Influence of lactoferrin and enzymatiс hydrolysates of cow’s and mare’s milk proteins on anaphylactic sensitivity and cytokine profile of rats

• Elena S. Simonenko
• Sergey V. Simonenko
• Ivan V. Gmoshinski
• Nikolay A. Riger
• Antonina A. Shumakova
• Sergey N. Zorin

Abstract

The development of innovative ingredients of specialized formula for children with intolerance to cow’s milk proteins requires accounting the influence of the protein component on the allergic sensitivity.

The aim of the research was to study the effect of lactoferrin (LF) from cow colostrum, cow’s milk protein hydrolysate (CMPH) and mare’s milk protein hydrolysate (MMPH) on the severity of the systemic anaphylaxis reaction, the levels of specific IgG antibodies and cytokines in rats parenterally sensitized with ovalbumin (OVA).

Material and methods. The experiment was carried out on 4 groups of 26 male Wistar rats, which were sensitized intraperitoneally with chicken egg OVA and a systemic anaphylaxis reaction was induced on the day 29 by intravenous administration of a challenge dose of the antigen (6 mg per kg body weight). LF, CMPH and MMPH were introduced into the diet in doses of 1.4–2 g/kg body weight per day (on an average 1.59±0.04, 1.53±0.05 and 1.48±0.05 g per kg body weight respectively). The content of IgG antibodies in the blood serum was determined by an indirect ELISA; the levels of cytokines IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12(p70), IL-13, GM-CSF, IFN-γ and TNF-α were detected by multiplex immunoassay.

Results. Dietary LF did not have a significant effect on the severity of active anaphylactic shock (AAS), concentrations of antibodies and cytokines in the blood of animals. As a result of CMPH consumption, there were no significant changes in AAS severity and IgG antibodies to OVA but significant increase in TNF-α level was observed as well as a significant decrease in IL-1α (p<0.05). In animals receiving MMPH, there were also no significant changes in the severity of AAS, but a 1.9-fold decrease in the level of IgG antibodies to OVA (p<0.001) was noticed along with a significant increase in IL-12(p70) (p<0.05) and IL-10 (p<0.10) level.

Conclusion. Cosumption of LF by sensitized rats didn’t significantly affect their anaphylactic sensitivity and cytokine profile, while CMPH intake induced some signs of pro-inflammatory processes. Consumption of MMPH was accompanied by the formation of an anti-inflammatory cytokine profile, which corresponds to a decrease in the intensity of the humoral immune response to the model allergen. Differences in the effects of two hydrolisates, which have similar degrees of hydrolysis, may be associated with the specific composition of glycopeptides formed during the enzymatic cleavage of milk protein produced by these two species of dairy animals.

Keywords:food allergy; hypoallergenic formula; hydrolysate; mare’s milk; cow’s milk; lactoferrin; systemic anaphylaxis; T-lymphocytes; cytokines

References

1. Kozlova E.V., Borovik T.E., Zvonkova N.G., Fisenko A.P., Bushueva T.V., Skvortsova V.A., et al. Nutritional status in children with atopic dermatitis caused by food allergies. Pediatriya. Zhurnal imeni G.N. Speranskogo [Pediatrics. Journal named after G.N. Speransky]. 2021; 100 (2): 119–26. DOI: https://doi.org/10.24110/0031-403X-2021-100-2-119-126 (in Russian)

2. Bright D.M., Stegall H.L., Slawson D.C. Food allergies: diagnosis, treatment, and prevention. Am Fam Physician. 2023; 108 (2): 159–65.

3. D’Auria E., Salvatore S., Acunzo M., Peroni D., Pendezza E., Di Profio E., et al. Hydrolysed formulas in the management of cow’s milk allergy: new insights, pitfalls and tips. Nutrients. 2021; 13 (8): 2762. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13082762

4. Musaev A., Sadykova S., Anambayeva A., Saizhanova M., Balkanay G., Kolbaev M. Mare’s milk: composition, properties, and application in medicine. Arch Razi Inst. 2021; 76 (4): 1125–35. DOI: https://doi.org/10.22092/ari.2021.355834.1725

5. Ke C., Lan Z., Hua L., Ying Z., Humina X., Jia S., et al. Iron metabolism in infants: influence of bovine lactoferrin from iron-fortified formula. Nutrition. 2015; 31 (2): 304–9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.nut.2014.07.006

6. Chichlowski M., Bokulich N., Harris C.L., Wampler J.L., Li F., Berseth C.L., et al. Effect of bovine milk fat globule membrane and lactoferrin in infant formula on gut microbiome and metabolome at 4 months of age. Curr Dev Nutr. 2021; 5 (5): nzab027. DOI: https://doi.org/10.1093/cdn/nzab027

7. Björmsjö M., Hernell O., Lönnerdal B., Berglund S.K. Immunological effects of adding bovine lactoferrin and reducing iron in infant formula: a randomized controlled trial. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2022; 74 (3): e65–72. DOI: https://doi.org/10.1097/MPG.0000000000003367

8. Colombo J., Harris C.L., Wampler J.L., Zhuang W., Shaddy D.J., Liu B.Y., et al. Improved neurodevelopmental outcomes at 5.5 years of age in children who received bovine milk fat globule membrane and lactoferrin in infant formula through 12 months: a randomized controlled trial. J Pediatr. 2023; 261: 113483. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jpeds.2023.113483

9. Lalles J.P., Dreau D., Salmon H., Toullec R. Identification of soyabean allergens and immune mechanisms of dietary sensitivities in preruminant calves. Res Vet Sci. 1996; 60 (2): 111–6. DOI: https://doi.org/10.1016/s0034-5288(96)90003-x

10. Shaternikov V.A. The role of food proteins in immunological and allergic reactions. Vestnik AMN SSSR [Bulletin of the USSR Academy of Medical Sciences]. 1986; (11): 34–9. (in Russian)

11. Aiuti F., Paganelli R. Food allergy and gastrointestinal diseases. Ann Allergy. 1983; 51 (2 pt 2): 275–80.

12. Kazemi S., Danisman E., Epstein M.M. Animal models for the study of food allergies. Curr Protoc. 2023; 3 (3): e685. DOI: https://doi.org/10.1002/cpz1.685

13. Murashev A.N., Korshunov V.A., Khokhlova O.N., Rzhevsky D.I., Gmoshinsky I.V., Lysikov Yu.A., et al. Quantitative characteristics of the systemic anaphylaxis model in Sprague-Dawley rats. Rossiyskiy fiziologicheskiy zhurnal imeni I.M. Sechenova [Russian Journal of Physiology named after I.M. Sechenov]. 2000; 86 (2): 190–5. (in Russian)

14. Jensen S.A., Fiocchi A., Baars T., Jordakieva G., Nowak-Wegrzyn A., Pali-Schöll I., et al. Diagnosis and rationale for action against cow’s milk allergy (DRACMA) guidelines update – III – cow’s milk allergens and mechanisms triggering immune activation. World Allergy Organ J. 2022; 15 (9): 100668. DOI: https://doi.org/10.1016/j.waojou.2022.100668

15. Kamath S.D., Bublin M., Kitamura K., Matsui T., Ito K., Lopata A.L. Cross-reactive epitopes and their role in food allergy. J Allergy Clin Immunol. 2023; 151 (5): 1178–90. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2022.12.827

16. Villa C., Costa J., Oliveira M., Mafra I. Bovine milk allergens: a comprehensive review. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2018; 17 (1): 137–64. DOI: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12318

17. Losada Méndez J., Palomares F., Gómez F., Ramírez-López P., Ramos-Soriano J., Torres M.J., et al. Immunomodulatory response of Toll-like receptor ligand-peptide conjugates in food allergy. ACS Chem Biol. 2021; 16 (11): 2651–64. DOI: https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00765

18. Zhu Q., Wang J., Ma J., Sheng X., Li F. Changes in inflammatory factors in the Brown Norway rat model of food allergy. BMC Immunol. 2021; 22 (1): 8. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-021-00398-9

19. Figueroa-Lozano S., Valk-Weeber R.L., Akkerman R. Abdulahad W., van Leeuwen S.S., Dijkhuizen L., et al. Inhibitory effects of dietary N-glycans from bovine lactoferrin on Toll-like receptor 8; comparing efficacy with chloroquine. Front Immunol. 2020; 11: 790. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00790

20. Borovik T.E, Makarova S.G., Darchiya S.N., Gamaleyeva A.V. The role of compounds based on hydrolyzed protein in prophylaxis and diet treatment of alimentary allergy in infants. Voprosy sovremennoy pediatrii [Problems of Modern Pediatrics]. 2010; 9 (1): 150–6. (in Russian)

Кроме того, концентрация ИЛ-10 и ИЛ-1a в сыворотке крыс, потреблявших с кормом ГБКМ, была достоверно снижена по сравнению с показателями животных, получавших ГБКобМ (соответственно в 1,33 раза; p<0,05 и в 1,55 раза, p=0,05). При этом уровень ИЛ-5 был статистически значимо выше у крыс, получавших ГКМБ, по сравнению с таковым у животных, получавших ЛФ (в 1,19 раза; p<0,05).

Обсуждение

Проведенные исследования показали, что у сенсибилизированных крыс, получавших рацион с добавлением ЛФ из коровьего молозива в дозе, которая в расчете на 1 кг массы тела была значительно (приблизительно 10-кратно) аггравирована в сравнении с потреблением этого белка детьми в составе смесей для искусственного вскармливания, не наблюдалось достоверного изменения аллергической реактивности (тяжести реакции системной анафилаксии на модельный пищевой антиген), достоверного изменения ответа специфических антител IgG к ОВА и уровней про- и противовоспалительных цитокинов в сравнении с крысами, получающими контрольный сбалансированный рацион. Этот результат показывает, что включение ЛФ в состав детских формул, по-видимому, не повлечет за собой утяжеления аллергических реакций на такие белки, как b-лактоглобулин, a-лактальбумин, a_s-казеин и другие наиболее значимые [14] аллергены коровьего молока. Вместе с тем вопрос о возможности развития аллергической реакции у ребенка собственно на ЛФ, входящий в состав смеси, в рамках использования данной in vivo модели остается открытым. Простейший способ установить наличие у ЛФ собственных аллергенных свойств - это проведение скрининга перекрестно реагирующих антител класса IgE к этому белку у пациентов с поливалентной пищевой сенсибилизацией [15], что является предметом дальнейших исследований. Однако уместно отметить, что ЛФ не рассматривается в числе наиболее клинически значимых аллергенов коровьего молока [16], вероятно, это связано с его низким содержанием в сыворотке зрелого молока и, соответственно, смесей на его основе или с низкой резистентностью антигенных структур этого белка к термической инактивации [15]. При этом возможность включения нативного ЛФ в состав гипоаллергенных смесей на основе глубоких гидролизатов белка или аминокислотных смесей, предназначенных для детей с поливалентной пищевой аллергией, в настоящее время не рассматривается даже теоретически.

В случае включения в рацион крыс ГБКМ значимых изменений в тяжести реакции анафилаксии и ответа специфических антител IgG к ОВА также не было выявлено. Стоит отметить, что потребление этого продукта сенсибилизированными животными приводит к возрастанию у них уровня ФНОa при снижении концентрации ИЛ-1a и существенно меньшем, по сравнению с группой ГБКобМ, уровне ИЛ-10. Это может указывать на наличие провоспалительного эффекта веществ, входящих в состав ГБКМ (предположительно, гликопептидов), реализуемого через систему Toll-подобных рецепторов определенных субпопуляций Th2-хелперных лимфоцитов [17-19]. Тот факт, что эти изменения у животных данной группы не приводили к достоверным изменениям аллергической чувствительности к гетерологичному пищевому аллергену (ОВА), вводимому парентерально, не позволяет исключить возможности возникновения подобных проблем при длительной пероральной экспозиции различными пищевыми белками. В этой связи уместно подчеркнуть, что имеющиеся клинические рекомендации не предусматривают возможность использования частичного ГБКМ в составе питания пациентов, страдающих тяжелой формой аллергии к белкам коровьего молока. Для этой цели рекомендуются только глубокие гидролизаты на казеиновой основе или аминокислотные смеси [20]. Однако использование данного частичного гидролизата для продуктов с пониженной аллергенностью допустимо и является перспективным направлением.

Включение ГБКобМ в рацион крыс не вызывало у них достоверного изменения тяжести реакции анафилаксии, но сопровождалось снижением ответа антител IgG к ОВА, возрастанием концентрации ИЛ-12(p70) и выраженной тенденцией к увеличению продукции ИЛ-10 при сравнении как с контролем, так и с группой, получавшей ГБКМ. Повышенная продукция ИЛ-10 в данном случае может быть результатом взаимодействия специфических гликопептидов ГБКобМ (по-видимому, отсутствующих в ГБКМ) с различными типами Toll-подобных рецепторов дендритных клеток, индуцирующего их специфическое созревание, стимулирующего пролиферацию Т-клеток и созревание Treg-клеток [17]. Увеличение активности Treg-клеток и рост уровня ИЛ-10 через сигнальные пути с регуляторным участием Toll-подобных рецепторов может подавлять секрецию цитокинов, презентацию антигенов, активацию CD4⁺-Т-клеток и, как следствие, ограничивать продукцию специфических антител.

Полученный результат указывает на наличие у ГБКобМ, в отличие от ГБКМ, имеющего близкую степень гидролиза и молекулярно-массовое распределение пептидных фрагментов, определенного потенциала десенсибилизирующего действия, обусловленного видовыми особенностями состава белков молока коровы и лошади, принадлежащих к разным отрядам класса млекопитающих. Это открывает перспективы для разработки и клинических испытаний инновационных гипоаллергенных продуктов, в том числе смесей - заменителей грудного молока, с использованием ГБКобМ в качестве их белкового компонента.

Заключение

Проведенные исследования показали, что все 3 тестированных белковых ингредиента: ЛФ из коровьего молозива, ГБКМ и ГБКобМ - не увеличивают анафилактическую чувствительность животных на модели системной анафилаксии и могут быть рекомендованы для использования в специализированных пищевых продуктах для детского питания с пониженной аллергенностью, в том числе смесях для искусственного вскармливания детей, не страдающих непереносимостью молока и поливалентной сенсибилизацией. При этом у ГБКобМ выявлен определенный потенциал десенсибилизирующего действия по данным его влияния на продукцию cпецифических антител к модельному аллергену, цитокинов ИЛ-1a, ИЛ-10, ИЛ-12(p70), что открывает перспективы его использования в гипоаллергенных продуктах, доказательство клинической эффективности которых должно быть предметом отдельного исследования.

¹ МУ 2.3.2.2306-07 "Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения".

Литература

1. Козлова Е.В., Боровик Т.Э., Звонкова Н.Г., Фисенко А.П., Бушуева Т.В., Скворцова В.А. и др. Нутритивный статус у детей с атопическим дерматитом, обусловленным пищевой аллергией // Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2021. Т. 100, № 2. С. 119-126. DOI: https://doi.org/10.24110/0031-403X-2021-100-2-119-126

2. Bright D.M., Stegall H.L., Slawson D.C. Food allergies: diagnosis, treatment, and prevention // Am. Fam. Physician. 2023. Vol. 108, N 2. P. 159-165.

3. D’Auria E., Salvatore S., Acunzo M., Peroni D., Pendezza E., Di Profio E. et al. Hydrolysed formulas in the management of cow’s milk allergy: new insights, pitfalls and tips // Nutrients. 2021. Vol. 13, N 8. P. 2762. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13082762

4. Musaev A., Sadykova S., Anambayeva A., Saizhanova M., Balkanay G., Kolbaev M. Mare’s milk: composition, properties, and application in medicine // Arch. Razi Inst. 2021. Vol. 76, N 4. P. 1125-1135. DOI: https://doi.org/10.22092/ari.2021.355834.1725

5. Ke C., Lan Z., Hua L., Ying Z., Humina X., Jia S. et al. Iron metabolism in infants: influence of bovine lactoferrin from iron-fortified formula // Nutrition. 2015. Vol. 31, N 2. P. 304-309. DOI: https://doi.org/10.1016/j.nut.2014.07.006

6. Chichlowski M., Bokulich N., Harris C.L., Wampler J.L., Li F., Berseth C.L. et al. Effect of bovine milk fat globule membrane and lactoferrin in infant formula on gut microbiome and metabolome at 4 months of age // Curr. Dev. Nutr. 2021. Vol. 5, N 5. Article ID nzab027. DOI: https://doi.org/10.1093/cdn/nzab027

7. Björmsjö M., Hernell O., Lönnerdal B., Berglund S.K. Immunological effects of adding bovine lactoferrin and reducing iron in infant formula: a randomized controlled trial // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2022. Vol. 74, N 3. P. e65-e72. DOI: https://doi.org/10.1097/MPG.0000000000003367

8. Colombo J., Harris C.L., Wampler J.L., Zhuang W., Shaddy D.J., Liu B.Y. et al. Improved neurodevelopmental outcomes at 5.5 years of age in children who received bovine milk fat globule membrane and lactoferrin in infant formula through 12 months: a randomized controlled trial // J. Pediatr. 2023. Vol. 261. Article ID 113483. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jpeds.2023.113483

9. Lalles J.P., Dreau D., Salmon H., Toullec R. Identification of soyabean allergens and immune mechanisms of dietary sensitivities in preruminant calves // Res. Vet. Sci. 1996. Vol. 60, N 2. P. 111-116. DOI: https://doi.org/10.1016/s0034-5288(96)90003-x

10. Шатерников В.А. Роль пищевых белков в иммунологических и аллергических реакциях // Вестник АМН СССР. 1986. № 11. С. 34-39.

11. Aiuti F., Paganelli R. Food allergy and gastrointestinal diseases // Ann. Allergy. 1983. Vol. 51, N 2. Pt 2. P. 275-280.

12. Kazemi S., Danisman E., Epstein M.M. Animal models for the study of food allergies // Curr. Protoc. 2023. Vol. 3, N 3. P. e685. DOI: https://doi.org/10.1002/cpz1.685

13. Мурашев А.Н., Коршунов В.А., Хохлова О.Н., Ржевский Д.И., Гмошинский И.В., Лысиков Ю.А. и др. Количественная характеристика модели системной анафилаксии у крыс линии Спрейг-Доули // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 2000. Т. 86, № 2. С. 190-195.

14. Jensen S.A., Fiocchi A., Baars T., Jordakieva G., Nowak-Wegrzyn A., Pali-Schöll I. et al. Diagnosis and rationale for action against cow’s milk allergy (DRACMA) guidelines update - III - cow’s milk allergens and mechanisms triggering immune activation // World Allergy Organ. J. 2022. Vol. 15, N 9. Article ID 100668. DOI: https://doi.org/10.1016/j.waojou.2022.100668

15. Kamath S.D., Bublin M., Kitamura K., Matsui T., Ito K., Lopata A.L. Cross-reactive epitopes and their role in food allergy // J. Allergy Clin. Immunol. 2023. Vol. 151, N 5. P. 1178-1190. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2022.12.827

16. Villa C., Costa J., Oliveira M., Mafra I. Bovine milk allergens: a comprehensive review // Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2018. Vol. 17, N 1. P. 137-164. DOI: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12318

17. Losada Méndez J., Palomares F., Gómez F., Ramírez-López P., Ramos-Soriano J., Torres M.J. et al. Immunomodulatory response of Toll-like receptor ligand-peptide conjugates in food allergy // ACS Chem. Biol. 2021. Vol. 16, N 11. P. 2651-2664. DOI: https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00765

18. Zhu Q., Wang J., Ma J., Sheng X., Li F. Changes in inflammatory factors in the Brown Norway rat model of food allergy // BMC Immunol. 2021. Vol. 22, N 1. P. 8. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-021-00398-9

19. Figueroa-Lozano S., Valk-Weeber R.L., Akkerman R. Abdulahad W., van Leeuwen S.S., Dijkhuizen L. et al. Inhibitory effects of dietary N-glycans from bovine lactoferrin on Toll-like receptor 8; comparing efficacy with chloroquine // Front. Immunol. 2020. Vol. 11. P. 790. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00790

20. Боровик Т.Э., Макарова С.Г., Дарчия С.Н., Гамалеева А.В. Роль смесей - гидролизатов белка в профилактике и диетотерапии пищевой аллергии у детей раннего возраста // Вопросы современной педиатрии. 2010. Т. 9, № 1. С. 150-156.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.