Analysis of the properties of Komagataella phaffii CF-st401, a genetically modified producer of the sweet protein brazzeinby using in silico methods

• Zinaida G. Gureu
• Olga V. Bagryantseva
• Daria S. Novikova
• Sergey A. Khotimchenko

Abstract

Currently, in order to reduce the consumption of mono- and disaccharides in diets, sweeteners are widely used. At the same time, none of the sweeteners approved for food industry usage matches the organoleptic properties of natural sugars. This circumstance was the basis for the development of technology for producing a new type of food ingredient with a sweet taste – brazzein using the producer strain Komagataella phaffii CF-st401.

The purpose of the study was the application of in silico methods to assess the safety of K. phaffii CF-st401 genetically modified (GM) microorganism, which is the producer of the “Sweet protein Brazzein”.

Material and methods. The research object was the map of K. phaffii CF-st401 plasmid obtained by Biryuch LLC as a result of sequencing the plasmid of GM strain K. phaffii CF-st401, including: a synthetic nucleotide sequence similar to the sequence encoding the brazzein protein in the plant (Pentadiplandra brazzeana) and optimized for expression in the DNA of the recipient strain; the nucleotide sequence of plasmid M4794 from Saccharomyces cerevisiae and a linear fragment of the flanking DNA regions from K. phaffii used for integration into the genome of the recipient strain K. phaffii YIB Δleu2 VKPM Y-476, as well as amino acid sequence data of recombinant brazzein. By using bioinformatics methods (in silico), we investigated the DNA structure of the vector sequence of K. phaffii CF-st401, including the presence of operons responsible for toxin production, antibiotic resistance, and allergenicity.

Results. As a result of the studies of K. phaffii CF-st401 vector plasmid, introduced into K. phaffii YIB Δleu2 VKPM Y-4761, it was shown that its regions responsible for the structure of the “Sweet protein Brazzein” coincide by more than 70% with elements of the brazzein P56552 reference protein from the plant P. brazzeana. The absence of selective markers and allergenicity in the vector plasmid was confirmed.

Conclusion. The analysis of the structure of the DNA vector sequence of the K. phaffii CF-st401 GM strain confirmed the feasibility of using bioinformatics methods to predict the properties of technological microorganisms when assessing their safety for consumers.

Keywords: microbial synthesis; genetically modified microorganism; producer strain; Komagataella phaffii; bioinformation analysis methods (in silico); sweetener; brazzein

References

1. Tutelyan V.A., Nikityuk D.B. Key challenges in the dietary intake structure and cutting edge technologies for optimizing nutrition to protect the health of the Russian рopulation. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (1): 6–21. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-1-6-21 (in Russian)

2. Bagryantseva O.V. Study on the development of measures to manage the risks associated with the food produced using microbial synthesis. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2020; 89 (2): 64–76. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10017 (in Russian)

3. Yamada Y., Matsuda M., Maeda K., Mikata K. The phylogenetic relationships of methanol-assimilating yeasts based on the partial sequences of 18S and 26S ribosomal RNAs: the proposal of Komagataella gen. nov. (Saccharomycetaceae). Biosci Biotechnol Biochem. 1995; 59 (3): 439–44. DOI: https://doi.org/10.1271/bbb.59.439

4. De Schutter K., Lin Y.C., Tiels P., Van Hecke A., Glinka S., Weber-Lehmann J., et al. Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nat Biotechnol. 2009; 27 (6): 561–6. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.1544

5. Naumova E.S., Boundy-Mills K.L., Naumov G.I. Phylogenetics and biogeography of biotechnologically important methylotrophic yeast Komagataella. Mikrobiologiya [Microbiology]. 2020; 89 (3): 308–14. DOI: https://doi.org/10.31857/S002636562003012X (in Russian)

6. Valli M., Grillitsch K., Grünwald-Gruber C., Tatto N.E., Hrobath B., Klug L., et al. A subcellular proteome atlas of the yeast Komagataella phaffii. FEMS Yeast Res. 2020; 20 (1): foaa001. DOI: https://doi.org/10.1093/femsyr/foaa001

7. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ord A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly M., et al. Update of the list of qualified presumption of safety (QPS) recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 18: suitability of taxonomic units notified to EFSA until March 2023. EFSA J. 2023; 21 (7): е8092. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2023.8092

8. Bustos C., Quezada J., Veas R., Altamirano C., Braun-Galleani S., Fickers P., et al. Advances in cell engineering of the Komagataella phaffii platform for recombinant protein production. Metabolites. 2022; 12 (4): 346. DOI: https://doi.org/10.3390/metabo12040346

9. Barone G.D., Emmerstorfer-Augustin A., Biundo A., Pisano I., Coccetti P., Mapelli V., et al. Industrial production of proteins with Pichia pastoris – Komagataella phaffii. Biomolecules. 2023; 13 (3): 441. DOI: https://doi.org/10.3390/biom13030441

10. EFSA Panel on Food Contact Materials, Enzymes and Processing Aids (CEP); Silano V., Barat Baviera J.M., Bolognesi C., Brеuschweiler B.J., Cocconcelli P.S., Crebelli R., et al. Safety evaluation of the food enzyme phospholipase C from a genetically modified Komagataella phaffii (strain PRF). EFSA J. 2019; 17 (4): е05682. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2019.5682

11. EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP); Bampidis V., Azimonti G., Bastos M.L., Christensen H., Durjava M., Dusemund B., et al. Efficacy of a feed additive consisting of endo-1,4-beta-xylanase produced by Komagataella phaffii ATCCPTA-127053 (XygestTMHT) for all poultry species (Kemin Europa N.V.). EFSA J. 2023; 21 (6): е08047. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2023.8047

12. Saraiva A., Carrascosa C., Ramos F., Raheem D., Pedreiro S., Vega A., et al. Brazzein and monellin: chemical analysis, food industry applications, safety and quality control, nutritional profile and health impacts. Foods. 2023; 12 (10): 1943. DOI: https://doi.org/10.3390/foods12101943

13. Neiers F., Belloir C., Poirier N., Naumer C., Krohn M., Briand L. Comparison of different signal peptides for the efficient secretion of the sweet-tasting plant protein brazzein in Pichia pastoris. Life (Basel). 2021; 11 (1): 46. DOI: https://doi.org/10.3390/life11010046

14. Zhenga X., Yi T.S. The plastid genome of Pentadiplandra brazzeana Baillon (Pentadiplandraceae). Mitochondrial DNA B Resour. 2019; 4 (2): 4002–3: DOI: https://doi.org/10.1080/23802359.2019.1688102

15. EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS); Younes M., Aggett P., Aguilar F., Crebelli R., Dusemund B., Filipič M., et al. Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavailability of nutrient from the sources (Revision 1). EFSA J. 2021; 19 (3): е06552: DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2021.6552

16. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Ricci A., Allende A., Bolton D., Chemaly M., Davies R., Girones R., et al. Scientific Opinion on the update of the list of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA. EFSA J. 2017; 15 (3): e04664. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2017.4664

17. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ordóñez A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly A., et al. Update of the list of qualified presumption of safety (QPS) recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 19: suitability of taxonomic units notified to EFSA until September 2023. EFSA J. 2024; 22 (1): e8517. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2024.8517

Оценку потенциальной аллергенности белков и пептидов in silico проводили с использованием двух рецензируемых баз данных об аллергенах в соответствии с рекомендациями Комиссии Кодекса Алиментариус и Продовольственной и сельскохозяйственной организации (ФАО)/Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ): Allergome и Allermatch. Потенциальная аллергенность рекомбинантного браззеина была оценена с помощью серии поисков гомологии последовательности с белками аллергенами из базы данных AllergenOnline (https://www.allergome.org/) и базы данных Allermatch (https://allermatch.org/). Поиски гомологии последовательности проводили поэтапно в соответствии с рекомендациями Кодекса Алиментариус и ФАО/ВОЗ с использованием скользящего 80-аминокислотного окна, полученного из полноразмерной последовательности браззеина, а также 8-аминокислотного точного соответствия. Кроме того, был проведен поиск гомологий с полной аминокислотной последовательностью "дикого" браззеина из P. brazzeana. Для скользящего окна с 80 аминокислотами использовали процентный отрезок идентичности в 35% для определения того, существует ли значительная гомология последовательности между браззеином и аллергенным белком. А также рассматривали E-значение и бит-оценку как индикаторы того, отражают ли совпадения биологически значимое сходство (рис. 2).

Для оценки возможных рисков, связанных с интеграцией плазмиды в геном штамма-реципиента, осуществили функциональную и структурную аннотацию плазмиды М4794 и линейного участка ДНК, введенной в геном с использованием трех сервисов для аннотирования последовательностей: bakta web (Software: 1.8.1| DB: 5.0.0), веб-сервиса addgene (https://www.addgene.org/) и локальной программы SnapGene Viewer (версия 7.0.2). Наличие локусов антибиотикоустойчивости оценивали в ResFinder (версия 4.3.3). Полученные результаты сравнивали с информацией, представленной в паспорте штамма ГМ K. phaffii CF-st401.

Общее выравнивание нуклеотидной последовательности встроенного гена "cладкого белка браззеина", оптимизированного для экспрессии в K. phaffii CF-st401, проводили по отношению к белковым молекулам из базы данных UniProtKB/SwissProt. Параметры: матрица замен - BLOSUM 62; длина последовательности запроса - 152; идентификатор запроса: 9947.

Результаты

Результаты геномного анализа гомологии структуры "сладкого белка браззеина", получаемого с использованием K. phaffii CF-st401 и из P. brazzeana

Результат локального выравнивания BLASTX, представленный на рис. 3, свидетельствует о том, что с высокой степенью достоверности синтезированная последовательность ДНК, кодирующая синтез "сладкого белка браззеина", была гомологична анализируемой последовательности ДНК с ДНК дефензиноподобного белка браззеина (Е=1.2е-38) (UniProtKB/Swiss-Prot: P56552.1) из P. brazzeana.

Анализ предсказанной вторичной структуры рекомбинантного белка браззеина из K. phaffii CF-st401 показал, что все ее области находятся в диапазоне pLDDT 70% и выше, что говорит о правильной интерпретации анализируемой векторной последовательности нуклеотидов и достаточной степени гомологии полученной структуры браззеина рекомбинантного с браззеином растительного происхождения (рис. 4).

Оценка аллергенности "сладкого белка браззеина" из K. phaffii CF-st401 в условиях in silico

Совпадения гомологии последовательности встроенного в геном K. phaffii CF-st401 гена браззеина с какими-либо известными аллергенами из базы данных Allergome или базы данных Allermatch имели менее 35% идентичности во всех 80-аминокислотных скользящих окнах. Также не были идентифицированы 8-аминокислотные точные совпадения с какими-либо известными аллергенами. Таким образом, структура вставки ДНК K. phaffii CF-st401 предполагает отсутствие способности "сладкого белка браззеина" вызывать аллергические реакции.

Оценка плазмиды М4794 и линейного участка ДНК (экспрессионной кассеты), использованного для интеграции в геном штамма K. phaffii CF-st401

В соответствии с паспортом размер плазмиды М4794, используемой для включения в геном штамма K. phaffii, составляет 7646 пар оснований и состоит из ряда ключевых структурных элементов. В ходе проводимых исследований была проверена согласованность ключевых элементов плазмиды с заявленной в паспорте информацией. В процессе тестирования плазмиды не обнаружено кассет коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR).

Другие структурные составляющие плазмиды М4794, согласно паспорту K. phaffii CF-st401, представлены геном, кодирующим продукцию 3-изопропилмалат дегидрогеназы из Saccharomyces cerevisiae (LEU2), и экспрессионной кассетой. С использованием методов in silico показано, что экспрессионная кассета состоит из промотора AOX1 из K. phaffii, сигнального пептида полового феромона α-фактора из S. cerevisiae, последовательности белка браззеина из P. brazzeana и терминатора транскрипции AOX1 из K. phaffii и участков хромосом (плечи) - гомологичных последовательностям, предназначенным для включения в геном штамма-реципиента. Таким образом, заявленная структура плазмиды была подтверждена в ходе биоинформационного анализа.

Результаты аннотации нуклеотидной последовательности линейного фрагмента ДНК, использованного для интеграции в геном K. phaffii, подтвердили отсутствие в ее составе гена устойчивости к ампициллину и бактериального ориджина, отвечающего за репликацию pBR322 у K. phaffii CF-st401 (в позиции 5654 и 1222) (рис. 5).

Рис. 5. Позиции элементов эндонуклеаз рестрикции на плазмиде М4794

Fig. 5. Positions of restriction endonuclease elements on plasmid M4794

С использованием методов биоинформационного анализа подтверждено соответствие конструкции векторной последовательности штамма K. phaffii CF-st401 заявленной в паспорте структуре, показана возможность безопасного использования ГМ штамма K. phaffii CF-st401 в производстве "сладкого белка браззеина".

Обсуждение

Изменение последовательности ДНК технологических штаммов в результате мутаций или генетических модификаций может привести не только к увеличению количества продуцируемых ими пищевых компонентов, но и к усилению и/или появлению у них свойств патогенности, антибиотикорезистентности, аллергенности, способности к продукции токсинов, а также к изменению молекулярной структуры синтезируемых ими пищевых веществ. С целью исключения возможного негативного действия таких пищевых компонентов на здоровье потребителей, необходим комплекс токсикологических исследований [7, 11, 16]. В последние годы в ряде стран в процессе анализа свойств микроорганизмов, в том числе технологических, все шире применяются биоинформационные методы [17].

Оценка свойств последовательности нуклеотидов векторной вставки генетически модифицированного микроорганизма K. phaffii CF-st401 - продуцента "сладкого белка браззеина", проведенная с помощью методов in silico, продемонстрировала, что синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая синтез "сладкого белка браззеина", соответствовала на 70% и выше структурной формуле эталонного белка браззеина, получаемого из плодов растения P. brazzeana. Биоинформационный анализ нуклеотидной вставки показал, что исследуемый штамм не способен к продукции токсинов, антибиотиков и аллергенов. Использование методов in silico в качестве скрининговых позволит повысить эффективность и точность проводимых на последующих этапах оценки рисков здоровью потребителей пищевой продукции нового вида, получаемой микробным синтезом.

Заключение

Проведенный анализ структуры векторной последовательности ДНК ГМ-штамма K. phaffii CF-st401 подтвердил обоснованность применения биоинформационных методов для предсказания свойств штаммов-продуцентов пищевых компонентов. Предложенный подход может быть рекомендован для включения в систему оценки безопасности технологических микроорганизмов в Российской Федерации для скринингового исследования их свойств.

Вместе с тем решение о возможности безопасного использования данной формы браззеина может быть принято только после проведения токсикологических исследований in vivo с использованием подопытных животных.

Литература

1. Тутельян В.А., Никитюк Д.Б. Ключевые проблемы в структуре потребления пищевой продукции и прорывные технологии оптимизации питания для здоровьесбережения населения России // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 1. С. 6-21. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-1-6-21

2. Багрянцева О.В. Обоснование необходимости разработки мероприятий по управлению рисками, связанными с использованием пищевой продукции, производимой при помощи микробного синтеза // Вопросы питания. 2020. Т 89, № 2. С 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10017

3. Yamada Y., Matsuda M., Maeda K., Mikata K. The phylogenetic relationships of methanol-assimilating yeasts based on the partial sequences of 18S and 26S ribosomal RNAs: the proposal of Komagataella gen. nov. (Saccharomycetaceae) // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. Vol. 59, N 3. P. 439-444. DOI: https://doi.org/10.1271/bbb.59.439

4. De Schutter K., Lin Y.C., Tiels P., Van Hecke A., Glinka S., Weber-Lehmann J. et al. Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris // Nat. Biotechnol. 2009. Vol. 27, N 6. Р. 561-566. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.1544

5. Наумова Е. С., Боунди-Миллс К.Л., Наумов Г.И. Филогенетика и биогеография важных для биотехнологии метилотрофных дрожжей Komagataella // Микробиология. 2020. T. 89, № 3. С. 308-314. DOI: https://doi.org/10.31857/S002636562003012X

6. Valli M., Grillitsch K., Grünwald-Gruber C., Tatto N.E., Hrobath B., Klug L. et al. A subcellular proteome atlas of the yeast Komagataella phaffii // FEMS Yeast Res. 2020. Vol. 20, N 1. foaa001. DOI: https://doi.org/10.1093/femsyr/foaa001

7. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ord A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly M. et al. Update of the list of qualified presumption of safety (QPS) recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 18: suitability of taxonomic units notified to EFSA until March 2023 // EFSA J. 2023. Vol. 21, N 7. Article ID е8092. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2023.8092

8. Bustos C., Quezada J., Veas R., Altamirano C., Braun-Galleani S., Fickers P. et al. Advances in cell engineering of the Komagataella phaffii platform for recombinant protein production // Metabolites. 2022. Vol. 12, N 4. Р. 346. DOI: https://doi.org/10.3390/metabo12040346

9. Barone G.D., Emmerstorfer-Augustin A., Biundo A., Pisano I., Coccetti P., Mapelli V. et al. Industrial production of proteins with Pichia pastoris - Komagataella phaffii // Biomolecules. 2023. Vol. 13, N 3. Р. 441. DOI: https://doi.org/10.3390/biom13030441

10. EFSA Panel on Food Contact Materials, Enzymes and Processing Aids (CEP); Silano V., Barat Baviera J.M., Bolognesi C., Brеuschweiler B.J., Cocconcelli P.S., Crebelli R. et al. Safety evaluation of the food enzyme phospholipase C from a genetically modified Komagataella phaffii (strain PRF) // EFSA J. 2019. Vol. 17, N 4. Article ID е05682. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2019.5682

11. EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP); Bampidis V., Azimonti G., Bastos M.L., Christensen H., Durjava M., Dusemund B. et al. Efficacy of a feed additive consisting of endo-1,4-beta-xylanase produced by Komagataella phaffii ATCCPTA-127053 (XygestTMHT) for all poultry species (Kemin Europa N.V.) // EFSA J. 2023. Vol. 21, N 6. Article ID е08047. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2023.8047

12. Saraiva A., Carrascosa C., Ramos F., Raheem D., Pedreiro S., Vega A. et al. Brazzein and monellin: chemical analysis, food industry applications, safety and quality control, nutritional profile and health impacts // Foods. 2023. Vol. 12, N 10. Р. 1943. DOI: https://doi.org/10.3390/foods12101943

13. Neiers F., Belloir C., Poirier N., Naumer C., Krohn M., Briand L. Comparison of different signal peptides for the efficient secretion of the sweet-tasting plant protein brazzein in Pichia pastoris // Life (Basel). 2021. Vol. 11, N 1. Р. 46. DOI: https://doi.org/10.3390/life11010046

14. Zhenga X., Yi T.S. The plastid genome of Pentadiplandra brazzeana Baillon (Pentadiplandraceae) // Mitochondrial DNA B Resour. 2019. Vol. 4, N 2. P. 4002-4003: DOI: https://doi.org/10.1080/23802359.2019.1688102

15. EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS); Younes M., Aggett P., Aguilar F., Crebelli R., Dusemund B., Filipič M. et al. Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavailability of nutrient from the sources (Revision 1) // EFSA J. 2021. Vol. 19, N 3. Article ID е06552: DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2021.6552

16. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Ricci A., Allende A., Bolton D., Chemaly M., Davies R., Girones R. et al. Scientific Opinion on the update of the list of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA // EFSA J. 2017. Vol. 15, N 3. Article ID e04664. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2017.4664

17. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ordóñez A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly A. et al. Update of the list of qualified presumption of safety (QPS) recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 19: suitability of taxonomic units notified to EFSA until September 2023 // EFSA J. 2024. Vol. 22, N 1. Article ID e8517. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2024.8517

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.