Modified method for obtaining phycocyanine concentrate of Arthrospira platensis biomass

• Nadezhda A. Birulina
• Sergey N. Zorin
• Dmitriy B. Nikityuk
• Vladimir K. Mazo

Abstract

The biomass of Arthrospira platensis cyanobacteria is a source of bioactive compounds such as chlorophylls, carotenoids, and, particularly, phycobiliproteins: C-phycocyanin and allophycocyanin. The wide range of biological activity shown by extracts with a high content of phycocyanins determines the prospects for their use as dietary supplements and ingredients of special foods. For food purposes, the degree of purity of phycocyanin concentrates, determined by the ratio of optical densities of their aqueous solutions at two wavelengths, namely D₆₂₀/D₂₈₀, must be greater than 0.7. Most methods for obtaining phycocyanin concentrates include laborious steps of fractional ammonium sulphate precipitation of protein from A. platensis biomass extracts followed by removal of salts solution. The use of membrane technology, specifically microfiltration, makes it possible to significantly intensify and simplify the process of obtaining phycocyanin concentrates.

The aim of this research was to modify the method for obtaining a high-purity A. platensis phycocyanin concentrate by replacing the stage of ammonium sulfate precipitation of the protein by ultrafiltration of the extract followed by microfiltration.

Material and methods. A sample of dry A. platensis biomass was used as a feedstock. Extraction of A. platensis biomass was carried out at a temperature of +40 °C for 3 h, the resulting suspension was centrifuged, and the supernatant was separated from the sediment. The obtained extract was subjected to ultrafiltration (membrane with a pore diameter of 30 kDa) followed by removal of the permeate containing low molecular weight impurities. The retentate was subjected to microfiltration (membrane with a pore size of 0.2 μm), concentrated by reverse osmosis and freeze-dried.

Results. The content of C-phycocyanin and allophycocyanin in the dry concentrate was 42.0±1.3 and 7.0±0.3%, respectively, the degree of purity was 1.98.

Conclusion. The scheme for obtaining A. platensis phycocyanin concentrate has been modified. A concentrate was obtained with a high degree of purity, allowing its use in food.

Keywords:biomass of Arthrospira platensis; extraction; C-phycocyanin; allophycocyanin; ultrafiltration; microfiltration; concentrate

References

1. Kerna N., Nwokorie U., Ortigas M., Chawla S., Pruitt K., Flores J., et al. Spirulina miscellany: medicinal benefits and adverse effects of Spirulina. EC Nutrition. 2022; 17: 25–36. DOI: https://doi.org/10.31080/ecnu.2022.17.01013

2. Lafarga T., Fernández-Sevilla J., González-López C., Acién-Fernández F. Spirulina for the food and functional food industries. Food Res Int. 2020; 137: 109356. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodres.2020.109356

3. Wollina U., Voicu C., Gianfaldoni S., Lotti T., França K., Tchernev G. Arthrospira platensis – potential in dermatology and beyond. Open Access Maced J Med Sci. 2018; 6 (1): 176–80. DOI: https://doi.org/10.3889/oamjms.2018.033

4. Finamore A., Palmery M., Bensehaila S., Peluso I. Antioxidant, immunomodulating, and microbial-modulating activities of the sustainable and ecofriendly Spirulina. Oxid Med Cell Longev. 2017; 69: 157–71. DOI: https://doi.org/10.1155/2017/3247528

5. Biryulina N.A., Mazo V.K., Bagryantseva O.V. Arthrospira platensis phycocyanins: a perspective for use in foods for special dietary uses (brief review). Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2022; 91 (6): 30–6. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-30-36 (in Russian)

6. Wu Q., Liu L., Miron A., Klimova B., Wan D., Kuca K. The antioxidant, immunomodulatory, and anti-inflammatory activities of Spirulina: an overview. Arch Toxicol. 2016; 90 (8): 1817–40. DOI: https://doi.org/10.1007/s00204-016-1744-5

7. Pagels F., Guedes A., Amaro H., Kijjoa A., Vasconcelos V. Phycobiliproteins from cyanobacteria: chemistry and biotechnological applications. Biotechnol Adv. 2019; 37 (3): 422–43. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.02.010

8. Mazo V.K., Biryulina N.A., Sidorova Yu.S. Arthrospira platensis: antioxidant, hypoglycemic and hypolipidemic effects in vitro and in vivo (brief review). Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2022; 91 (4): 19–25. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-4-19-25 (in Russian)

9. Biryulina N.A., Zorin S.N., Mazo V.K. Phycocyanin concentrates from Arthrospira platensis biomass: technology and composition characteristics. Aktual’naya biotekhnologiya [Actual Biotechnology]. 2022; (1): 187–9. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=50113924 (in Russian)

10. Güroy B., Karadal O., Mantoğlu S., Cebeci O. Effects of different drying methods on C-phycocyanin content of Spirulina platensis powder. EgeJFAS (Ege Journal of Fisheries and Aquatic Sciences). 2017; 34 (2): 129–32. DOI: https://doi.org/10.12714/egejfas.2017.34.2.02

11. Evaluation of Certain Food Additives: Eighty-Sixth Report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Geneva: World Health Organization and Food and Agriculture Organizationof the United Nations, 2019. (WHO Technical Report Series; No. 1014)

12. Vali Aftari R., Rezaei K., Mortazavi A., Bandani A. The optimized concentration and purity of spirulina platensis C-Phycocyanin: a comparative study on microwave-assisted and ultrasound-assisted extraction methods. J Food Process Preserv. 2015; 39 (6): 3080–91. DOI: https://doi.org/10.1111/jfpp.12573

13. Li Y., Zhang Z., Paciulli M., Abbaspourrad A. Extraction of phycocyanin-A natural blue colorant from dried spirulina biomass: influence of processing parameters and extraction techniques. J Food Sci. 2020; 85 (3): 727–35. DOI: https://doi.org/10.1111/1750-3841.14842

14. Martínez J., Luengo E., Saldaña G., Álvarez I., Raso J. C-phycocyanin extraction assisted by pulsed electric field from Artrosphira platensis. Food Res Int. 2017; 99 (3): 1042–7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodres.2016.09.029

15. Saran S., Puri N., Jasuja N., Kumar M., Sharma G. Optimization, purification and characterization of Phycocyanin from Spirulina platensis. Int J Appl Agric. 2016; 2 (3): 15–21.

16. Sala L., Moraes C., Kalil S. Cell pretreatment with ethylenediaminetetraacetic acid for selective extraction of C-phycocyanin with food grade purity. Biotechnol Progress. 2018; 34 (5): 1261–8. DOI: https://doi.org/10.1002/btpr.2713

17. Pott R.W. The release of the blue biological pigment C-phycocyanin through calcium-aided cytolysis of live Spirulina sp. Color Technol. 2018; 135 (1): 17–21. DOI: https://doi.org/10.1111/COTE.12373

18. Manirafasha E., Murwanashyaka T., Ndikubwimana T., Yue Q., Zeng X., Jing K., et al. Ammonium chloride: a novel effective and inexpensive salt solution for phycocyanin extraction from Arthrospira Spirulina platensis. J Appl Phycol. 2017; 29 (3): 1261–70. DOI: https://doi.org/10.1007/s10811-016-0989-y

19. Tavanandi H., Mittal R., Chandrasekhar J. Simple and efficient method for extraction of C-Phycocyanin from dry biomass of Arthospira platensis. Algal Res. 2018; 31: 239–51. DOI: https://doi.org/10.1016/j.algal.2018.02.008

20. Ilter I., Akyıl S., Demirel Z., Koç M., Conk-Dalay M., Kaymak-Ertekin F. Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using different techniques. J Food Compos Anal. 2018; 70: 78–88. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jfca.2018.04.007

21. Zhang F.Y., Yu J.W., Zhang L., Sheng J.M., Yuan M.Y., Lu Y.N., et al. UV-Vis spectrum characteristics of phycocyanin purification in water from Chao lake. J Clin Otorhinolaryngol. 2017; 37 (3): 806–10. DOI: https://doi.org/10.3964/j.issn.10000593(2017)03-0806-05

22. Gevorgiz R.G., Nekhoroshev M.V. Quantitative determination of the mass fraction of C phycocyanin and allophycocyanin in the dry biomass of Spirulina (Arthrospira) platensis North. Geitl. Cold extraction. In: Russian Academy of Sciences, Institute of Marine Biological Research named after A.O. Kovalevsky. Sevastopol’, 2017: 21 p. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=44165791 (in Russian)

23. Yan S., Zhu L., Su H., Zhang X., Chen X., Zhou B., et al. Single-step chromatography for simultaneous purification of C-phycocyanin and allophycocyanin with high purity and recovery from Spirulina (Arthrospira) platensis. J Appl Phycol. 2011; 23: 1–6. DOI: https://doi.org/10.1007/s10811-010-9525-7

24. Khazi M.I., Demirel Z., Liaqat F., Dalay M.C. Analytical grade purification of phycocyanin from cyanobacteria. Methods Mol Biol. 2020; 1980: 173–9. DOI: https://doi.org/10.1007/7651_2018_202

Каждый эксперимент был выполнен в 8 повторностях. Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета IBM SPSS Statistics 20 (IBM, США). Для всех показателей, представленных в таблице, вычисляли среднее значение (М) и стандартную ошибку среднего (m). Статистические различия оценивали с использованием критерия Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Белково-пептидные профили промежуточных продуктов и концентрата 2, полученных по предложенной модифицированной схеме (рис. 2А-В), и концентрата 1, полученного по технологии, включавшей стадию сульфатно-аммонийного осаждения белка из экстракта А. platensis (рис. 2Г), представлены соответствующими хроматограммами. Сравнительный анализ хроматограмм на рис. 2А и Б показал, что в результате ультрафильтрации экстракта происходит частичная элиминация балластных низкомолекулярных фракций (<12 кДа) и их содержание в отобранном ретентате снижается в 5,7 раза. Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что при использовании модифицированной схемы в ретентате содержание белка повышается в 1,7 раза, а суммарное содержание фикоцианинов - в 2,8 раза. Последующая микрофильтрация ретентата практически полностью удалила высокомолекулярные примеси из его состава (см. рис. 2Б и В), дополнительно повысила содержание общего белка и суммарное содержание фикоцианинов в конечном продукте соответственно в 1,2 и 1,6 раза. Степень чистоты ретентата в результате микрофильтрации увеличилась в 1,8 раза. В таблице приведены данные по сравнительной характеристике концентратов 2 и 1. Суммарное содержание фикоцианинов в концентрате 2 в 1,2 раза выше по сравнению с концентратом 1. В 1,8 раза повышена чистота концентрата 2, при получении которого была исключена трудоемкая стадия сульфатно-аммонийного осаждения.

Таким образом, полученные результаты подтвердили эффективность предложенной схемы модификации процесса. Сульфатно-аммонийное осаждение белков из экстрактов А. platensis позволяет примерно в 2 раза повысить на этой стадии степень чистоты получаемого промежуточного продукта [21, 23, 24]. Последующая ультрафильтрация, как при получении концентрата 1, используется, чтобы перевести осажденный белок в растворимое состояние, удаляя сульфат аммония из раствора. В модифицированной схеме ультрафильтрация непосредственно экстракта А. platensis заменяет стадию сульфатно-аммонийного осаждения, в 1,8 раза повышая чистоту продукта. Последующая микрофильтрация, как отмечено выше, дополнительно еще в 1,8 раза повышает чистоту концентрата 2.

Заключение

Модифицирован и апробирован способ концентрирования и очистки фикоцианинов из биомассы А. platensis. Получен концентрат с высоким содержанием фикоцианинов и степенью чистоты, позволяющей использовать его в составе пищевой продукции.

Литература

1. Kerna N., Nwokorie U., Ortigas M., Chawla S., Pruitt K., Flores J. et al. Spirulina miscellany: medicinal benefits and adverse effects of Spirulina // EC Nutrition. 2022. Vol. 17. P. 25-36. DOI: https://doi.org/10.31080/ecnu.2022.17.01013

2. Lafarga T., Fernández-Sevilla J., González-López C., Acién-Fernández F. Spirulina for the food and functional food industries // Food Res. Int. 2020. Vol. 137. Article ID 109356. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodres.2020.109356

3. Wollina U., Voicu C., Gianfaldoni S., Lotti T., França K., Tchernev G. Arthrospira platensis - potential in dermatology and beyond // Open Access Maced. J. Med. Sci. 2018. Vol. 6, N 1. P. 176-180. DOI: https://doi.org/10.3889/oamjms.2018.033

4. Finamore A., Palmery M., Bensehaila S., Peluso I. Antioxidant, immunomodulating, and microbial-modulating activities of the sustainable and ecofriendly Spirulina // Oxid. Med. Cell. Longev. 2017. Vol. 69. P. 157-171. DOI: https://doi.org/10.1155/2017/3247528

5. Бирюлина Н.А., Мазо В.К., Багрянцева О.В. Фикоцианины Arthrospira platensis: перспективы использования в специализированной пищевой продукции (краткий обзор) // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 6. С. 30-36. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-30-36

6. Wu Q., Liu L., Miron A., Klimova B., Wan D., Kuca K. The antioxidant, immunomodulatory, and anti-inflammatory activities of Spirulina: an overview // Arch. Toxicol. 2016. Vol. 90, N 8. P. 1817-1840. DOI: https://doi.org/10.1007/s00204-016-1744-5

7. Pagels F., Guedes A., Amaro H., Kijjoa A., Vasconcelos V. Phycobiliproteins from cyanobacteria: chemistry and biotechnological applications // Biotechnol. Adv. 2019. Vol. 37, N 3. P. 422-443. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.02.010

8. Мазо В.К., Бирюлина Н.А., Сидорова Ю.С. Arthrospira platensis: антиоксидантные, гипогликемические и гиполипидемические эффекты in vitro и in vivo (краткий обзор) // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 4. С. 19-25. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-4-19-25

9. Бирюлина Н.А., Зорин С.Н., Мазо В.К. Концентраты фикоцианинов из биомассы Аrthrospira platensis: технология и характеристика состава // Актуальная биотехнология. 2022. № 1. С. 187-189. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=50113924

10. Güroy B., Karadal O., Mantoğlu S., Cebeci O. Effects of different drying methods on C-phycocyanin content of Spirulina platensis powder // EgeJFAS (Ege Journal of Fisheries and Aquatic Sciences). 2017. Vol. 34, N 2. P. 129-132. DOI: https://doi.org/10.12714/egejfas.2017.34.2.02

11. Evaluation of Certain Food Additives: Eighty-Sixth Report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Geneva : World Health Organization and Food and Agriculture Organizationof the United Nations, 2019. (WHO Technical Report Series; No. 1014)

12. Vali Aftari R., Rezaei K., Mortazavi A., Bandani A. The optimized concentration and purity of spirulina platensis C-Phycocyanin: a comparative study on microwave-assisted and ultrasound-assisted extraction methods // J. Food Process. Preserv. 2015. Vol. 39. N 6. P. 3080-3091. DOI: https://doi.org/10.1111/jfpp.12573

13. Li Y., Zhang Z., Paciulli M., Abbaspourrad A. Extraction of phycocyanin-A natural blue colorant from dried spirulina biomass: influence of processing parameters and extraction techniques // J. Food Sci. 2020. Vol. 85, N 3. P. 727-735. DOI: https://doi.org/10.1111/1750-3841.14842

14. Martínez J., Luengo E., Saldaña G., Álvarez I., Raso J. C-phycocyanin extraction assisted by pulsed electric field from Artrosphira platensis // Food Res. Int. 2017. Vol. 99, N 3. P. 1042-1047. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodres.2016.09.029

15. Saran S., Puri N., Jasuja N., Kumar M., Sharma G. Optimization, purification and characterization of Phycocyanin from Spirulina platensis // Int. J. Appl. Agric. 2016. Vol. 2, N 3. P. 15-21.

16. Sala L., Moraes C., Kalil S. Cell pretreatment with ethylenediaminetetraacetic acid for selective extraction of C-phycocyanin with food grade purity // Biotechnol. Progress. 2018. Vol. 34, N 5. P. 1261-1268. DOI: https://doi.org/10.1002/btpr.2713

17. Pott R.W. The release of the blue biological pigment C-phycocyanin through calcium-aided cytolysis of live Spirulina sp. // Color. Technol. 2018. Vol. 135, N 1. P. 17-21. DOI: https://doi.org/10.1111/COTE.12373

18. Manirafasha E., Murwanashyaka T., Ndikubwimana T., Yue Q., Zeng X., Jing K. et al. Ammonium chloride: a novel effective and inexpensive salt solution for phycocyanin extraction from Arthrospira Spirulina platensis // J. Appl. Phycol. 2017. Vol. 29, N 3. P. 1261-1270. DOI: https://doi.org/10.1007/s10811-016-0989-y

19. Tavanandi H., Mittal R., Chandrasekhar J. Simple and efficient method for extraction of C-Phycocyanin from dry biomass of Arthospira platensis // Algal Res. 2018. Vol. 31. P. 239-251. DOI: https://doi.org/10.1016/j.algal.2018.02.008

20. Ilter I., Akyıl S., Demirel Z., Koç M., Conk-Dalay M., Kaymak-Ertekin F. Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using different techniques // J. Food Compos. Anal. 2018. Vol. 70. P. 78-88. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jfca.2018.04.007

21. Zhang F.Y., Yu J.W., Zhang L., Sheng J.M., Yuan M.Y., Lu Y.N. et al. UV-Vis spectrum characteristics of phycocyanin purification in water from Chao lake // J. Clin. Otorhinolaryngol. 2017. Vol. 37, N 3. P. 806-810. DOI: https://doi.org/10.3964/j.issn.10000593(2017)03-0806-05

22. Геворгиз Р.Г., Нехорошев М.В. Количественное определение массовой доли С фикоцианина и аллофикоцианина в сухой биомассе Spirulina (Arthrospira) platensis North. Geitl. Холодная экстракция / РАН, Институт морских биологических исследований им. А.О. Ковалевского. Севастополь, 2017. 21 с. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=44165791

23. Yan S., Zhu L., Su H., Zhang X., Chen X., Zhou B. et al. Single-step chromatography for simultaneous purification of C-phycocyanin and allophycocyanin with high purity and recovery from Spirulina (Arthrospira) platensis // J. Appl. Phycol. 2011. Vol. 23. P. 1-6. DOI: https://doi.org/10.1007/s10811-010-9525-7

24. Khazi M.I., Demirel Z., Liaqat F., Dalay M.C. Analytical grade purification of phycocyanin from cyanobacteria // Methods Mol. Biol. 2020. Vol. 1980. P. 173-179. DOI: https://doi.org/10.1007/7651_2018_202

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.