аналогичные для дефицитной 5-й группы, хотя и менее выраженные, изменения в отношении биомаркеров обеспеченности витаминами группы В у крыс-самцов Wistar с исходной массой тела 70-80 г, получавших в течение такого же срока (28 сут) рационы с содержанием 20% от АУП всех витаминов в составе витаминной смеси при адекватном поступлении минеральных веществ [37].

Полученные данные свидетельствуют, что, как и в случае витамина D, хронический сочетанный дефицит изученных микронутриентов в рационе растущих крыс тормозит восстановление В-витаминного статуса. Кроме того, можно предположить, что для полной ликвидации дефицита витаминов группы В требуются более длительный срок и/или применение более высоких доз этих витаминов. Так, ранее было показано, что у крыс (70-80 г), содержавшихся, как и в нашем эксперименте, в течение 28 сут на рационе с дефицитом всех витаминов (20% от АУП), последующее добавление в корм в течение 14 сут витаминов полностью восстанавливало не только концентрацию в плазме крови рибофлавина, но и уровень витаминов В1 и В2 в печени до показателей у животных, получавших полноценный рацион [38].

Примечательно, что у крыс дефицитной 5-й группы экскреция с мочой 4-ПК была выше на 26,2% (р=0,042) таковой у животных 3-й группы, что, по-видимому, отражает повышенное выведение витаминов группы В с мочой на фоне сочетанного дефицита в рационе витамина D, кальция и магния. Полученные данные позволяют предположить, что одновременный недостаток в питании витаминов D, кальция и магния может усугублять дефицит в организме витаминов группы В.

Ранее было показано, что сочетанный недостаток в рационе кальция, магния и йода сопровождается повышенным выведением с мочой рибофлавина и одновременным уменьшением его концентрации в плазме крови [13].

Как видно из данных табл. 2 и 3, уровни всех изученных биомаркеров обеспеченности витаминами группы В в плазме крови, в моче, в печени и в головном мозге крыс после восполнения рациона по содержанию витаминов D и группы В на фоне недостаточного (4-я группа) и адекватного поступления кальция и магния (2-я группа) статистически значимо не различались. Этот факт мог бы позволить сделать вывод об отсутствии влияния одновременного недостатка кальция и магния в рационе на обеспеченность витаминами группы В. Однако выявленное снижение содержания рибофлавина в печени крыс 4-й группы (на фоне недостатка кальция и магния) на 13,0% (р=0,094) относительно контроля при отсутствии различия по этому показателю у крыс контрольной и 2-й групп (при адекватном поступлении минеральных веществ), с одной стороны, и выявленное снижение (р=0,031) относительно контроля выведения рибофлавина с мочой у крыс, получавших полностью восполненный рацион, и отсутствие такового различия на фоне недостатка кальция и магния, с другой стороны, свидетельствуют, что недостаток кальция и магния может оказывать негативное влияние на обеспеченность витамином В2.

Витамин Е

Поскольку, как известно, α-токоферол транспортируется в крови в составе липопротеинов, представлялось обоснованным охарактеризовать обеспеченность животных витамином Е, используя биомаркер, нормированный по содержанию липидов. Как видно из данных табл. 2, у крыс контрольной и всех опытных групп концентрация в плазме крови α-токоферола, соотнесенная с уровнями ХС, ТГ или их суммой, статистически значимо не различалась. Таким образом, повышение содержания витамина Е в плазме крови крыс 3-й и 5-й групп, а также, по-видимому, в печени крыс 5-й группы является следствием известной прямой зависимости концентрации α-токоферола от уровня липидов в тканях и отражает нарушения метаболизма липидов при недостатке витамина D, устранение которого ухудшается при дефиците витаминов группы В. В свою очередь, адекватное поступление витамина D c рационом, по-видимому, способствовало предотвращению накопления жира в печени даже на фоне сопутствующего недостатка витаминов группы В или кальция и магния, о чем косвенно свидетельствовало отсутствие статистически значимых различий по содержанию витамина Е в печени крыс 2-4-й групп. В целом полученные данные могут указывать на ведущую роль недостатка витаминов D и группы В в нарушениях липидного обмена и потенциально в развитии ожирения.

Заключение

Сочетанный дефицит витаминов D и группы В на фоне сниженного содержания в рационе крыс кальция и магния сопровождался увеличением в плазме крови концентрации железа, превысившей верхнюю границу нормы, повышением активности витамин D-зависимой ЩФ, снижением активности витамин В6-зависимой АЛТ, повышением уровня α-токоферола в плазме крови и печени относительно показателей животных контрольной группы.

Недостаток в рационе витаминов группы В, сохраняющийся в ходе коррекции дефицита в рационе крыс витамина D, кальция и магния, тормозил возврат повышенного уровня глюкозы, железа, ТГ, ХС, α-токоферола, повышенной активности ЩФ и сниженной активности АЛТ до уровня у животных контрольной группы и/или получавших восполненный по всем недостающим микронутриентам рацион.

Сниженное поступление кальция и магния в ходе коррекции недостатка в рационе витаминов D и группы В может оказывать негативное влияние на обеспеченность организма витамином B2.

Сочетанный хронический дефицит микронутриентов (витамины D и группы В, кальций и магний) в рационе растущих крыс при последующем восполнении витаминно-минерального состава корма до адекватного в течение 5 сут не позволяет полностью восстановить D- и В-витаминный статус организма.

Сочетанный недостаток витаминов D, группы В, кальция и магния, наиболее часто обнаруживаемый в рационе российского населения, способен снижать эффективность использования отдельных или неполного набора дефицитных микронутриентов, способствуя формированию факторов риска развития метаболического синдрома.

Литература

1. Федеральная служба государственной статистики. Выборочное наблюдение рациона питания населения 2018. URL: https://rosstat.gov.ru/free_doc/new_site/food18/index.html

2. Коденцова В.М., Бекетова Н.А., Никитюк Д.Б., Тутельян В.А. Характеристика обеспеченности витаминами взрослого населения Российской Федерации // Профилактическая медицина. 2018. Т. 21, № 4. С. 32-37. DOI: https://doi.org/10.17116/profmed201821432

3. Коденцова В.М., Мендель О.И., Хотимченко С.А., Батурин А.К., Никитюк Д.Б., Тутельян В.А. Физиологическая потребность и эффективные дозы витамина D для коррекции его дефицита. Современное состояние проблемы // Вопросы питания. 2017. Т. 86, № 2. С. 47-62. DOI: https://doi.org/10.4172/2155-615

4. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Рисник Д.В., Никитюк Д.Б., Тутельян В.А. Обеспеченность населения России микронутриентами и возможности ее коррекции. Состояние проблемы // Вопросы питания. 2017. Т. 86, № 4. С. 113-124. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-88

5. Chang S.-W., Lee H.-C. Vitamin D and health - the missing vitamin in humans // Pediatr. Neonatol. 2019. Vol. 60, N 3. P. 237-244. DOI: https://doi.org/10.1016/j.pedneo.2019.04.007

6. Pizzini A., Aichner M., Sahanic S., Böhm A., Egger A., Hoermann G. et al. Impact of vitamin D deficiency on COVID-19 - a prospective analysis from the CovILD registry // Nutrients. 2020. Vol. 12, N 9. Abstr. 2775. DOI: https://doi.org/10.3390/nu12092775

7. Saponaro F., Saba A., Zucchi R. An update on vitamin D metabolism // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21, N 18. Abstr. 6573. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms21186573

8. Спиричев В.Б. О биологических эффектах витамина D // Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2011. Т. 90, № 6. С. 113-119.

9. Коденцова В.М., Вржесинская О.А. Влияние дефицита витаминов на обеcпеченность организма витамином D // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2018. Т. 21, № 7. С. 42-46. DOI: https://doi.org/10.29296/25877313-2018-07-07

10. Reddy P., Edwards L.R. Magnesium supplementation in vitamin D deficiency // Am. J. Ther. 2019. Vol. 26, N 1. P. e124-e132. DOI: https://doi.org/10.1097/MJT.0000000000000538

11. Uwitonze A.M., Razzaque M.S. Role of magnesium in vitamin D activation and function // J. Am. Osteopath Assoc. 2018. Vol. 118, N 3. P. 181-189. DOI: https://doi.org/10.7556/jaoa.2018.037

12. Громова О.А., Торшин И.Ю., Рудаков К.В., Громов А.Н., Калачева А.Г. Систематический анализ магнийзависимых митохондриальных белков // Кардиология. 2014. Т. 54, № 9. С. 86-92. DOI: https://doi.org/10.18565/cardio.2014.9.86-92

13. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А., Кошелева О.В., Шевякова Л.В., Леоненко С.Н. и др. Влияние алиментарной недостаточности кальция, магния и йода на витаминный статус крыс // Микроэлементы в медицине. 2021. Т. 22, № 1. С. 52-59. DOI: https://doi.org/10.19112/2413-6174-2021-22-1-52-59

14. Ikezumi Y., Matsuura Y., Morishita T., Ide N., Kitada I., Katayama T. et al. Necessity of daily 1000-IU vitamin D supplementation for maintaining a sufficient vitamin D status // J. Med. Invest. 2022. Vol. 69, N 1-2. P. 135-140. DOI: https://doi.org/10.2152/jmi.69.135

15. Munns C.F., Shaw N., Kiely M., Specker B.L., Thacher T.D., Ozono K. et al. Global consensus recommendations on prevention and management of nutritional rickets // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2016. Vol. 101, N 2. P. 394-415. DOI: https://doi.org/10.1210/jc.2015-2175

16. Reeves P.G. Components of the AIN-93 diets as improvements in the AIN-76A diet // J. Nutr. 1997. Vol. 127, N 5. P. 838S-841S. DOI: https://doi.org/10.1093/jn/127.5.838S

17. Химический состав пищевых продуктов / под ред. Нестерина М.Ф., Скурихина И.М. Москва : Пищевая промышленность, 1979. 247 с.

18. Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Вржесинская О.А. Методы оценки витаминной обеспеченности населения : учебно-методическое пособие. Москва : ПКЦ Альтекс, 2001. 68 с.

19. Kodentsova V., Vrzhesinskaya O., Spirichev V. Fluorometric riboflavin titration in plasma by riboflavinbinding apoprotein as a method for vitamin B2 status assessment // Ann. Nutr. Metab. 1995. Vol. 39. P. 355-360. DOI: https://doi.org/10.1159/000177885

20. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопроcы питания. 1993. № 1. С. 43-48.

21. Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Тимонин А.Н., Шестакова С.И., Мустафина О.К., Сото С.Х. Изучение влияния интоксикации кадмием на модели витаминно-минеральной недостаточности у крыс // Вопросы питания. 2018. Т. 87, № 1. С. 63-71. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2018-10007

22. Matsuzaki H., Katsumata S., Uehara M., Miwa M., Suzuki K. Onset of nephrocalcinosis depends on dietary phosphorus concentration in male rats fed a magnesium-deficient diet // Magnes. Res. 2006. Vol. 19, N 4. P. 255-260.

23. Haarhaus M., Cianciolo G., Barbuto S., La Manna G., Gasperoni L., Tripepi G. et al. Alkaline phosphatase: an old friend as treatment target for cardiovascular and mineral bone disorders in chronic kidney disease // Nutrients. 2022. Vol. 14, N 10. Abstr. 2124. DOI: https://doi.org/10.3390/nu14102124

24. Егшатян Л.В., Мокрышева Н.Г. Эктопическая кальцификация при хронической болезни почек. Часть 1. Классификация и патогенез // Нефрология. 2017. T. 21, № 4. С. 30-39. DOI: https://doi.org/10.24884/1561-6274-2017-21-4-30-39

25. Вржесинская О.А., Леоненко С.Н., Коденцова В.М., Бекетова Н.А., Кошелева О.В., Сокольников А.А. и др. Эффективность коррекции дефицита витамина D в зависимости от обеспеченности крыс витаминами группы В // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 2. С. 91-99. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-2-91-99

26. Wei Z., Yoshihara E., He N., Hah N., Fan W., Pinto A.F.M. et al. Vitamin D switches BAF complexes to protect β cells // Cell. 2018. Vol. 173, N 5. P. 1135-1149.e15. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.04.013

27. Xiao P., Cheng H., Li H., Zhao X., Hou D., Xie X., Mi J. Vitamin D trajectories and cardiometabolic risk factors during childhood: a large population-based prospective cohort study // Front. Cardiovasc. Med. 2022. Vol. 9. Article ID 836376. DOI: https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.836376

28. Kim M.R., Jeong S.J. Relationship between vitamin D level and lipid profile in non-obese children // Metabolites. 2019. Vol. 9, N 7. Abstr. 125. DOI: https://doi.org/10.3390/metabo9070125

29. Апрятин С.А., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Ригер Н.А., Евстратова В.С., Трусов Н.В. и др. Влияние В-витаминного дефицита на биохимические, иммунологические показатели и микроэлементный статус крыс и мышей различных линий // Вопросы питания. 2018. Т. 87, № 4. С. 14-24. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2018-10037

30. Bian X., Gao W., Wang Y., Yao Z., Xu Q., Guo C., Li B. Riboflavin deficiency affects lipid metabolism partly by reducing apolipoprotein B100 synthesis in rats // J. Nutr. Biochem. 2019. Vol. 70. P. 75-81. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jnutbio.2019.04.011

31. Al-Musharaf S., Aljuraiban G.S., Hussain S.D., Alnaami A.M., Saravanan P., Al-Daghri N. Low serum vitamin B12 levels are associated with adverse lipid profiles in apparently healthy young Saudi women // Nutrients. 2020. Vol. 12, N 8. Abstr. 2395. DOI: https://doi.org/10.3390/nu12082395

32. Niafar M., Samadi G., Aghamohammadzadeh N., Najafipour F., Nikniaz Z. There is a positive association between vitamin B12 deficiency and serum total cholesterol in Iranian type 2 diabetic patients on metformin // Nutr. Clin. Metab. 2018. Vol. 32, N 3. P. 195-200. DOI: https://doi.org/10.1016/j.nupar.2018.05.002

33. Спасов А.А., Иежица И.Н., Харитонова М.В., Кравченко М.С. Влияние солей магния на липидный спектр сыворотки крови крыс в условиях алиментарного дефицита магния // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2008. Т. 71, № 4. С. 35-40.

34. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х., Карагодина З.В., Шаранова Н.Э. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые параметры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. T. 154, № 10. P. 439-442.

35. Mackraj I., Thirumala G., Gathiram P. Vitamin B6 deficiency alters tissue iron concentrations in the Wistar rat // J. Trace Elem. Med. Biol. 2009. Vol. 23, N 1. P. 43-49. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jtemb.2008.07.003

36. Galaris D., Barbouti A., Pantopoulos K. Iron homeostasis and oxidative stress: An intimate relationship // Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2019. Vol. 1866, N 12. Article 118535. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2019.118535

37. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А., Кошелева О.В., Переверзева О.Г. Влияние содержания хитозана в рационе крыс на усвоение витаминов на фоне их сочетанного дефицита // Вопросы питания. 2011. Т. 80, № 4. С. 56-61.

38. Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Кошелева О.В., Переверзева О.Г., Сокольников А.А. Коррекция полигиповитаминоза у крыс различными дозами витаминов на фоне обогащения рациона полиненасыщенными жирными кислотами семейства ω-3 // Вопросы питания. 2013. Т. 82, № 4. С. 39-47.

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Вскрытие
Медицина сегодня
IX Междисциплинарная международная конференция: "Актуальные вопросы микрохирургии". Памяти Н.О. Миланова.

Приветствуем вас в новом 2023 году, который мы встретили с надеждой и неизменно с планами на будущее! Традиционно в феврале ученики Николая Олеговича Миланова, сотрудники основанной им кафедры в Сеченовском Университете, планируют проведение уже девятой мемориальной...

Тромботические проблемы при цереброваскулярной патологии и коморбидных процессах

Уважаемые коллеги! 10.02.2023 состоится Совместный научно-образовательный симпозиум Национальной Ассоциации по тромбозу и гемостазу и ФГБНУ "Научный центр неврологии" "Тромботические проблемы при цереброваскулярной патологии и коморбидных процессах". Начало регистрации в...

Приглашаем специалистов Сибирского федерального округа 9-10 февраля посетить Школу РОАГ!

Приглашаем специалистов Сибирского федерального округа 9-10 февраля посетить Школу РОАГ! Успешно продолжается образовательная работа общероссийского проекта "Школы РОАГ". Очередная встреча пройдет 9-10 февраля в онлайн-формате и объединит врачей Иркутска, Кемерово, а также...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»