Study of the sorption-desorption of ecdysterone (20 E) as part of adaptogenic compositions with inulin and functional food ingredients based on spinach and quinoa

• Dmitry O. Bokov
• Maria N. Bogachuk
• Alexey D. Malinkin
• Victoria A. Nazarova
• Vladimir V. Bessonov

Abstract

The main principle in the enrichment of food with minor bioactive compounds is the prediction and evaluation of possible chemical interactions of the components included in the matrix of the food. These interactions have a impact on the bioavailability of minor bioactive compounds. In our work, we studied the processes of sorption and desorption (release), the main processes affecting the bioavailability of the minor bioactive compound ecdysterone (20 E) in the composition of functional food ingredients obtained from spinach leaves (FFI-1) and quinoa grains (FFI-2) on hydrocolloid matrix – inulin.

The objective of the research was to study the completeness of sorption-desorption processes of 20 E in adaptogenic compositions with inulin and functional food ingredients based on spinach and quinoa under the influence of hydrolytic enzymes of the gastrointestinal tract (GIT) in vitro.

Material and methods. To obtain experimental compositions, containing FFI-1 and FFI-2 and the polysaccharide (inulin), a mechanical mixing method was used. To study the sorption properties, model solutions of the compositions were prepared. Using an in vitro enzymatic model, the ability of 20 E to be released from the matrix of the compositions was studied. The content of 20 E was determined by HPLC-MS/MS.

Results. 6 compositions with different ratios of polysaccharide/FFI were obtained. At the first stage of the study, the maximum sorption of 20E in the model solution was observed for 4 compositions with the ratio of inulin : FFI = 2.50 or 3.75 g : 189.19 mg FFI-1 or 68.40 mg FFI-2. At the second stage of the study, when assessing the desorption of 20 E on the enzymatic GIT model, it was found that 20 E almost completely released only from 2 compositions, in other cases about 25% of 20 E remained in a bound state.

Conclusion. The formulation of two compositions with the ratio of inulin (2.50 g) : FFI-1 (189.19 mg)/FFI-2 (68.40 mg) were obtained, which have the most optimal sorption / release parameters of 20 E under the influence of human gastrointestinal enzymes. These compositions can be considered promising for inclusion in the formulation of fortified foods.

Keywords:20 E; sorption-desorption; adaptogenic compositions; functional food ingredients

References

1. Gorshunova K.D., Semenova P.A., Nechaev A.P., Bessonov V.V. Interaction of hydrocolloids and water-soluble vitamins in the construction of fortified foods. Pishchevaya promyshlennost’ [Food Processing Industry]. 2012; (11): 46–9. (in Russian)

2. Mazo V.K., Sidorova Yu.S., Sarkisyan V.A., Kiseleva T.L., Kochetkova A.A. The prospective of using plant polyphenols as functional food ingredients. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (6): 57–66. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2018-10067 (in Russian)

3. Sidorova Y.S., Shipelin V.A., Petrov N.A., Zorin S.N., Mazo V.K. Anxiolytic and antioxidant effect of phytoecdysteroids and polyphenols from Chenopodium quinoa on an in vivo restraint stress model. Molecules. 2022; 27 (24): 9003. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules27249003

4. Zorin S.N., Mazo V.K., Sidorova Yu.S., Petrov N.A., Malinkin A.D., Perova I.B., Bessonov V.V. Method for obtaining an extract from quinoa grains, enriched with phytoecdysteroids. Patent for invention 2764439 C1, 17.01.2022. Application No. 2021109798 dated 04.09.2021. (in Russian)

5. Zorin S.N., Sidorova Yu.S., Petrov N.A., Perova I.B., Malinkin A.D., Bokov D.O., et al. A new functional food ingredient enriched by phytoecdisteroids and polyphenols from quinoa grains (Chenopodium quinoa Willd.). Res J Pharm Technol. 2021; 14 (8): 4321–8. DOI: https://doi.org/10.52711/0974-360X.2021.00750

6. Bokov D.O., Bogachuk M.N., Malinkin A.D., Nazarova V.A., Bessonov V.V. Interaction assessment of polysaccharides and minor bioactive compounds in functional food ingredients of plant origin. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (1): 108–15. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-108-115 (in Russian)

7. Wan X., Guo H., Liang Y., Zhou C., Liu Z., Li K., Wang L. The physiological functions and pharmaceutical applications of inulin: a review. Carbohydr Polym. 2020; 246: 116589. DOI: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2020.116589

8. Qin Y.Q., Wang L.Y., Yang X.Y., Xu Y.J., Fan G., Fan Y.G., et al. Inulin: properties and health benefits. Food Funct. 2023; 14 (7): 2948–68. DOI: https://doi.org/10.1039/d2fo01096h

Градиентное элюирование смесью 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде (элюент А) и ацетонитрила (элюент Б): 0 мин - 5% элюента Б, 5 мин - 27% элюента Б, 5,5 мин - 90% элюента Б, 8,5 мин - 90% элюента Б, 9,5 мин - 5% элюента Б, 13,5 мин - 5% элюента Б; скорость потока - 0,4 см³/мин.

Параметры масс-детектора - параметры источника ионизации: давление распыляющего газа - 2,8 бар; температура осушающего газа - 350 °C; скорость потока осушающего газа - 10 л/мин; напряжение на фрагменторе - 98 В; регистрируемые переходы масс в МС/МС-режиме - 481,3 → 445,4 с энергией соударения 8 еВ (использовали для количественного анализа), 481,3 → 371,4 с энергией соударения 12 еВ (использовали для качественного подтверждения); полярность исследуемых ионов положительная; напряжение на капилляре - 4000 В.

Ферментативная модель оценки степени взаимодействия минорных биологически активных соединений и гидроколлоидов

Для оценки десорбции 20 Е предложена [6] методика, которая основана на свойстве резистентности растительных гидроколлоидов (ПСХ) и 20 E к действию гидролитических ферментов ЖКТ. В основе методики лежит гидролитическое расщепление крахмальных и белковых веществ в пищевых продуктах комплексом ферментов в контролируемых условиях среды (t°, рН) с последующим определением степени высвобождения БАС в связи

с разрушением комплекса БАС-ПСХ, определение резистентности БАС к среде ЖКТ. В качестве ферментов используют устойчивые к нагреванию α-амилазу, протеазу, амилоглюкозидазу. Расчет сорбции проводили по формуле:

где С_сорб. - сорбция БАС; M₁ - содержание БАС в композиции до ферментативной обработки; M₂ - содержание БАС в композиции после ферментативной обработки.

Методика включала следующие этапы.

- Этап I. 50 см³ фосфатного буфера (pH 6,0) помещали в каждую колбу с 1,0 г композиции, перемешивали на магнитной мешалке. Проверяли рН и при необходимости доводили до рН 6,0±0,2, добавляя необходимое количество по каплям раствора NaOH (0,275 М) или раствора HCl (0,325 M). Затем добавляли 100 мкм³ α-амилазы, перемешивали. Закрыв алюминиевой фольгой, инкубировали в кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем колбы с растворами композиций, не снимая алюминиевой фольги, охлаждали до комнатной температуры (20±2 °С).

- Этап II. Алюминиевую фольгу удаляли, раствор перемешивали. Доводили рН до 7,5±0,1, добавляя (около 10 см³) раствора NaOH (0,275 М). После внесения 500 мкм³ раствора протеазы в каждую колбу закрывали алюминиевой фольгой и инкубировали в бане при температуре 60±2 °С в течение 30 мин при непрерывном перемешивании. Отсчет времени начинали, когда температура достигнет 60 °С. Колбы с растворами композиций вынимали, не снимая алюминиевой фольги, охлаждали до комнатной температуры (20±2 °С).

- Этап III. Доводили рН до 4,0-4,6, добавляя (около 12 см³) раствор HCl (0,325 M). Вносили 300 мкм³ раствора амилоглюкозидазы в каждую колбу. Закрывали алюминиевой фольгой и инкубировали в бане при температуре 60±2 °С в течение 30 мин при непрерывном перемешивании. Отсчет времени начинали, когда температура достигала 60 °С. Колбы с растворами композиций вынимали, не снимая алюминиевой фольги, охлаждали до комнатной температуры (20±2 °С).

- Этап IV. Определяли объем гидролизата и добавляли 4 объема 95% этилового спирта, разогретого до 60 °С, смывали со стенок остатки в раствор, используя часть этилового спирта. Отстаивали при комнатной температуре не менее 2 ч до образования преципитата.

После III этапа отбирали пробу для анализа инулина, после IV этапа - для анализа 20 E. Для этого 1 см³ отбирали в центрифужную пробирку и центрифугировали в течение 10 мин при 3600 об/мин. Супернатант переносили в виалу для хроматографирования.

Определение содержания инулина

Содержание инулина определяли согласно МИ № 0152/РОСС RU.0001.310430/2020 "Определение содержания инулина в пищевых продуктах и БАД к пище" методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием. Хроматографическая система включала хроматограф Agilent 1260, программное обеспечение - ChemStation (ver. A.09.03); детектор рефрактометрический 1260 RID (G1362A); автосамплер 1260 ALS (G1329B); термостат колонок 1266 TCC (G1316A); колонку хроматографическую для ВЭЖХ Sugar-Pak (WATERS, США) длиной 300 мм и внутренним диаметром 6,5 мм, наполненную микрокристаллическим катионообменным гелем в кальциевой форме. Режим элюирования - изократический (подвижная фаза - вода очищенная с добавлением Са-ЭДТА 0,05 мг/мл); скорость потока - 0,5 см³/мин, t_{колонки}= 80 °C; объем вводимой пробы - 10 мкм³.

Статистическая обработка данных выполнена в программе Microsoft Office Excel 2010. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента, доверительная вероятность р=0,95.

Результаты

Определение оптимальных условий взаимодействия функциональных пищевых ингредиентов с инулином для получения композиций

Были приготовлены 6 композиций состава инулин-ФПИ-1, инулин-ФПИ-2 с различным соотношением полисахарид/ФПИ (табл. 1).

Согласно полученным данным (табл. 2), 100% сорбция 20 Е в модельной суспензии наблюдается для композиций № 2, 3, 5 и 6 с соотношением инулина (2,50 и 3,75 г) - ФПИ-1 (189,19 мг)/ФПИ-2 (68,40 мг).

При данном соотношении ФПИ-1, ФПИ-2 и инулина происходит наиболее эффективное комплексообразование по типу "полисахарид - минорное биологически активное вещество". На основании экспериментальных данных были отобраны композиции № 2, 3, 5 и 6 с инулином для дальнейших исследований.

Исследование влияния соотношения компонентов функциональный пищевой ингредиент/полисахарид (инулин) на высвобождение биологически активных соединений из матрикса композиций в условиях моделирования желудочно-кишечного тракта in vitro

В табл. 3 представлены данные, характеризующие степень высвобождения 20 Е из композиций с инулином.

Как видно из табл. 3, 20 Е практически полностью высвобождается из композиций № 2, 5 с соотношением инулин (2,50 г) - ФПИ-1 (189,19 мг)/ФПИ-2 (68,40 мг). В композициях № 3 и 6 с соотношением инулин (3,75 г) - ФПИ-1 (189,19 мг)/ФПИ-2 (68,40 мг) сорбция достигает порядка 25%.

В табл. 4 представлены данные о содержании инулина в композициях до и после ферментативной обработки композиций.

Согласно данным табл. 4, инулин не подвергается действию гидролитических ферментов на модели ЖКТ, его содержание в композициях составляет 91-97%.

На основании экспериментальных данных нами отобраны композиции № 2, 5 с инулином как наиболее перспективные для создания обогащенных пищевых продуктов.

Заключение

В работе были получены экспериментальные композиции различного состава (всего 6 видов), включающие ФПИ-1, ФПИ-2 и полисахарид инулин. Оценка сорбционных свойств полисахаридного компонента показала, что наиболее эффективное комплексообразование по типу "полисахарид - минорное биологически активное вещество" характерно для 4 составов композиций.

Исследование влияния соотношения компонентов ФПИ/полисахарид (инулин) на высвобождение БАС из матрикса композиций в условиях ферментативного моделирования ЖКТ in vitro позволило определить, что в 2 из 4 композиций с инулином происходит практически полное высвобождение 20 Е; для остальных композиций отмечено неполное высвобождение 20 Е с сорбцией выше 25%.

Таким образом, разработаны составы 2 композиций с соотношением инулин (2,50 г) - ФПИ-1 из листьев шпината (189,19 мг с содержанием 20 E 11,10 мг/г)/ФПИ-2 на основе зерен киноа (68,40 мг с содержанием 20 E 30,70 мг/г), которые можно считать перспективными для включения в рецептуры обогащенных пищевых продуктов.

Литература

1. Горшунова К.Д., Семенова П.А., Нечаев А.П., Бессонов В.В. Взаимодействие гидроколлоидов и водорастворимых витаминов при конструировании обогащенных пищевых продуктов // Пищевая промышленность. 2012. № 11. С. 46-49.

2. Мазо В.К., Сидорова Ю.С., Саркисян В.А., Киселева Т.Л., Кочеткова А.А. Перспективы использования растительных полифенолов в качестве функциональных пищевых ингредиентов // Вопросы питания. 2018. Т. 87, № 6. С. 57-66. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2018-10067

3. Sidorova Y.S., Shipelin V.A., Petrov N.A., Zorin S.N., Mazo V.K. Anxiolytic and antioxidant effect of phytoecdysteroids and polyphenols from Chenopodium quinoa on an in vivo restraint stress model // Molecules. 2022. Vol. 27, N 24. Р. 9003. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules27249003

4. Зорин С.Н., Мазо В.К., Сидорова Ю.С., Петров Н.А., Малинкин А.Д., Перова И.Б. и др. Способ получения экстракта из зерен киноа, обогащенного фитоэкдистероидами. Патент на изобретение 2764439 C1, 17.01.2022. Заявка № 2021109798 от 09.04.2021.

5. Zorin S.N., Sidorova Yu.S., Petrov N.A., Perova I.B., Malinkin A.D., Bokov D.O. et al. A new functional food ingredient enriched by phytoecdisteroids and polyphenols from quinoa grains (Chenopodium quinoa Willd.) // Res. J. Pharm. Technol. 2021. Vol. 14, N 8. P. 4321-4328. DOI: https://doi.org/10.52711/0974-360X.2021.00750

6. Боков Д.О., Богачук М.Н., Малинкин А.Д., Назарова В.А., Бессонов В.В. Оценка взаимодействия полисахаридов и минорных биологически активных веществ в функциональных пищевых ингредиентах растительного происхождения // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 1. С. 108-115. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-108-115

7. Wan X., Guo H., Liang Y., Zhou C., Liu Z., Li K., Wang L. The physiological functions and pharmaceutical applications of inulin: a review // Carbohydr. Polym. 2020. Vol. 246. Article ID 116589. DOI: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2020.116589

8. Qin Y.Q., Wang L.Y., Yang X.Y., Xu Y.J., Fan G., Fan Y.G. et al. Inulin: properties and health benefits // Food Funct. 2023. Vol. 14, N 7. Р. 2948-2968. DOI: https://doi.org/10.1039/d2fo01096h

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.