The contribution of the intestinal microbiome to the formation of the general profile of bacterial DNA in the blood of obese children

• Irina V. Kirilina
• Sergey A. Roumiantsev
• Andrey M. Gaponov
• Dmitry V. Savchyk
• Dilyara R. Khusnutdinova
• Tatyana V. Grigoryeva
• Elena D. Teplyakova
• Aleksandr E. Shestopalov

Abstract

Obesity is a multifactorial disease. The gut microbiome disturbances play a significant role in the development of obesity, but emerging data point to a blood microbiome and its association with obesity and other pathologies. Bacterial DNA in the blood represents a pathogen-associated molecular pattern capable of activating the immune system and thereby triggering a cascade of inflammatory responses. The question remains open as to where the bacterial DNA originates, which biotopes shape it, and what role the gut microbiome plays in forming the pool of bacterial DNA in blood.

The aim of the study was to compare the bacterial DNA profiles of feces and blood in obese children, to establish relationships between bacterial DNA in blood and feces, and with carbohydrate and lipid metabolism parameters.

Material and methods. This single-center, cross-sectional study included children and adolescents aged 10 to 18 years with varying degrees of alimentary-constitutional obesity (n=79) and without obesity (n=84). The taxonomic profile of bacterial DNA in blood and feces was analyzed using metagenomic sequencing. Bacterial DNA was isolated from blood and stool samples, and the v3-v4 variable region of the 16S rRNA gene was sequenced. To identify the relationship between bacterial DNA in blood and feces and lipid and carbohydrate metabolism parameters [glucose, total cholesterol, high-density lipoprotein and low-density lipoprotein (LDL)], Spearman’s correlation coefficients were calculated.

Results. When comparing bacterial DNA from blood and feces, obese children more often isolated DNA from the families Lactobacillaceae (p=0.043), Porphyromonadaceae (p=0.022), Ruminococcaceae (p=0.065) and less often from Prevotellaceae (p=0.028) and Coriobacteriaceae (p=0.085) compared to children and adolescents without obesity. In obese children, the contribution of intestinal taxa (Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bacteroidaceae) to the formation of the bacterial DNA profile of the blood was significantly reduced, but the contribution of extraintestinal biotopes (skin, soil and water) was more diverse. Positive associations were found between bacterial DNA of fecal Ruminococcaceae taxa and the level of total cholesterol (ρ=0.347, p=0.002) and LDL (ρ=0.313, p=0.005) and of fecal Coriobacteriaceae and these lipid metabolism parameters (ρ=0.304, p=0.007 and ρ=0.317, p=0.005) in obese children. No positive associations were found between fecal and blood taxa and glucose level.

Conclusion. In obese and non-obese children and adolescents, the general profile of bacterial blood DNA is formed by both intestinal and extra-intestinal biotopes. However, in obese children, taxa from extra-intestinal biotopes predominate in the formation of the blood microbiome, which is confirmed by analyzing the proximity of the taxonomic composition of bacterial DNA in blood and feces based on beta diversity indices. The relationship of taxa with blood cholesterol and LDL levels can be considered as a target for microbiota modification and thus reducing the risks of metabolic complications in obesity.

Keywords: children; obesity; translocation; bacterial DNA of blood; bacterial DNA of feces; intestinal microbiome

Ожирение представляет собой глобальную проблему многих стран. Значительный рост заболеваемости наблюдается не только среди взрослого населения, но и среди детской и подростковой когорты [1]. Среди наиболее распространенных причин ожирения выделяют гиподинамию, избыточное потребление энергии, дисбаланс в соотношении белки : жиры : углеводы в потребляемой пище с преобладанием быстрых углеводов, не менее важным является качество продукции. Все перечисленные причины приводят к изменению микробиотического состава кишечника. Микробиом кишечника выступает ядром формирования иммунной толерантности у детей, принимает участие в метаболических процессах, а также создает барьер, препятствующий проникновению как бактерий, так и продуктов их метаболизма в кровеносное русло [2]. Однако при изменении соотношений бактериальных таксонов в кишечнике нарушается и проницаемость кишечной стенки, влекущая за собой попадание различных патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMPs), в том числе и бактериальной ДНК в кровь. Изменение в соотношении бактериальных таксонов связано также с активным применением антибактериальных препаратов [3].

Интерес представляет бактериальная ДНК крови как один из представителей PAMPs и сигнальных молекул в контексте ее связи с ожирением и другими нарушениями гомеостаза. Обнаружение бактериальной ДНК в крови в той или иной степени обсуждается еще с 1977 г., когда в крови и здорового человека, и пациента была обнаружена бактериальная структура [4]. В основном исследования бактериальной ДНК крови проводят на когорте взрослых людей, имеются данные об исследованиях с участием детей, но они достаточно поверхностны, проведены на уровне, как правило, филумов, что является достаточно грубой оценкой для микробиома как кала, так и крови. Одномоментного исследования профиля бактериальной ДНК кала и крови на когорте детей и подростков с ожирением не проводилось. Не изучен вопрос биотопа или биотопов, формирующих бактериальную ДНК крови у детей и подростков с ожирением. У взрослых пациентов с ожирением, причем при различных его фенотипах, описан профиль бактериальной ДНК крови [5]. Полагают, что основным способом попадания бактериальной ДНК в кровь является транслокация через поврежденную с повышенной проницаемостью кишечную стенку [4]. У детей такой механизм возможен при условии несостоятельности кишечного барьера.

Таким образом, целью исследования было сопоставить профиль бактериальной ДНК кала и крови у детей и подростков с ожирением, установить взаимосвязи между ними, а также показателями углеводного и липидного обмена.

Материал и методы

Проведено одноцентровое одномоментное исследование со случайной выборкой участников на базе ГБУ РО "Детская городская поликлиника № 1" г. Ростова-на-Дону. Были обследованы 163 ребенка в возрасте 10-18 лет, которые обратились с целью прохождения плановой диспансеризации. Из них 79 человек (средний возраст 13,2±2,0 года) составили группу наблюдения - дети с алиментарно-конституциональным ожирением разной степени, которые уже находились на диспансерном учете с установленным диагнозом. Группой сравнения были дети и подростки без ожирения и других метаболических нарушений (n=84, средний возраст 12,9±2,3 года).

Критериями включения в обе группы были отсутствие приема антибиотиков, пробиотических и пребиотических препаратов в течение 3 мес до включения в исследование, подписанное информированное согласие для участия в исследовании. Критерии невключения для обеих групп: тяжелые соматические заболевания (хроническая почечная недостаточность, хроническая печеночная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), заболевания желудочно-кишечного тракта (неспецифический язвенный колит, болезнь Крона), любое заболевание в острой форме.

Проведение исследования одобрено ЛНЭК ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (Пироговский Университет) (протокол № 186 от 26.06.2019) и ЛНЭК ФГБОУ ВО РостГМУ (протокол № 20/19 от 12.12.2019). Обязательным условием включения в исследование было добровольное подписание информированных согласий пациентами и их родителями.

У всех участников исследования проводили оценку антропометрических параметров (табл. 1), забор для клинико-биохимических исследований крови натощак [включая концентрацию глюкозы, общего холестерина, липопротеинов высокой и низкой плотности (ЛПНП)] и кала.

Выделение микробной ДНК из образцов крови и кала участников исследования проводили с использованием набора QIAamp BiOstic Bacteremia DNA Kit (Qiagen, ФРГ) и QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, ФРГ) в соответствии с протоколом изготовителя. Контроль качества ДНК, качественный и количественный состав ДНК оценивали методами спектрофотометрии и гель-электрофореза.

Подготовку библиотек и секвенирование вариабельного участка v3-v4 гена 16S рРНК проводили на платформе Illumina MiSeq (США). Полученные последовательности генов 16S рРНК ("риды") были проанализированы с помощью программного обеспечения QIIME (версия 1.9.1) [6] с использованием референсной базы данных Greengenes v. 13.8 [7] с 97% порогом сходства между последовательностями. Относительная представленность бактериальных таксонов в общем пуле ридов указана в долях (от 0 до 1), которые были рассчитаны на основе картированных ридов для каждого таксона.

Статистическая обработка данных выполнена с помощью MedCalc^® Statistical Software version 20.110 (MedCalc Software Ltd; Бельгия). Нормальность распределения всех массивов данных оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. Ввиду отсутствия нормального распределения, в качестве меры центральной тенденции использовали медиану (Ме) и 25-й и 75-й перцентили [Q1; Q3]. Сопоставление бактериальной ДНК крови и бактериальной ДНК кала проводили с использованием логического выражения, при котором, если выделение ДНК таксона кала и крови совпадало и было больше нуля, в таком случае оно соответствовало 1, если не было совпадений - тогда принимало значение 0. После чего, используя полученную таблицу по каждому из таксонов, определяли частоту совпадений кал-кровь с использованием критерия хи-квадрат. Для выявления взаимосвязи между бактериальной ДНК крови и кала и показателями липидного и углеводного обмена был проведен расчет коэффициентов корреляции Спирмена. Коэффициенты корреляции (ρ) принимали во внимание при условии |ρ|≥0,3 - умеренная сила связи в соответствии со шкалой Чеддока и при уровне значимости р≤0,05.

Результаты

У детей с ожирением и без ожирения таксономический профиль бактериальной ДНК крови и кала был идентичен по 4 основным доминирующим филумам: Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes и Proteobacteria, на долю которых приходилось более 97% общего пула бактериальной ДНК и кала, и крови. Кроме ДНК доминирующих филумов из крови и кала детей с ожирением и без ожирения выделена бактериальная ДНК филумов Cyanobacteria, Verrucomicrobia, TM7, Tenericutes, Fusobacteria. Только у детей с ожирением из образцов крови и кала выделялась бактериальная ДНК филумов Elusimicrobia и Euryarchaeota (домен Archaea) (см. рис. 1).

У обследованных пациентов с ожирением в кале и крови чаще выделялась ДНК семейств Lactobacillaceae (р=0,043), Porphyromonadaceae (р=0,022), Ruminococcaceae (р=0,065) и реже Prevotellaceae (р=0,028) и Coriobacteriaceae (р=0,085) по сравнению с профилем бактериальной ДНК у детей и подростков без ожирения (см. рис. 2).

У детей и подростков с ожирением вклад кишечника в формирование профиля циркулирующей бактериальной ДНК крови меньше, чем у детей без ожирения (см. рис. 3), а таксонов, менее представленных или имеющих значимо меньший вклад в профиль кишечника, в крови представлено значимо больше по сравнению с детьми без ожирения.

Проведенный анализ β-разнообразия между калом и кровью с целью выявить близость профилей бактериальной ДНК кала и крови выявил значимые различия в расстоянии Манхэттен, несходства Брея-Кертиса, расстоянии Евклида в группах детей и подростков с ожирением и без ожирения (см. рис. 4), что свидетельствовало о меньшем вкладе кишечного микробиома в пул бактериальной ДНК крови у детей с ожирением.

Корреляционный анализ показал отсутствие статистически значимых взаимосвязей между концентрацией глюкозы в крови у детей и подростков с ожирением и содержанием бактериальной ДНК в кале и крови. В то же время концентрация в сыворотке крови общего холестерина и ЛПНП была позитивно ассоциирована с 2 таксонами бактериальной ДНК кала - Coriobacteriaceae, Ruminococcaceae (табл. 2). В группе детей без ожирения не выявлены положительные корреляционные взаимосвязи с бактериальной ДНК кала. С концентрацией в сыворотке крови ЛПВН у детей с ожирением позитивно ассоциирован таксон кала [Mogibacteriaceae], в то время как у детей без ожирения выявлена ассоциация с таксоном крови [Tissierellaceae].

Взаимосвязи между бактериальной ДНК кала и бактериальной ДНК крови у детей с ожирением имели среднюю силу и кардинально отличались от взаимосвязей, наблюдаемых в группе сравнения (табл. 3).

Обсуждение

Представленные нами данные по индексам бета-разнообразия и по сопоставлению непосредственно таксономического совпадения кал-кровь демонстрируют, что в норме: у детей без ожирения профиль бактериальной ДНК крови представляет в большей степени ДНК бактерий из кишечного биотопа. У детей с ожирением это ДНК бактерий с кожных покровов (Micrococcaceae, Propionibacteriaceae) [8, 9], а также почвы и воды (Sphingomonadaceae, Comamonadaceae) [10, 11] и в меньшей степени кишечных (Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Bacteroidaceae), что, напротив, свидетельствует о состоятельности кишечной стенки и, вероятно, компенсаторному включению белков плотных контактов. В когорте взрослых людей с ожирением преобладают таксоны кишечного биотопа [12], но этот факт объясняется более длительными нарушениями как кишечной микробиоты, так и ее метаболитов, оказывающих влияние на проницаемость кишечной стенки, и, кроме того, влиянием низкоинтенсивного воспаления.

Известно, что микробиота кишечника воздействует на углеводный и липидный обмен посредством индукции сигналов через эпителиальные клетки кишечника. Кроме того, транслокация бактериальных метаболитов при условии повышенной кишечной проницаемости приводит к низкоинтенсивному воспалению [13]. В исследовании K. Nirmalkar и соавт. на группе мексиканских детей с ожирением продемонстрировано преобладание в микробиоте кишечника рода Collinsella семейства Coriobacteriaceae, а также Prevotella [14]. В пилотном исследовании итальянских ученых показана взаимосвязь между Coriobacteriaceae и высоким риском развития рассеянного склероза [15]. У пациентов с симптоматическим атеросклерозом было отмечено превалирование рода Collinsella (семейство Coriobacteriaceae), что может служить доказательством роли данного таксона в липидном обмене и рассматривать его проатерогенным фактором. Также и в нашем исследовании была выявлена позитивная ассоциация бактериальной ДНК таксона Coriobacteriaceae с уровнем общего холестерина и ЛПНП в сыворотке крови. Данные по семейству Ruminococcaceae довольно противоречивы. K. Nirmalkar и совт. в исследовании с участием подростков 13-16 лет показали статистически значимую позитивную ассоциацию между Ruminococcus и индексом массы тела, а также уровнем общего холестерина [14]. У взрослой когорты данный таксон рассматривается как защитный, выступающий маркером метаболического здоровья, за счет продукции бутирата, принимающего участие в снижении воспаления в сосудистой стенке и улучшающего чувствительность к инсулину.

В ряде исследований показано влияние микробиоты кишечника на метаболизм липидов в печени независимо от ожирения [16, 17]. Имеются данные о влиянии стресса на состояние микробиоты и ее метаболитов, что крайне важно в детском и подростковом возрасте [18].

Заключение

Профиль бактериальной ДНК крови у детей и подростков с ожирением сформирован таксонами кишечных и внекишечных биотопов. Однако биотопом, формирующим профиль бактериальной ДНК крови, у них являются кожные покровы, так как обнаружено большее число бактерий, биотопами которых служат почва и вода. Взаимосвязь таксонов с уровнем холестерина и ЛПНП в крови может рассматриваться как мишень для коррекции микробиоты и, таким образом, снижения рисков метаболических осложнений при ожирении.

References

1. Global nutrition targets 2025: childhood overweight policy brief. 2025. URL: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-NMH-NHD-14.6 (date of access April 20, 2026).

2. Almansour N., Al-Rashed F., Choudhry K., Alqaderi H., Sindhu S., Al-Mulla F., et al. Gut microbiota: a promising new target in immune tolerance. Front Immunol. 2025; 18 (16): 1607388. DOI: https://DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1607388

3. Topol I.A., Polyakova I.S., Elykova A.V. Role of intestinal microbiota in regulation of immune reactions of gut-associated lymphoid tissue under stress and following the modulation of its composition by antibiotics and probiotics administration. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2022; 99 (6): 722–33. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-270 (in Russian)

4. Castillo D.J., Rifkin R.F., Cowan D.A., Potgieter M. The healthy human blood microbiome: fact or fiction? Front Cell Infect Microbiol. 2019; 8 (9): 148. DOI: https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00148

5. Shestopalov A.V., Kolesnikova I.M., Gaponov A.M., Grigor’eva T.V., Khusnutdinova D.R., Kamal’dinova D.R., et al. Effect of metabolic type of obesity on blood microbiom. Voprosy biologicheskoy, meditsinskoy i farmatsevticheskoy khimii [Problems of Biological, Medical and Pharmaceutical Chemistry]. 2022; 25 (2): 35–41. DOI: https://doi.org/10.29296/25877313-2022-02-06 (in Russian)

6. Caporaso J.G., Kuczynski J., Stombaugh J., Bittinger K., Bushman F.D., Costello E.K., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 2010; 7 (5): 335–6. DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth.f.303

7. DeSantis T.Z., Hugenholtz P., Larsen N., Rojas M., Brodie E.L., Keller K., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 2006; 72 (7): 5069–72. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.03006-05

8. Yastrebova O.V., Plotnikova E.G. Philogenetic diversity of bacteria of the family Micrococcaceae isolated from biotopes with different anthropogenic impact Vestnik Permskogo universiteta [Bulletin of the Perm University]. 2020; (4): 321–33. DOI: https://doi.org/10.17072/1994-9952-2020-4-321-333 (in Russian)

9. Dastager S.G., Krishnamurthi S., Rameshkumar N., Dharne M. The family Micrococcaceae. In: E. Rosenberg, E.F. DeLong, S. Lory, E. Stackebrandt, F. Thompson (eds). The Prokaryotes. Berlin; Heidelberg: Springer, 2014. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-642-30138-4_168 Online ISBN: 978-3-642-30138-4.

10. Glaeser S.P., Kämpfer P. The family Sphingomonadaceae. In: E. Rosenberg, E.F. DeLong, S. Lory, E. Stackebrandt, F. Thompson (eds). The Prokaryotes. Berlin; Heidelberg: Springer, 2014. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-642-30197-1_302 Online ISBN: 978-3-642-30138-4.

11. Willems, A. The family Comamonadaceae. In: E. Rosenberg, E.F. DeLong, S. Lory, E. Stackebrandt, F. Thompson (eds). The Prokaryotes. Berlin; Heidelberg: Springer, 2014. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-642-30197-1_238 Online ISBN: 978-3-642-30138-4.

12. Kolesnikova I.M., Karbyshev M.S., Gaponov A.M., Khusnutdinova D.R., Grigor’eva T.V., Kamal’dinova D.R., et al. Features of bacterial DNA taxonomy in blood of patients with various metabolic phenotypes of obesity. Bulletin of Siberian Medicine. 2023; 22 (2): 61–7. DOI: https://doi.org/10.20538/1682-0363-2023-2-61-67 (in Russian)

13. Massier L., Blüher M., Kovacs P., Chakaroun R.M. Impaired intestinal barrier and tissue bacteria: pathomechanisms for metabolic diseases. Front Endocrinol (Lausanne). 2021; 9 (12): 616506. DOI: https://doi.org/10.3389/fendo.2021.616506

14. Nirmalkar K., Murugesan S., Pizano-Zárate M.L., Villalobos-Flores L.E., García-González C., Morales-Hernández R.M., et al. Gut microbiota and endothelial dysfunction markers in obese Mexican children and adolescents. Nutrients. 2018; 10 (12): 2009. DOI: https://doi.org/10.3390/nu10122009

15. Del Chierico F., Manco M., Gardini S., Guarrasi V., Russo A., Bianchi M., et al. Fecal microbiota signatures of insulin resistance, inflammation, and metabolic syndrome in youth with obesity: a pilot study. Acta Diabetol. 2021; 58 (8): 1009–22. DOI: https://doi.org/10.1007/s00592-020-01669-4

16. Le Roy T., Llopis M., Lepage P., Bruneau A., Rabot S., Bevilacqua C., et al. Intestinal microbiota determines development of non-alcoholic fatty liver disease in mice. Gut. 2013; 62 (12): 1787–94. DOI: https://doi.org/10.1136/gutjnl-2012-303816

17. Watanabe M., Houten S.M., Mataki C., Christoffolete M.A., Kim B.W., Sato H., et al. Bile acids induce energy expenditure by promoting intracellular thyroid hormone activation. Nature. 2006; 439 (7075): 484–9. DOI: https://doi.org/10.1038/nature04330

18. Vorvul’ A.O., Bobyntsev I.I., Medvedeva O.A. On mechanisms of increased intestinal wall permeability under stress. Chelovek i ego zdorov’e [Humans and Their Health]. 2022; 25 (2): 43–63. DOI: https://doi.org/10.21626/vestnik/2022-2/05 (in Russian)

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.