Alternaria toxins in tomato products marketed in the Russian Federation

• Irina B. Sedova
• Zakhar A. Chalyy
• Ulyana V. Ivanova
• Viktor A. Tutelyan

Abstract

Tomatoes and tomato products are widely produced and consumed throughout the world. Alternaria spp. are the main cause of alternariosis (black mold disease) on fresh tomatoes, both in the field and after harvesting. Alternaria toxins are widespread contaminants of tomato products.

The aim of the present study was to evaluate the contamination of tomato processing products from the domestic market with Alternaria toxins, as well as to assess their intake by humans through the consumption of tomato juices.

Material and methods. The content of Alternaria toxins (alternatiol, alternariol monomethyl ether, altenuene, tentoxin, tenuazonic acid) was determined in 64 samples of tomato products (paste, ketchup, juice) by high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass-spectrometric detection (HPLC-MS/MS).

Results. The priority Alternaria toxins for tomato paste, ketchup and juice were tenuazonic acid (61% of 64 samples, in amounts from 20.0 to 1065.5 μg/kg), altenuene (52%, 8.9–200.1 μg/kg) and alternariol (27%, 12.2–561.6 μg/kg). Samples of tomato paste turned out to be the most contaminated with Alternaria toxins while tomato juice samples were the least contaminated. At the same time, several toxins were found in 91% of tomato paste samples, 35% of ketchups, and 23% of tomato juices.

Conclusion. To the best of our knowledge, the present study is the first survey devoted to Alternaria toxins contamination of tomato paste, ketchup and tomato juice sold on the Russian market. The high frequency of their contamination with tenuazonic acid, altenuene and, to a lesser extent, alternariol has been established, which indicates a potential risk to human health when tomato processing products are consumed. This indicates the need for a hygienic assessment of contamination the above products with tenuazonic acid, altenuene and alternariol. When calculating the potential intakeof Alternaria toxins for different age population groups, it was shown that high levels of alternariol (up to 56.77 ng/kg body weight per day) could be obtained under daily consumption of tomato juice by adults and children under three years of age, as well as tenuazonic acid when consuming tomato juice contaminated at the 95^th percentile level as part of the diet in organized groups for orphans and children without parental care.

Keywords:Alternaria toxins; tenuazonic acid; altenuene; alternariol; tomato products; contamination; HPLC-MS/MS; risk assessment

Микотоксины - токсичные метаболиты плесневых грибов - наиболее опасные природные загрязнители продовольственного сырья. Контроль загрязнения ими сельскохозяйственной продукции является условием предупреждения недопустимого риска, связанного с вредным воздействием на человека и будущие поколения. Наиболее распространенными микотоксинами являются токсины грибов рода Fusarium, Alternaria, Aspergillus и Penicillium.

Помидоры и продукты их переработки широко производятся и потребляются во всем мире. В 2020 г. производство томатов занимало 1-е место среди овощных культур в мире [1]. По данным Минсельхоза России, урожай овощей в круглогодичных теплицах в 2022 г. значительно увеличился [2]. Около 70% продукции томатов предназначено для переработки на пюре, мякоть, соусы, соки и кетчупы.

Кетчуп является вторым по популярности соусом в России после майонеза. В 2022 г. российскими предприятиями было выпущено кетчупа и томатных соусов на 12,1% больше по сравнению с 2021 г. Потребление кетчупа занимает почти 13% от объема всех соусов и специй, продаваемых в России [3].

Известно, что микроскопические грибы Alternaria spp. являются основной причиной альтернариоза (сухая пятнистость) на свежих томатах, как в поле, так и после сбора урожая [4-6]. По нашим данным, в свежих томатах обнаруживали тентоксин (TEN, частота обнаружения - 27%), альтернариол (АОН, 9%) и тенуазоновую кислоту (ТеА, 9%); в плесневелых томатах частота загрязнения и уровни альтернариатоксинов значительно выше [7].

Установлена загрязненность микотоксинами Alternaria (альтернариатоксины, АТ) различных томатных продуктов [8-11]. По данным Европейского агентства по безопасности пищи (EFSA), АОН и ТеА наиболее распространены среди АТ. Их обнаруживали чаще в зерновых, томатах и продуктах их переработки [12, 13].

В тесте Эймса и на культурах клеток млекопитающих (в экспериментах in vitro) было установлено, что AOH и метиловый эфир альтернариола (AME) обладают мутагенными и генотоксическими свойствами. Получены единичные данные о степени токсичности АТ в экспериментах in vivo. Так, LD₅₀ при пероральном введении мышам и крысам натриевой соли ТеА составила 81-186 мг/кг массы тела в сутки. Таким образом, данное вещество относится к веществам 3-го класса опасности [14, 15]. Употребление загрязненной АТ пищи рассматривают как возможную причину высокой заболеваемости раком пищевода в провинции Хэнань (Китай) [16, 17]. Высокую степень загрязненности пищевых продуктов ТеА связывают с развитием тяжелого заболевания Оньялаи (onyalai; purpura thrombopenica tropica acuta; острая тропическая тромбоцитопеническая пурпура), встречающегося в странах Африки к югу от пустыни Сахара [18].

В Российской Федерации ранее не изучали загрязненность токсинами грибов рода Alternaria продуктов переработки томатов. Учитывая, что, по данным EFSA, томаты и продукты из них являются одними из основных источников воздействия АТ с пищей на человека, целью данной работы было изучение частоты и уровня загрязнения ими томатной пасты, кетчупа и томатных соков, реализуемых на территории России, и провизорная оценка потенциального риска здоровью для населения России.

Материал и методы

Образцы продуктов переработки томатов покупали на предприятиях розничной торговли Москвы и Московской области случайным образом. Исследовано 64 пробы продукции: 22 образца томатной пасты, 20 образцов кетчупа и 22 образца томатного сока отечественного и импортного производства.

Подготовку образцов для скрининга АТ в продуктах из томатов проводили в соответствии с разработанной методикой. В пробирку типа фалькон объемом 50 см³ отбирали измельченную пробу массой 5 г, добавляли 5 см³ дистиллированной воды (только для кетчупа и томатной пасты) и перемешивали, добавляли 10 см³ ацетонитрила, подкисленного 1% муравьиной кислотой, после 1 мин перемешивания на вортексе встряхивали на шейкере в течение 10 мин. Добавляли 1 г NaCl и 4 г безводного MgSO₄, интенсивно перемешивая вручную или на вортексе. Экстракт центрифугировали в течение 5 мин при 7000 об/мин на центрифуге Rotina 38 (Hettich, Германия), затем отбирали 1 см³ супернатанта и упаривали досуха на роторном испарителе (Rotovac, Германия). После этого перерастворяли в 500 мм³ смеси ацетонитрил : вода (20:80 об.). Полученный раствор переносили в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 см³ и центрифугировали в течение 10 мин при 15 000 об/мин на центрифуге (Thermo Scientific, США). В хроматографическую виалу вносили 100 мм³ супернатанта, после добавления 100 мм³ метанола проводили идентификацию и количественное определение АТ методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) в режиме положительной электрораспылительной ионизации при атмосферном давлении и динамического мониторинга выбранных переходов.

Анализ АТ проводили с использованием ВЭЖХ-системы (Agilent Technologies 1100), состоящей из градиентного насоса, термостата колонок, автосамплера и соединенной с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором (Triple Quad 6400). Разделение аналитов осуществляли на колонке, заполненной силикагелем с привитыми группами октадецилсилана (Zorbax SB-С18, 150×4,6 мм, 3,5 мкм, размер пор - 80Å, Agilent), в режиме градиентного элюирования смесью вода : ацетонитрил, модифицированной 0,1% муравьиной кислотой.

Использованы стандарты: AOH (99,3%), AME (99,77%), альтенуен (ALT) (98%), тентоксин (ТЕN) (99,84%) (Fermentek, Израиль). Исходные растворы этих токсинов готовили в метаноле в концентрации 200 мкг/cм³.

Стандарт ТеА с концентрацией 100,6 мкг/cм³ был получен из компании Romer (Romer Labs, Biopure, Австрия). Все исходные растворы хранили при -18 °C.

Матричный эффект для всех токсинов, кроме ТеА, был незначительным и не превышал 18%, для ТеА составил 30%. Степени извлечения токсинов варьировали от 86% (ТеА) до 110% (АМЕ). Пределы количественного определения метода для TEN, AME, AOH, ALT и TeA составили 1, 4, 6, 8 и 20 мкг/кг соответственно.

Оценку риска здоровью, обусловленного загрязненностью АТ томатного сока, проводили на основании сравнения величины суточного поступления АТ с величиной суточного порога их токсического воздействия (ТТС) на человека. Расчетное суточное поступление токсинов с томатным соком рассчитывали по формуле:

где N_расч. - расчетное суточное поступление АТ, нг/кг массы тела; M - среднее содержание АТ в томатном соке, мкг/дм³; Р - потребление томатного сока, см³/сут; w - масса тела, кг.

References

1. Tutova T.N., Nesmelova L.A. Analysis of world production of vegetable crops. Vestnik Izhevskoy gosudarstvennoy sel’skokhozyaystvennoy akademii [Bulletin of Izhevsk State Agricultural Academy]. 2022; 4 (72): 41–9. DOI: https://doi.org/10.48012/1817-5457_2022_4_41-49 (in Russian)

2. URL: https://www.retail.ru/rbc/pressreleases/situatsiya-na-rynke-tomatov

3. Mekhed’kin A.A. World spice market analysis. Upravlenie riskami v APK [Risk Management in Agribusiness]. 2019; (5): 50–63. URL: http://www.agrorisk.ru/20190505 (in Russian)

4. Andersen B., Frisvad J.C. Natural occurrence of fungi and fungal metabolites in moldy tomatoes. J Agric Food Chem. 2004; 52: 7507−13. DOI: https://doi.org/10.1021/jf048727k

5. da Cruz Cabral L., Rodríguez A., Delgado J., Patriarca A. Understanding the effect of postharvest tomato temperatures on two toxigenic Alternaria spp. strains: growth, mycotoxins and cell-wall integrity-related gene expression. J Sci Food Agric. 2019; 99: 6689–95. DOI: https://doi.org/10.1002/jsfa.9950

6. Bertuzzi T., Rastelli S., Pietri A., Giorni P. Alternaria toxins in tomato products in Northern Italy in the period 2017–2019. Food Addit Contam Part B Surveill. 2021; 14 (3): 170–6. DOI: https://doi.org/10.1080/19393210.2021.1895325

7. Chaliy Z.A., Sokolov I.E. Analysis of mycotoxin’s contamination of tomato. In: Materials of the V School of Young Scientists «Fundamentals of healthy eating and ways to prevent alimentary-dependent diseases». Moscow, 2022: 106–7. ISBN 978-5-990949-8-9. (in Russian)

8. Terminiello L., Patriarca A., Pose G., Fernandez Pinto V. Occurrence of alternariol, alternariol monomethyl ether and tenuazonic acid in Argentinean tomato puree. Mycotoxin Res. 2006; 22 (4): 236–40. DOI: https://doi.org/10.1007/BF02946748

9. Lopez P., Venema D., Rijk T., de Kok A., Scholten J.M., Mol H.G.J., de Nijs M. Occurrence of Alternaria toxins in food products in the Netherlands. Food Control. 2016; 60: 196–204. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2015.07.032

10. Walravens J., Mikula H., Rychlik M., Asam S., Devos T., Njumbe Ediage E., et al. Validated UPLC-MS/MS methods to quantitate free and conjugated Alternaria toxins in commercially available tomato products and fruit and vegetable juices in Belgium. J Agric Food Chem. 2016; 64 (24): 5101–9. DOI: https://doi.org/1021/acs.jafc.6b01029

11. Puntscher H., Kütt M.L., Skrinjar P., Mikula H., Podlech J., Fröhlich J., et al. Tracking emerging mycotoxins in food: development of an LC-MS/MS method for free and modified Alternaria toxins. Anal Bioanal Chem. 2018; 410: 4481–94. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-018-1105-8

12. EFSA (European Food Safety Authority); Arcella D., Eskola M., Gomez Ruiz J.A. Dietary exposure assessment to Alternaria toxins in the European population. EFSA J. 2016; 14 (12): е04654. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2016.4654

13. Bernal R.Á.R., Reynoso C.M., Londoño G.V.A., Broggi L.E., Resnik S.L. Alternaria toxins in Argentinean wheat, bran, and flour. Food Addit Contam Part B Surveill. 2019; 12: 24–30. DOI: https://doi.org/10.1080/19393210.2018.1509900

14. EFSA on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific Opinion on the risks for animal and public health related to the presence of Alternaria toxins in feed and food. EFSA J. 2011; 9 (10): 2407. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2011.2407

15. Mujahid C., Savoy M-C., Baslé Q., Woo P.M., Ee E.C.Y., Mottier P., et al. Levels of Alternaria toxins in selected food commodities including green coffee. Toxins. 2020; 12: 595. DOI: https://doi.org/10.3390/toxins12090595

16. Liu G.T., Qian Y.Z., Zhang P., Dong W.H., Qi Y.M., Guo H.T. Etiologic role of Alternaria alternata in human esophageal cancer. Chin Med J. 1992; 105 (5): 394–400.

17. Chen A., Mao X., Sun Q., Wei Z., Li J., You Y., et al. Alternaria mycotoxins: an overview of toxicity, metabolism, and analysis in food. J Agric Food Chem. 2021; 69 (28): 7817–30. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.1c03007

18. de Oliveira R.C., Carnielli-Queiroz L., Correa B. Epicoccum sorghinum in food: occurrence, genetic aspects and tenuazonic acid production. Curr Opin Food Sci. 2018; 23: 44–8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cofs.2018.05.011

19. Asam S., Rychlik M. Recent developments in stable isotope dilution assays in mycotoxin analysis with special regard to Alternaria toxins. Anal Bioanal Chem. 2015; 407 (25): 7563–77. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-015-8904-y

20. Lohrey L., Marschik S., Cramer B., Humpf H.-U. Large-scale synthesis of isotopically labeled 13C2-tenuazonic acid and development of a rapid HPLC-MS/MS method for the analysis of tenuazonic acid in tomato and pepper products. J Agric Food Chem. 2013; 61: 114–20. DOI: https://doi.org/10.1021/jf305138k

21. Haro M.L.M., Cabrera G., Pinto V.F., Patriarca A. Alternaria toxins in tomato products from the Argentinean market. Food Control. 2023; 147: 109607. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2023.109607

22. Ji X., Deng T., Xiao Y., Jin C., Lyu W., Wu Z., et al. Emerging Alternaria and Fusarium mycotoxins in tomatoes and derived tomato products from the China market: occurrence, methods of determination, and risk evaluation. Food Control. 2023; 145: 109464. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2022.109464

23. Woo S.Y., Lee S.Y., Jeong T.K., Park S.M., Auh J.H., Shin H.-S., et al. Natural occurrence of Alternaria toxins in agricultural products and processed foods marketed in South Korea by LC-MS/MS. Toxins (Basel). 2022; 14 (12): 824. DOI: https://doi.org/10.3390/toxins14120824

24. Zhao K., Shao B., Yang D., Li F. Natural occurrence of four Alternaria mycotoxins in tomato- and citrus-based foods in China. J Agric Food Chem. 2015; 63 (1): 343–8. DOI: https://doi.org/10.1021/jf5052738 PMID: 25520156.

25. Zhao K., Shao B., Yang D., Li F., Zhu J. Natural occurrence of Alternaria toxins in wheat-based products and their dietary exposure in China. PLoS One. 2015; 10: e0132019. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0132019

26. Hickert S., Krug I., Cramer B., Humpf H.-U. Detection and quantitative analysis of the non-cytotoxic allo-tenuazonic acid in tomato products by stable isotope dilution HPLC-MS/MS. J Agric Food Chem. 2015; 63: 10 879–84. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.5b04812

27. Crudo F., Varga E., Aichinger G., Galaverna G., Marko D., Dall’Asta C., et al. Co-occurrence and combinatory effects of Alternaria mycotoxins and other xenobiotics of food origin: current scenario and future perspectives. Toxins. 2019; 11: 640. DOI: https://doi.org/10.3390/toxins11110640

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.