Development and validation of methods for the quantitative determination of vitamins B1 and B2 in foods by high performance liquid chromatography with diode array detection

• Maria N. Bogachuk
• Aleksandra S. Shibaeva
• Mariia A. Paleeva
• Alexey D. Malinkin

Abstract

The main sources of vitamins, which are essential substances, are mainly aliment products, foods for special dietary uses and dietary supplements. Therefore, the study of the native content of vitamins in aliment foods has always been of interest. For the chromatographic separation of vitamins, rather versatile C18 columns are used as a stationary phase, which allow one to obtain reliable results using UV detection for vitamin-enriched foods, dietary supplements and vitamin premixes. However, for unfortified foods, this stationary phase in a UV detection system does not give acceptable results.

The aim of the work was to develop a technique for the chromatographic separation of vitamins B₁ and B₂ in unfortified foods using a diode array detector.

Material and methods. To prepare samples of foods, concentrated acid hydrolysis (1.0 g of sample and 4 ml of 0.1 N hydrochloric acid) was carried out in a water bath for 30 min at a temperature of 95 °C, followed by enzymatic hydrolysis and degreasing. Further studies of the samples were carried out on an Agilent Technologies 1100 chromatographic system with diode array detection. For the determination of vitamin B₁, a Poroshell 120 Hilic column 4.6×150 mm, grain size 2.7 μm was used. As eluent A, a 10 mM aqueous solution of ammonium acetate with 0.5% acetic acid was used, eluent B was acetonitrile (gradient elution: 0–2 min – 90% B, 8–12 min – 50% B, 14–18 min – 90% B). To determine vitamin B₂, a C18 Poroshell column 4.6×250 mm, grain size 5 µm was used. As eluent A, a classical phosphate buffer with pH 2.5 was used, eluent B – acetonitrile (gradient elution: 0–5 min – 0% B, 5–15 min – 90% B, 15–22 min – 90% B, 22–24 min – 0% B, 24–27 min – 0% B). Vitamin B₁ was detected at a wavelength of 270 nm, vitamin B₂ at 450 nm. Under selected conditions, good retention and efficient separation of vitamins B₁ (over 16,000 theoretical plates) and B₂ (over 20,000 theoretical plates) was observed.

Results. It was demonstrated that the HPLC method with diode array detection can be used to quantify the native content of vitamins B₁ and B₂ in products with a complex food matrix. For the selective determination of these vitamins, a complex of chromatographic conditions is optimal: reverse-phase HPLC for vitamin B₂ and hydrophilic interaction chromatography for vitamin B₁. A suitable sample preparation of food products for the content of vitamins B₁ and B₂ under selected chromatographic conditions is concentrated acid-enzymatic hydrolysis. The limit of quantitation for vitamins B₁ and B₂ was 40 μg/100 g. Comparison of the enzymatic activity of amylorizin and thermostable α-amylase showed that during long-term hydrolysis for 16 hours (37 °С) with amylorizin, the degree of vitamin extraction was two fold higher than during hydrolysis (95 °С, 1 h) with α-amylase.

Conclusion. The selected conditions for determining the native content of vitamins B₁ and B₂ in unfortified and low-fortified foods can be used in practice, which has been proven through their successful validation and practical application on real samples of cereals.

Keywords:HPLC; diode array detector; foods; sample preparation; vitamin B1; vitamin B2; hydrophilic interaction chromatography; reverse phase chromatography

References

1. Zhilinskaya N.V., Bessonov V.V., Gromovykh P.S., Bogachuk M.N. Development of a modern methodological base for monitoring the content of vitamins in food and food supplements. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (6): 106–16. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2018-10072 (in Russian)

2. Popova A.Yu., Tutel’yan V.A., Nikityuk D.B. On the new (2021) Norms of physiological requirements in energy and nutrients of various groups of the population of the Russian Federation. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (4): 6–19. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-4-6-19 (in Russian)

3. Chugunov S.A., Gryadobitova E.I., Potreba E.Yu. The study of the content of vitamin B1 in food by stripping voltammetry. Izvestiya Yugo-Zapadnogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Fizika i klhimiya [Proceedings of the Southwestern State University Series: Physics and Chemistry]. 2014; (1): 66–8. (in Russian)

4. Hatsayuk A.S., Pavlova O.E., Ekhova M.E. Role and importance of high performance liquid chromatography in the practice of high-tech laboratory. Zdorov’e. Meditsinskaya ekologiya. Nauka [Health. Medical Ecology. Science]. 2016; 3 (66): 215–9. DOI: https://doi.org/10.18411/hmes.d-2016-146 (in Russian)

5. Tutel’yan V.A. Chemical composition and calorie content of Russian food products: a reference book. Moscow: DeLi plyus, 2012: 284 p. (in Russian)

6. Yashin Ya., Vedenin A., Yashin A. HPLC and ultra-HPLC: Status and prospects. Analitika [Analytics]. 2015; (2): 70–84. (in Russian)

7. Chernobrovkina A.V., Smolenkov A.D., Shpigun O.A. Hydrophilic chromatography - a promising method for the determination of polar substances. Laboratoriya i proizvodstvo [Laboratory and Production]. 2018; (4): 76–92. DOI: https://doi.org/10.32757/2619-0923.2018.4.4.76.92 (in Russian)

8. Kartsova L.A. Bessonova E.A., Somova V.D. Hydrophilic chromatography. Zhurnal analiticheskoy khimii [Journal of Analitical Chemistry]. 2019; 74 (5): 323–34. DOI: https://doi.org/10.1134/S0044450219050050 (in Russian)

9. San José Rodriguez R., Fernández-Ruiz V., Cámara M., SánchezMata M.C. Simultaneous determination of vitamin B1 and B2 in complex cereal foods, by reverse phase isocratic HPLC-UV. J Cereal Sci. 2012; 55 (3): 293–9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcs.2011.12.011

10. Rakhman’ko E.M., Polyanskikh E.I., Shulyakovskaya O.V. The use of extraction for the determination of B vitamins in food products. Vestnik BGU [Bulletin of the Belarusian State University]. 2012; 2 (1): 37–42. (in Russian)

11. Polyakova Ya.A., Anan’eva I.A., Shapovalova E.N., Mazhuga A.G., Shpigun O.A. Separation of water-soluble vitamins by HPLC on silica gel modified with gold nanoparticles stabilized with L-cysteine. Vestnik Moskovskogo universiteta [Bulletin of Moscow University]. 2016; 57 (1): 24–30. (in Russian)

12. Mack A. Analysis of Water-Soluble Vitamins on an Agilent Infinity Lab Poroshell 120 HILIC-OH5 Column. In: Agilent Technologies Application Note. 2017. URL: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-8780EN_Poroshell%20HILIC-OH5_vitamins_application.pdf

13. Shokhin I.E., Malashenko E.A., Medvedev Yu.V., Bogachuk M.N., Kulakov S.A., Paleeva M.A. HPLC-UV method development and validation for vitamin D3 (Cholecalciferol) quantitation in drugs and dietary supplements. Razrabotra i registratsiya lekarstvennykh sredstv [Drug Development and Registration]. 2021; 10 (2): 87–99. DOI: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-2-87-99 (in Russian)

14. Epshtein N. A. Validation of chromatographic methods: checking the peak purity and the specificity of methods with diode array detectors. Razrabotra i registratsiya lekarstvennykh sredstv [Drug Development and Registration]. 2020; 9 (3): 129–36. DOI: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2020-9-3-129-136 (in Russian)

15. Kulczyński B., Kobus-Cisowska J., Taczanowski M., Kmiecik D., Gramza-Michałowska A. The chemical composition and nutritional value of chia seeds – current state of knowledge. Nutrients. 2019; 11 (6): 1242. DOI: https://doi.org/10.3390/nu11061242

В ходе исследований были проведены высаливательная экстракция [10] (в качестве высаливателя использовали 2 соли: карбонат калия и сульфат аммония, а в качестве экстрагента - ряд низших алифатических спиртов: метанол, этанол и изопропанол), а также концентрирование пробы после классического кислотно-ферментативного гидролиза. При таком подходе изначально разведение пробы было достаточно большим (на 1 г образца 20 см³ растворителя), поэтому было предложено снизить степень разведения пробы примерно в 5 раз (на 1 г образца 4 см³ растворителя).

Предложенный способ пробоподготовки заключается в проведении кислотно-ферментативного гидролиза более концентрированных проб. После этого для дополнительного осаждения белков предлагается перерастворить часть гидролизата в ацетонитриле в соотношении 1:3 (для витамина В₁) или к 1 см³ гидролизата добавить 100 мкм³ концентрированной трифторуксусной кислоты (для витамина В₂). Такой подход позволил снизить мешающий фон матрицы на хроматограмме (но не позволил избавиться от него полностью ввиду сложной матрицы пищевых продуктов) и повысить селективность хроматографической системы при определении витаминов.

Описание гидролиза

Для подготовки образцов пищевой продукции в пробирки объемом 15 см³ помещали около 1,0 г образца и добавляли 4 см³ 0,1 Н соляной кислоты, закрывали крышкой, встряхивали на вибрационном шейкере и ставили на водяную баню на 30 мин при температуре 95 °С. Давали пробе остыть, затем прибавляли 0,2 см³ 2,5 Н ацетата натрия и 0,1 г фермента амилоризина, встряхивали на вибрационном шейкере и помещали на водяную баню на 16 ч при температуре 37 °С. После окончания гидролиза в пробы добавляли 2 см³ хлороформа (при необходимости удаления жира) и центрифугировали. Отбирали верхний слой в пробирки типа "Эппендорф" и снова центрифугировали.

Для определения витамина В₁ 1 см³ верхнего слоя отбирали в виалу объемом 7 см³ и добавляли 3 см³ ацетонитрила, смешивали на вибрационном шейкере и отбирали в пробирки типа Эппендорф, после центрифугирования отбирали на анализ.

Для определения витамина В₂ 1 см³ верхнего слоя отбирали в пробирки типа "Эппендорф" и добавляли 100 мкм³ трифторуксусной кислоты, смешивали на вибрационном шейкере, центрифугировали и отбирали на анализ.

Сравнение ферментативной активности амилоризина и α-амилазы

Одной из задач исследования было показать возможность использования для пробоподготовки образцов термостабильного фермента α-амилазы, применяемой для определения пищевых волокон в продуктах в соответствии с ГОСТ Р 54014-2010 "Продукты пищевые функциональные. Определение растворимых и нерастворимых пищевых волокон ферментативно-гравиметрическим методом". Такой подход позволил бы оптимизировать процедуру пробоподготовки образцов для анализа на содержание пищевых волокон и витаминов В₁ и В₂. Принципиальное отличие пробоподготовки с использованием этого фермента заключается в отсутствии кислотного гидролиза (средой является фосфатный буфер) и во времени гидролиза, которое составляет 1 ч, но при высокой температуре 95 °С.

Эксперимент, проводимый на овсяных хлопьях, показал, что высвобождение обоих витаминов почти в 2 раза ниже в условиях гидролиза с термостабильной α-амилазой, чем с амилоризином (рис. 5). На рис. 6 представлены сравнительные хроматограммы на примере рибофлавина.

Таким образом, для эффективного определения витаминов В₁ и В₂ более подходящим способом является длительный ферментативный гидролиз (около 16 ч) с амилоризином.

Валидация аналитических методик

Валидацию аналитической методики в соответствии с ГОСТ 33044-2014 "Принципы надлежащей лабораторной практики", Государственной фармакопеей Российской Федерации XIV и РМГ 61-2010 "Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа" проводили по следующим параметрам: специфичность, правильность, линейность, прецизионность, предел количественного определения, аналитическая область.

В качестве основного объекта были выбраны овсяные хлопья, детская смесь молочная сухая адаптированная начальная "Nutrilak" (АО "Инфаприм", Россия).

В процессе валидации были рассчитаны и обоснованы все валидационные параметры:

1. Подтверждение специфичности проводили сравнением хроматограмм растворителя, плацебо, стандарта и готовой пробы образца для анализа.

Согласно полученным результатам на хроматограммах растворителя и плацебо отсутствуют пики со временем удерживания, характерным для витамина В₁ и витамина В₂ в исследуемых хроматографических условиях [11].

Для раствора стандарта эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику витамина В₁, составила более 30 000 теоретических тарелок; фактор асимметрии пика витамина В₁ - около 0,68.

Для раствора стандарта эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику витамина В₂, составила более 200 000 теоретических тарелок; фактор асимметрии пика витамина В₂ - около 0,95.

2. Для определения линейности готовили 6 калибровочных стандартных растворов. Графики линейности представлены на рис. 6.

Коэффициент корреляции для калибровочного графика тиамина r_xy=0,9995 и рибофлавина r_xy=0,9998 соответствует установленной норме (не менее 0,9900).

3. Правильность разработанных методик оценивали путем исследования образца с известным содержанием определяемого витамина (для витамина В₁) и путем внесения известного количества добавки в матрицу (для витамина В₂). Полученные результаты удовлетворяли критериям приемлемости по показателю "Правильность": математическое ожидание содержания витамина, принятое в относительных единицах за 100%, не выходило за пределы доверительных интервалов среднего значения восстановления [13, 14].

4. Диапазон применения методики по определению витамина В₁ составил 0,04÷8,00 мг/100 г (диапазон калибровочных стандартных растворов 0,063÷12,6 нг/мкл). Диапазон применения методики по определению витамина В₂ составил 0,04÷4,00 мг/100 г (диапазон калибровочных стандартных растворов 0,0284÷28,4 нг/мкл).

5. Прецизионность методики оценивали согласно РМГ 61-2010 в условиях сходимости (повторяемости), т.е. при выполнении анализа одним химиком в течение короткого промежутка времени на одном и том же оборудовании, а также в условиях внутрилабораторной прецизионности при выполнении анализа образца той же серии во второй день. В обоих случаях было проанализировано по 5 образцов.

6. Сходимость оценивали путем исследования 5 навесок выбранных объектов (образца с известным содержанием определяемого витамина В₁ и путем внесения известного количества добавки витамина В₂ в матрицу). Относительное среднее квадратическое отклонение повторяемости витамина В₁ составило 0,71%. Относительное среднее квадратическое отклонение повторяемости витамина В₂ составило 1,45%.

7. Внутрилабораторную прецизионность оценивали по результатам определения витаминов тех же образцов, по которым проводилась оценка повторяемости, в другой день по 5 навесок каждого образца. Каждый раствор хроматографировали 3 раза. Показатель внутрилабораторной прецизионности методики по витамину В₁ в виде предела воспроизводимости R_v составил 18,34%. Показатель внутрилабораторной прецизионности методики по витамину В₂ в виде предела воспроизводимости R_v составил 33,42%.

Применение разработанных методик

Разработанные и валидированные методики определения рассматриваемых витаминов были опробованы в условиях анализа реальных образцов. Для этого были выбраны следующие зерновые продукты: овсяные хлопья "Геркулес", перловая крупа, пшено, рис, гречневая крупа, а также чечевица (зернобобовый продукт). Полученные результаты были сопоставлены с данными таблиц химического состава пищевых продуктов [4]. Помимо перечисленных продуктов, содержание витамина В₁ определяли в муке из семян чиа, что представляло дополнительный интерес, поскольку такие данные в таблицах химического состава отсутствуют.

В таблице представлены результаты проведенных испытаний.

Стоит отметить, что отличие полученных результатов от данных литературы может быть обусловлено статистической погрешностью, сроком годности, условиями хранения используемых продуктов, а также особенностями методов исследования.

На рис. 7 и 8 приведены примеры хроматограмм различных образцов анализируемых пищевых продуктов.

Заключение

Метод ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием может быть использован для количественного определения нативного содержания витаминов В₁ и В₂ в продуктах со сложной пищевой матрицей. Для селективного определения этих витаминов оптимален комплекс хроматографических условий: ОФ ВЭЖХ для витамина В₂ и хроматография гидрофильного взаимодействия для витамина В₁. При этом оптимальной пробоподготовкой перед анализом пищевых продуктов на содержание витаминов В₁ и В₂ в подобранных хроматографических условиях является концентрированный кислотно-ферментативный гидролиз, который позволяет провести детектирование и количественное определение витаминов без использования флуориметрического детектора и, соответственно, без использования постколоночной дериватизации со сложным аппаратурным оформлением. Предел количественного определения для витаминов В₁ и В₂ составил 40 мкг/100 г.

Сравнение ферментативной активности амилоризина и термостабильной α-амилазы показало, что при длительном гидролизе в течение 16 ч (37 °С) с амилоризином степень извлечения витаминов оказалась в два раза выше, чем при гидролизе (95 °С) с α-амилазой.

Подобранные методики могут быть использованы на практике, что было доказано путем успешного проведения их валидации.

Литература

1. Жилинская Н.В., Бессонов В.В., Громовых П.С., Богачук М.Н. Развитие современной методической базы контроля содержания витаминов в пищевой продукции и биологически активных добавках к пище // Вопросы питания. 2018. Т. 87, № 6. С. 106-116. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2018-10072

2. Попова А.Ю., Тутельян В.А., Никитюк Д.Б. О новых (2021) Нормах физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 4. С. 6-19. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-4-6-19

3. Чугунов С.А., Грядобитова Е.И., Потреба Е.Ю. Исследование содержания витамина В₁ в продуктах питания методом инверсионной вольтамперометрии // Известия Юго-Западного государственного университета. Серия: Физика и химия. 2014. № 1. С. 66-68.

4. Хацаюк А.С., Павлова О.Е., Эхова М.Э. Роль и значение высокоэффективной жидкостной хроматографии в практике высокотехнологичных лабораторных исследований // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2016. № 3 (66). С. 215-219. DOI: https://doi.org/10.18411/hmes.d-2016-146

5. Тутельян В.А. Химический состав и калорийность российских продуктов питания: справочник. Москва : ДеЛи плюс, 2012. 284 с.

6. Яшин Я., Веденин А., Яшин А. ВЭЖХ и ультра-ВЭЖХ: Состояние и перcпективы // Аналитика. 2015. № 2. С. 70-84.

7. Чернобровкина А.В., Смоленков А.Д., Шпигун О.А. Гидрофильная хроматография - перспективный метод определения полярных веществ // Лаборатория и производство. 2018. № 4. С. 76-92. DOI: https://doi.org/10.32757/2619-0923.2018.4.4.76.92

8. Карцова Л.А. Бессонова Е.А., Сомова В.Д. Гидрофильная хроматография // Журнал аналитической химии. 2019. Т. 74, № 5. С. 323-334. DOI: https://doi.org/10.1134/S0044450219050050

9. San José Rodriguez R., Fernández-Ruiz V., Cámara M., Sánchez-Mata M.C. Simultaneous determination of vitamin B1 and B2 in complex cereal foods, by reverse phase isocratic HPLC-UV // J. Cereal Sci. 2012. Vol. 55, N 3. P. 293-299. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcs.2011.12.011

10. Рахманько Е.М., Полянских Е.И., Шуляковская О.В. Применение экстракции для определения витаминов группы В в пищевых продуктах // Вестник БГУ. 2012. Сер. 2, № 1. С. 37-42.

11. Полякова Я.А., Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н., Мажуга А.Г., Шпигун О.А. Разделение водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ на силикагеле, модифицированном наночастицами золота, стабилизированными L-цистеином // Вестник Московского университета 2016. Т. 57, № 1. С. 24-30.

12. Mack A. Analysis of Water-Soluble Vitamins on an Agilent Infinity Lab Poroshell 120 HILIC-OH5 Column // Agilent Technologies Application Note. 2017. URL: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-8780EN_Poroshell%20HILIC-OH5_vitamins_application.pdf

13. Шохин И.Е., Малашенко Е.А., Медведев Ю.В., Богачук М.Н., Кулаков С.А., Палеева М.А. Разработка, валидация и применение методики количественного определения витамина D3 (холекальциферола) методом ВЭЖХ с УФ-детектированием для анализа лекарственных средств и биологически активных добавок к пище // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021. Т. 10, № 2. С. 87-99. DOI: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-2-87-99

14. Эпштейн Н. А. Валидация хроматографических методик: контроль чистоты пиков и специфичности методик с использованием диодно-матричных детекторов // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2020. Т. 9, № 3. С. 129-136. DOI: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2020-9-3-129-136

15. Kulczyński B., Kobus-Cisowska J., Taczanowski M., Kmiecik D., Gramza-Michałowska A. The chemical composition and nutritional value of chia seeds - current state of knowledge // Nutrients. 2019. Vol. 11, N 6. Abstr. 1242. DOI: https://doi.org/10.3390/nu11061242

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.