Protective action of ginseng root extract on myofibril apoptosis and immune response in rats after exhausting physical exercise. Part I. Effect of ginseng root extract on myofibril apoptosis in rats’ gastrocnemius muscle

• Eleonora N. Trushina
• Oksana K. Mustaphina
• Ilya V. Aksenov
• Alexander G. Krasutsky
• Viktor A. Tutelyan
• Dmitriy B. Nikityuk

Abstract

Intense psychophysical loads in athletes are the pathogenetic basis for the development of immune dysfunction, hormonal imbalance, oxidative stress and activation of the process of apoptosis of cells in various organs and tissues, including myofibrils of skeletal muscles. Adaptogens of plant origin, including bioactive compounds (BAC) of ginseng, have long been used by professional athletes to enhance the body’s resistance to stress and improve physical performance. All mechanisms of the adaptogenic effect of ginseng BAS have not been established yet. Of particular relevance is the issue of the effect of ginseng BAC on the damaged structure of skeletal muscle myofibrils and the activity of their regeneration after intense physical exertion in athletes.

The aim of the research was to investigate the effect of intragastric administration of the ginseng root extract (ginsenosides) on the apoptosis of myofibrils in the gastrocnemius muscle of rats after exhausting physical exercise (EPE).

Material and methods. The study was conducted on 5 groups of male Wistar rats with an initial body weight of ≈250 g. The rats received a complete semi-synthetic diet and water ad libitum. After the preparatory stage (1 week of quarantine and 1 week of acclimation to the treadmill), animals of the control (the 1^st) and experimental (the 2, 3, 4 and 5^th) groups were placed on a treadmill for 2 weeks (3 times a week) according to the training program (running duration – 20 min, speed 25 cm/s, treadmill inclination angle 10^o), after the completion of which (except for the control group) a test for EPE was carried out. Thirty minutes before the start of training and EPE, rats of experimental groups 3–5 were intragastrically administered ginseng root extract (GRE) in saline in doses: 2.7 (group 3), 13.5 (group 4), and 27.0 (group 5) mg per kg body weight in terms of ginsenosides; animals of groups 1 and 2 were given saline. Within 30 minutes after EPE cessation, rats were withdrawn from the experiment by decapitation, followed by collection of a sample of the gastrocnemius muscle. The intensity of apoptosis of gastrocnemius muscle myofibrils was studied on the day of slaughter by the flow cytometry method. Myofibrils were stained with annexin V conjugated with fluorochrome and 7-aminoactinomycin vital dye with subsequent detection on an FC-500 flow cytometer.

Results. EPE in rats of the 2^nd group lead to a decrease in the relative content of intact (live) myofibrils of the gastrocnemius muscle (80.51±1.41 vs 88.39±1.04% in the control, p<0.05) and an increase in the proportion of myofibrils in apoptosis (20.06±1.62 vs 11.16±1.14% in the control, p<0.05). Intragastric administration of GRE provided positive dynamics (p<0.05) of an increase in the relative content of intact myofibrils in rats of the 4^th and 5^th groups (85.75±1.22 and 84.60±1.11% respectively) compared with the indicator in rats of the 2^nd group that didn’t receive GRE. The total number of myofibrils in apoptosis in rats of the 2, 3 and 5^th groups after EPE exceeded (p<0.05) the indicator in control rats. GRE administration to the animals of the 4^th (13.5 mg/kg body weight) and the 5^th (27 mg/kg body weight) groups ensured a decrease (p<0.05) of the total number of apoptotic myofibrils compared to rats of the 2^nd group. The minimum dosage of GRE used in rats of the 3^rd group (2.7 mg/kg body weight) did not have a reliable effect on the studied apoptosis indices.

Conclusion. A dose-dependent anti-apoptotic effect of the GRE BAC on the myofibrils of skeletal muscles has been demonstrated on the EPE model in rats. The most pronounced effect was observed with GRE administration at a daily dose of 13.5 mg/kg body weight (in terms of ginsenosides). When using the minimum and maximum GRE dosage (2.7 and 27 mg/kg body weight), the proportion of myofibrils in apoptosis remained elevated relative to the control group. Thus, the data obtained confirm the concept that one of the mechanisms of the adaptogenic effect of ginseng BAC is a decrease in the apoptosis activity in skeletal muscle myofibrils induced by EPE.

Keywords: apoptosis; ginseng root extract; ginsenosides; exhausting physical exercise; gastrocnemius muscle; myofibrils

При интенсивной физической нагрузке генерируется большое количество свободных радикалов, что сопровождается активацией метаболических процессов организма, повышением интенсивности перекисного окисления липидов и карбонилирования белков [1]. Накопление активных форм кислорода (АФК) приводит к окислительному стрессу во многих органах, в том числе в скелетных мышцах. Продукция АФК, вызванная сокращениями миофибрилл во время физической нагрузки умеренной интенсивности, способствует физиологической адаптации скелетных мышц (митохондриальный биогенез, синтез антиоксидантных ферментов и стрессовых белков), тогда как высокий уровень выработки АФК приводит к повреждению макромолекулярных структур (белков, липидов, ДНК) с последующей стимуляцией генов, регулирующих апоптоз [2]. Напротив, апоптоз миофибрилл в условиях регулярных тренировок является физиологическим регуляторным процессом, в результате которого удаляются поврежденные структуры без воспалительной реакции, что обеспечивает оптимальную функцию мышц. Степень выраженности апоптоза в различных типах мышц (медленных мышечных волокнах с аэробной системой окисления и быстрых гликолитических волокнах) определяется их фенотипом и зависит от интенсивности и характера физической нагрузки [3].

Основным патогенетическим фактором активации апоптоза миофибрилл является окислительный стресс. Поскольку митохондрии представляют собой основной источник и мишень АФК, избыток АФК может инициировать увеличение проницаемости мембран митохондрий, открытие митохондриальных Са²⁺-зависимых пор (мPTP), снижение выработки аденозинтрифосфорной кислоты и повышение высвобождения митохондриального цитохрома С (Cyt C - специфический инициирующий фактор) для активации процесса апоптоза [4]. Митохондриальный апоптоз является одной из наиболее распространенных форм запрограммированной гибели клеток. В этом процессе участвуют белки семейства Bcl-2: проапоптотические белки Bax, Bak и анти­апоптотические белки Bcl-2. Белок Вах повышает проницаемость митохондрий с высвобождением цитохрома С в цитоплазму, где он взаимодействует с апоптотическим протеазаактивирующим фактором (apoptotic protease activating factor 1 - Apaf-1) и прокаспазой-9, вызывая конформационные изменения Apaf-1 через домены активации и рекрутирования каспаз (caspase recruitment domains - CARDs) с формированием апоптосом и последующей активацией эффекторных каспаз 3, 6, 7 [5].

Для ослабления или предотвращения мышечного повреждения (микротравмы, апоптоз) у спортсменов широко используются антиоксиданты и адаптогены растительного происхождения [6-8]. Одним из представителей растительных адаптогенов является женьшень. Женьшень содержит различные биологически активные вещества (БАВ), в том числе гинсенозиды, алкалоиды, гликозиды, а также полисахариды и полипептиды, витамины, минеральные вещества, клетчатку [9]. Основным действующим компонентом женьшеня являются гинсенозиды, представляющие собой класс природных стероидных гликозидов и тритерпеноидных сапонинов. Установлено, что потребление экстракта женьшеня спортсменами улучшает энергетический обмен, ослабляет воспалительные реакции, а также оказывает положительное воздействие на кишечную микробиоту [10]. На примере пациентов с саркопенией показана эффективность приема экстракта корня женьшеня (ЭКЖ) в плане улучшения сократительной функции мышц и мышечной регенерации посредством нормализации функции митохондрий и активации дифференцировки миобластов [11].

В России адекватный уровень суточного потребления гинсенозидов для взрослых в составе специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище составляет 5,0 мг, верхний допустимый уровень потребления - 30 мг¹. В исследованиях на добровольцах по изучению влияния ЭКЖ на индуцированное физической нагрузкой повреждение мышц используются его суточные дозировки от 160 мг до 20 г [12], что в случае 10% содержания гинсенозидов примерно соответствует их употреблению в диапазоне 16-2000 мг/сут на человека.

Цель исследования - изучение влияния внутрижелудочного введения ЭКЖ (гинсенозидов) на апоптоз миофибрилл икроножной мышцы крыс после истощающей физической нагрузки (ИФН).

¹ Евразийская экономическая комиссия. Единые санитарно­эпидемиологические и гигиенические требования к продукции (товарам), подлежащей санитарно­эпидемиологическому надзору (контролю).

Материал и методы

Исследование получило одобрение этического комитета ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" и было проведено на 5 группах крыс-самцов линии Wistar (по 8 животных с исходной массой тела ≈250 г), полученных из питомника филиала "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий ФМБА". Обращение с животными осуществляли в соответствии с ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами". Крысы получали полноценный полусинтетический рацион (энергетическая ценность - 3,9 ккал/г) [13] из расчета 20 г/сут сухого корма на крысу, воду - ad libitum. В конце эксперимента отъем корма проводили за 16 ч до забоя. После подготовительного этапа (1 нед карантина и 1 нед привыкания крыс к беговой дорожке) животных контрольной (1-я) и подопытных (2, 3, 4 и 5-я) групп в течение 2 нед (3 раза в неделю) помещали на беговую дорожку в рамках заданной программы тренировок (продолжительность бега - 20 мин, скорость - 25 см/с, угол наклона беговой дорожки - 10°), после завершения которой проводили (за исключением контрольной группы) тест на ИФН [14]. За 30 мин до начала тренировок и ИФН крысам подопытных групп (за исключением 2-й группы) внутрижелудочно вводили ЭКЖ [Tayga (Shanghai) Co., Ltd, КНР; 12,5% гинсенозидов] в физиологическом растворе в дозах 2,7 (3-я группа), 13,5 (4-я группа) и 27,0 (5-я группа) мг на 1 кг массы тела в пересчете на гинсенозиды; животным 1-й и 2-й групп - физиологический раствор. В течение 30 мин после прекращения ИФН крыс выводили из эксперимента декапитацией с последующим отбором образца икроножной мышцы.

Исследование интенсивности апоптоза миофибрилл икроножной мышцы крыс проводили в день забоя методом проточной цитометрии [15]. Окрашивание миофибрилл проводили конъюгированным с флуорохромом аннексином V и витальным красителем 7-аминоактиномицином (Beckman Coulter, США) с последующей детекцией на проточном цитофлуориметре (FC-500, Beckman Coulter, США).

Статистический анализ данных выполняли в рамках сбалансированного рандомизированного однофакторного эксперимента. Фиксированным фактором являлся ЭКЖ. Количество уровней 5: 1-я - контрольная без добавления ЭКЖ и без ИФН; 2-я - опытная без добавления ЭКЖ с ИФН; 3-я - опытная группа с ИФН и введением ЭКЖ в дозе 2,7 мг на 1 кг массы тела в пересчете на гинсенозиды; 4-я - опытная группа с ИФН и введением ЭКЖ в дозе 13,5 мг на 1 кг массы тела в пересчете на гинсенозиды; 5-я - опытная группа с ИФН и введением ЭКЖ в дозе 27 мг на 1 кг массы тела в пересчете на гинсенозиды. При общем размере выборки 40 объектов, при условии, что коэффициент вариации зависимой переменной не превышает 0,3, оценка точности не превышает 0,2 при уровне значимости 0,05, вероятность ошибки второго рода не превышает 0,1, что делает данный эксперимент релевантным и чувствительным в случае, если факторная нагрузка дает достоверный статистический отклик в отношении зависимой переменной. Для проведения параметрических методов анализа использовали критерий Шапиро-Уилка в качестве теста на нормальность. Для проверки на гомоскедастичность проводили тест Левена. В случае выполнения условий параметрического исследования использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). В случае отклонения нуль-гипотезы применяли множественное сравнение средних с использованием критерия Тьюки. В случае применения непараметрических методов анализа использовали аналоги: критерий Краскела-Уоллиса (Н-критерий) с последующей процедурой множественного сравнения по критерию Дана. При множественном сравнении в случае как параметрического, так и непараметрического анализа проводили попарное сравнение: 1-я контрольная - с опытными группами и 2-я группа - с 3-5-й группами. Также сравнивали 1-ю контрольную и 2-ю опытную группы. Различия принимали за достоверные на уровне значимости p<0,05. Расчеты выполняли в пакете программ SPSS 20.0.

Результаты

ИФН у крыс 2-й группы приводила к снижению относительного содержания интактных (живых) миофибрилл икроножной мышцы и возрастанию доли миофибрилл в апоптозе по сравнению с контрольной группой (рис. 1, 2; р<0,05). Внутрижелудочное введение крысам ЭКЖ сопровождалось положительной динамикой возрастания относительного содержания интактных миофибрилл у крыс 4-й и 5-й групп по сравнению с показателем крыс 2-й группы, не получавших ЭКЖ (см. рис. 1; р<0,05). Суммарное число миофибрилл в апоптозе у крыс 2, 3 и 5-й групп после ИФН превышало данный показатель у крыс контрольной группы (см. рис. 2; р<0,05). Введение ЭКЖ животным 4-й (13,5 мг на 1 кг массы тела) и 5-й (27 мг на 1 кг массы тела) групп привело к снижению данного показателя по сравнению с таковым у крыс 2-й группы (см. рис. 2; р<0,05). Используемая минимальная дозировка ЭКЖ у крыс 3-й группы (2,7 мг на 1 кг массы тела) не оказала достоверного влияния на исследованные показатели апоптоза (см. рис. 1, 2).

Обсуждение

Физические упражнения - концентрические, эксцентрические и изометрические - могут приводить к повреждению миофибрилл и цитоскелета мышц с активацией апоптоза. Физическая нагрузка высокой интенсивности, которой подвергались крысы в нашем эксперименте, привела к достоверному (р<0,05) повышению суммарного числа миофибрилл в апоптозе (см. рис. 2). Ультраструктурное повреждение мышц и апоптоз являются патогенетической основой синдрома отсроченной мышечной боли - наиболее распространенной причиной снижения спортивных результатов [16]. Клинически это проявляется экспрессией клеточных биомаркеров повреждения скелетных мышц, преимущественно провоспалительных [17]. Окислительный стресс и метаболические нарушения снижают сократительную способность мышечных волокон и приводят к мышечной усталости, основными причинами которой являются перетренированность или микротравмы [18].

Женьшень традиционно используется в качестве вспомогательного средства для лечения и профилактики различных воспалительных заболеваний [19]. Противовоспалительная роль БАВ женьшеня, в частности, определяется их способностью ингибировать эффекторные и воспалительные каспазы в процессе апоптоза [20]. В нашем исследовании показана положительная динамика снижения числа миофибрилл в апоптозе и повышение относительного содержания интактных миофибрилл у крыс, получавших ЭКЖ (см. рис. 1, 2). Наряду с протективным влиянием на миофибриллы после физических нагрузок женьшень (гинсенозиды) может инициировать мышечную регенерацию. Так, в работе J. Wu и соавт. [21] приведены результаты двойного слепого плацебо-контролируемого перекрестного исследования влияния женьшеня на структуру мышц с использованием биопсии. У 12 здоровых мужчин, которые принимали гинсенозид Rg1 (5 мг) или плацебо за 1 ч до выполнения теста на велоэргометре в течение 1 ч при 70% VO_2max, брали биопсию из латеральной широкой мышцы бедра до, сразу после и через 3 ч после тренировки. Количество сателлитных клеток Pax7⁺ оценивали с помощью иммуногистохимического окрашивания. Сателлитные клетки являются маркерами, непосредственно связанными с регенерацией мышц [22]. В группе сравнения (плацебо) обнаружено снижение числа миосателлитоцитов Pax7⁺ на 36% по сравнению с исходным уровнем, уменьшение центрально-ядерных волокон мышцы на 46% через 3 ч после нагрузки. Эти изменения были полностью предотвращены приемом гинсенозида Rg1. Кроме того, после физической нагрузки в основной группе было констатировано повышение уровней экспрессии миогенных факторов мРНК Myf5 и мРНК Myf4, играющих ключевую роль в регуляции мышечной дифференцировки и миогенеза и являющихся маркерами миогенной индукции. Таким образом, авторами [21] получены объективные доказательства взаимосвязи между потреблением гинсенозидов и регенерацией мышц. Антиапоптотическое дозозависимое действие БАВ женьшеня, установленное в нашем исследовании, и доказательство последующей стимуляции регенерации миофибрилл свидетельствуют о наличии эффективных механизмов протективного действия гинсенозидов при повреждении мышц после интенсивных физических нагрузок.

Заключение

На модели ИФН у крыс показано дозозависимое антиапоптотическое действие БАВ ЭКЖ на миофибриллы скелетной мускулатуры. Наиболее выраженный эффект наблюдается при введении ЭКЖ в суточной дозе 13,5 мг на 1 кг массы тела (в пересчете на гинсенозиды). При использовании минимальной дозировки (2,7 мг на 1 кг массы тела) и максимальной дозировки (27 мг на 1 кг массы тела) ЭКЖ доля миофибрилл в апоптозе остается повышенной относительно показателя контрольной группы. Таким образом, результаты работы подтверждают концепцию, согласно которой одним из механизмов адаптогенного действия БАВ женьшеня является снижение активности процесса апоптоза миофибрилл скелетной мускулатуры, индуцированного ИФН.

References

1. Powers S.K., Deminice R., Ozdemir M., Yoshihara T., Bomkamp M.P., Hyatt H. Exercise-induced oxidative stress: friend or foe? J Sport Health Sci. 2020; 9: 415–25. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jshs.2020.04.001
2. Buchheit M., Laursen P.B. High-intensity interval training, solutions to the programming puzzle. Sports Med. 2013; 43 (5): 313–38. DOI: https://doi.org/10.1007/s40279-013-0029-x
3. Azad M., Khaledi N., Hedayati M., Karbalaie M. Apoptotic response to acute and chronic exercises in rat skeletal muscle: eccentric & sprint interval. Life Sci. 2021; 270: 119002. DOI: https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.119002
4. Zhao X.Q., You J.Q., Liu X.R., Sun J.Z., Li J.P., Wang R.Y. Effects of heavy-load exercise on skeletal muscle cells apoptosis and mechanisms of mitochondrial apoptosis in rats. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2022; 38 (5): 569–76. DOI: https://doi.org/10.12047/j.cjap.6319.2022.106
5. Huang F., Huang M., Zhang H., Zhang C.J., Zhang D.Q., Zhou G.H. Changes in apoptotic factors and caspase activation pathways during the postmortem aging of beef muscle. Food Chem. 2016; 190: 110–14. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.05.056
6. Braakhuis A.J., Somerville V.X., Hurst R.D. The effect of New Zealand blackcurrant on sport performance and related biomarkers: a systematic review and meta-analysis. J Int Soc Sports Nutr. 2021; 18 (1): 8. DOI: https://doi.org/10.1186/s12970-020-00398-x
7. Rathore S., Khuntia B.K., Wadhawan M., Sharma V., Sharma G. Herbal adaptogens: an integrative approach for enhancing performance and resilience in athletes. Phytother Res. 2022; 36 (10): 3678–80. DOI: https://doi.org/10.1002/ptr.7529
8. Megna M., Amico A.P., Cristella G., Saggini R., Jirillo E., Ranieri M. Effects of herbal supplements on the immune system in relation to exercise. Int J Immunopathol Pharmacol. 2012; 25 (1 suppl): 43S–9S. DOI: https://doi.org/10.1177/03946320120250s107
9. Ru W., Wang D., Xu Y., He X., Sun Y.E., Qian L., et al. Chemical constituents and bioactivities of Panax ginseng (C. A. Mey.). Drug Discov Ther. 2015; 9: 23–32. DOI: https://doi.org/10.5582/ddt.2015.01004
10. Zhou S., Zhou J., Xu J., Shen H., Kong M., Yip K., et al. Ginseng ameliorates exercise-induced fatigue potentially by regulating the gut microbiota. Food Funct. 2021; 12: 3954–64. DOI: https://doi.org/10.1039/D0FO03384G
11. Zha W., Sun Y., Gong W., Li L., Kim W., Li H. Ginseng and ginsenosides: therapeutic potential for sarcopenia. Biomed Pharmacother. 2022; 156: 113876. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2022.113876
12. Muñoz-Castellanos B., Martínez-López P., Bailón-Moreno R., Esquius L. Effect of ginseng intake on muscle damage induced by exercise in healthy adults. Nutrients. 2024; 16 (1): 90. DOI: https://doi.org/10.3390/nu16010090
13. Kravchenko L.V., Aksenov I.V., Nikitin N.S., Guseva G.V., Avrenyeva L.I., Trusov N.V., et al. Lipoic acid exacerbates oxidative stress and lipid accumulation in the liver of Wistar rats fed a hypercaloric choline-deficient diet. Nutrients. 2021; 13 (6): 1999. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13061999
14. Trushina E.N., Mustafina O.K., Aksenov I.V., Krasutsky A.G., Nikityuk D.B., Tutel’yan V.A. Bioactive compounds anthocyanins as a factor in the nutritional recovery of the body’s adaptive potential after intense physical activity in the experiment: assessment of immunological and hematological indicators of adaptation. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (1): 6–15. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-6-15 (in Russian)
15. Trushina E.N., Mustafina O.K., Aksenov I.V., Krasutsky A.G., Nikityuk D.B. Protective effect of anthocyanins on apoptosis of gastrocnemiusmuscle myocytes of rats after intense exercise. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2022; 91 (4): 47–53. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-4-47-53 (in Russian)
16. Tanabe Y., Fujii N., Suzuki K. Dietary supplementation for attenuating exercise-induced muscle damage and delayed-onset muscle soreness in humans. Nutrients. 2021; 14: 70. DOI: https://doi.org/10.3390/nu14010070
17. Powers S.K., Deminice R., Ozdemir M., Yoshihara T., Bomkamp M.P., Hyatt H. Exercise-induced oxidative stress: friend or foe? J Sport Health Sci. 2020; 9: 415–25. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jshs.2020.04.001
18. Constantin-Teodosiu D., Constantin D. Molecular mechanisms of muscle fatigue. Int J Mol Sci. 2021; 22: 11587. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms222111587
19. Kim J.H., Yi Y.S., Kim M.Y., Cho J.Y. Role of ginsenosides, the main active components of Panax ginseng, in inflammatory responses and diseases. J Ginseng Res. 2017; 41: 435–43. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jgr.2016.08.004
20. Yun M., Yi Y.-S. Regulatory roles of ginseng on inflammatory caspases, executioners of inflammasome activation. J Ginseng Res. 2020; 44 (3): 373–85. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jgr.2019.12.006
21. Wu J., Saovieng S., Cheng I.-S., Jensen J., Jean W.-H., Alkhatib A., et al. Satellite cells depletion in exercising human skeletal muscle is restored by ginseng component Rg1 supplementation. J Funct Foods. 2019; 58: 27–33. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jff.2019.04.032
22. Murach K.A., Fry C.S., Dupont-Versteegden E.E., McCarthy J.J., Peterson C.A. Fusion and beyond: satellite cell contributions to loading-induced skeletal muscle adaptation. FASEB J. 2021; 35: e21893. DOI: https://doi.org/10.1096/fj.202101096R

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.