В последние годы в большинстве экономически развитых стран среди населения, особенно старше 40 лет, наблюдается значительный рост заболеваемости сахарным диабетом типа 2 (СД 2) [18, 24], который характеризуется нарушением секреции инсулина, гипергликемией и развитием патологии различных внутренних органов [21, 31, 39, 44]. Как правило, это заболевание сочетается с ожирением (ОЖ) и характеризуется иммунной дисфункцией, которая проявляется нарушением клеточного иммунитета, снижением функциональной активности лимфоцитов, уменьшением абсолютного числа последних, в частности Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов. При этом нарушается дисбаланс относительного содержания Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, что обусловливает повышение иммунорегуляторного индекса (ИРИ) [8, 23, 37].
У больных СД 2 выявлено снижение функции фагоцитов, играющих основную роль в защите организма от инфекционных агентов [28, 32, 34].
ОЖ, которое, как указывалось выше, сочетается с СД 2 и является фактором риска его развития [3, 38], в настоящее время рассматривается как самостоятельное алиментарное заболевание с характерными особенностями. Оно проявляется развитием иммунодефицита с нарушением механизмов, регулирующих созревание и пролиферацию Т-лимфоцитов в тимусе [22], а также снижением числа тимоцитов и усилением степени их апоптоза [43]. У пациентов с избыточной массой тела и ОЖ отмечаются повышение уровня лейкоцитов, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), интерферона-γ, дисбаланс гуморального звена иммунитета, рост концентраций в сыворотке крови лептина и инсулина, тесно коррелирующий с индексом массы тела (ИМТ) и особенностями питания [16, 26, 27].
Приведенные данные литературы свидетельствуют о том, что у больных СД 2 и (или) ОЖ существенно нарушен клеточный иммунитет. Однако данные часто носят противоречивый характер, что в значительной степени объясняется сложностью интерпретации результатов вследствие наличия у больных СД 2 сопутствующих заболеваний, причем основным из них считается ОЖ. С учетом сказанного, целью настоящего исследования было сравнительное изучение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и маркеров активации лимфоцитов у больных СД 2 и ОЖ.
Материал и методы
Обследованы 31 больной СД 2 (группа СД 2), 20 пациентов с I-III степенью алиментарного ожирения (группа ОЖ) без СД 2 (больные этой группы по ИМТ соответствовали больным группы СД 2) и 20 практически здоровых лиц (группа сравнения); средний возраст обследуемых - 53,2 года. В исследование не включали пациентов с острыми осложнениями СД, хронической почечной недостаточностью, тиреотоксикозом, узловыми образованиями щитовидной железы, различными формами онкопатологии и обострением сопутствующих заболеваний. Обследуемые находились на стационарном лечении в клинике ФГБУ "НИИ питания" РАМН. Группу сравнения составили лица без нарушений углеводного обмена. ИМТ вычисляли по формуле Кетле (ИМТ, кг/м2 = фактическая масса тела, кг/рост, м2). В крови, взятой утром натощак из локтевой вены, исследовали уровень базальной гликемии и показатели липидного обмена с помощью биохимического анализатора "KoneLab 30i" фирмы "TermoElectron" (Финляндия). У больных с нарушенным липидным обменом определяли тип гиперлипопротеинемий (ГЛП) по классификации, предложенной D. Fredrickson: IIа тип ГЛП регистрировали, если в сыворотке крови содержание общего холестерина (ОХС) превышало 5,0 ммоль/л при нормальной концентрации триглицеридов (ТГ), IIб тип - если было повышено содержание ХС и ТГ (>1,7 ммоль/л) [6].
Количественный состав субпопуляций лимфоцитов в периферической крови обследуемых изучали на проточном цитофлюориметре "FC-500" ("Beckman Coulter", США) по программе Cytomics CXP Software с использованием двойных комбинаций моноклональных антител производства Beckman Coulter, США. При этом оценивали (в %) показатели Т-клеточной популяции: общее количество Т-лимфоцитов (CD3+), количество Т-хелперов (CD3+CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), естественных клеток-киллеров (NK-клеток - CD3-CD16+CD56+), NKТ-клеток (CD3+CD16+CD56+), В-клеточной популяции (CD19+) лимфоцитов, а также относительное содержание лимфоцитов, несущих маркеры активации (поздний - CD3+HLA-DR+ и ранний - CD3+CD25+), и маркерный антиген апоптоза (CD45+CD95+). В качестве изотипического контроля использовали CD45/CD14 (для идентификации популяции лейкоцитов и выделения гейта лимфоцитов по малоугловому и боковому светорассеянию) и IgG1/IgG2 (для контроля неспецифического связывания лимфоцитов с антителами и выделения отрицательного по флюоресценции лимфоцитарного гейта). Вычисляли ИРИ (соотношение в периферической крови Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов - CD3+CD4+/CD3+CD8+). Гемолиз эритроцитов осуществляли в автоматическом режиме на стационарном приборе пробоподготовки "TQ-PREP"("Beckman Coulter", США).
Полученные данные обрабатывали статистически с использованием пакета прикладных компьютерных программ IBM SPSS Statistics Version 20. В зависимости от нормальности распределения полученных результатов использовали методы параметрической (критерий Стьюдента) и непараметрической (критерий Манна-Уитни) статистики. Наличие взаимосвязи и ее направленность устанавливали, проводя корреляционный анализ с применением критерия Спирмена (r). Результаты представлены в виде средних величин и их стандартной ошибки (M±m). Уровень значимости считали достоверным при р<0,05. Результаты и обсуждение
В табл. 1. представлена характеристика больных исследуемых групп. Как следует из данных табл. 1, у 29% больных группы СД 2 обнаружена I степень ОЖ, у 36% - II степень и у 33% - III степень. В группе ОЖ у 25% больных констатирована I степень ожирения, у 35% - II степень и у 40% - III степень. Уровни базальной гликемии и ТГ в крови у больных группы СД 2 достоверно превышали параметры в группе ОЖ. У всех больных группы СД 2 констатировано наличие ГЛП: у 35% пациентов - типа IIа, у 65% - типа IIб. У больных группы ОЖ ГЛП типа IIа выявлена у 75% пациентов, типа IIб - у 25%.
Данные исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови больных групп СД 2 и ОЖ представлены в табл. 2. Согласно данным этих исследований, которые являются одним из наиболее важных методов клинической лабораторной диагностики, позволяющей оценить состояние иммунной системы и ее нарушения при первичных и вторичных иммунодефицитных состояниях, воспалительных процессах, алиментарнозависимых заболеваниях, аллергических реакциях и ряде других заболеваний, статистически достоверных различий в относительном содержании В- и Т-лимфоцитов, а также Т-хелперов в периферической крови обследованных здоровых лиц и больных групп СД 2 и ОЖ не выявлено. При оценке содержания Т-цитотоксических лимфоцитов обнаружено статистически достоверное снижение относительного содержания данной субпопуляции лимфоцитов у больных в группах СД 2 и ОЖ (по сравнению с 3-й группой). Следует также отметить отсутствие достоверного различия изученных показателей у больных групп СД 2 и ОЖ. ИРИ был статистически значимо выше у больных групп СД 2 и ОЖ, чем в группе сравнения при достаточно близких значениях в основных группах (табл. 2). Установлено, что ИРИ отражает эффективность клеточного иммунного ответа. Увеличение значения ИРИ >2 является неблагоприятным фактором в прогнозе заболевания [9]. Существует гипотеза: повышение величины ИРИ свидетельствует о наличии аутоиммунных процессов, играющих патогенетическую роль в развитии СД 2 [7].
При сравнительном анализе субпопуляций лимфоцитов периферической крови выявлено статистически достоверное превышение относительного содержания Т-киллеров у больных группы СД 2 по сравнению с группой сравнения (см. табл. 2), а также с группой ОЖ. При изучении корреляционных взаимосвязей между относительным числом NKT-клеток (Т-киллеров) и содержанием ТГ в периферической крови выявлена статистически значимая прямая корреляционная связь (r=0,31; p=0,03). NKT-клетки - уникальный подкласс Т-лимфоцитов, которому присущи фенотипические особенности как Т-лимфоцитов, так и NK-клеток [35]. NKT-клетки регулируют продукцию и сами являются продуцентами важнейших цитокинов, направляющих течение иммунной реакции, обладают киллерной и противоопухолевой цитотоксичностью [29, 35]. Увеличение относительного содержания NKT-клеток может свидетельствовать о прогрессировании заболевания и активации иммунитета.
Для подтверждения напряженности иммунного процесса у больных групп СД 2 и ОЖ были исследованы маркеры активации лимфоцитов. Последняя заключается в распознавании антигенных эпитопов и обмене сигналами с другими клетками иммунной системы [17, 20]. Активированные лимфоциты переходят в состояние, с которым связаны функции и проявление специфической активности клетки. Клоны клеток, распознающих антигенный пептид на антигенпредставляющей клетке, подвергаются бласттрансформации и экспрессируют ряд активационных молекул. Наиболее важным результатом активации является экспрессия генов факторов роста и их рецепторов. Формирование высокоаффинного рецептора для интерлейкина-2 (ИЛ-2) является процессом ранней активации лимфоцитов в результате экспрессии гена CD25 - легкой (α) цепи рецептора. Результаты нашего исследования экспрессии CD25 на Т-лимфоцитах не показали достоверной разницы величины показателя у обследованных всех 3 групп (см. рисунок, табл. 2).
К поздним маркерам активации относится молекула HLA-DR, принадлежащая к главному комплексу гистосовместимости II класса. Обнаружено статистически достоверное повышение относительного содержания Т-клеток, экспрессирующих маркер активации HLA-DR (CD3+ HLA-DR+) у пациентов с СД2 и ОЖ (см. рисунок, табл. 2). Установлено, что повышение экспрессии HLA-DR на лимфоцитах происходит при воспалительных процессах под действием цитокинов [19].
Таблица 1. Характеристика больных обследованных групп
Таблица 2. Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов (в %) и экспрессия активационных маркеров на лимфоцитах в периферической крови больных обследованных групп (M±m)
С активированными клетками связывают и CD95антиген. Рецептор CD95 (АРО-1, Fas-антиген) принадлежит к суперсемейству ФНО-α - нервно-ростовому фактору. Он обнаружен на тимоцитах, Т- и В-лимфоцитах, NK-клетках и моноцитах. Показано, что при апоптозе, опосредованном лимфоцитами, задействован CD95 (Fas/АРО-1) антигенапоптотический путь, который способен передавать апоптотический сигнал, связываясь с соответствующим лигандом. Апоптоз играет важную роль в элиминации аутореактивных клеток, контролирует длительность, интенсивность иммунного ответа, степень повреждения тканей и является механизмом, поддерживающим баланс лимфоцитов в организме [13, 15, 30]. Нами обнаружено статистически достоверное повышение относительного содержания CD45+CD95+-лимфоцитов у больных с СД 2 по сравнению с таковым у здоровых и у больных ОЖ (см. табл. 2, рисунок). Повышение уровня лимфоцитов с маркером CD95+ свидетельствует об активации иммунного ответа и встречается при острых заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы [7].
По современным представлениям, в патогенезе СД 2 (как c проявлением метаболического синдрома, так и без него) существенная роль отводится цитокин-индуцированному воспалению, или острофазному ответу [2, 4, 25]. Это может быть следствием адаптивной реакции врожденного иммунитета для нормализации гомеостаза. Исследованние уровней провоспалительного цитокина ИЛ-6 и С-реактивного белка в 3 группах испытуемых (здоровые волонтеры, пациенты с СД 2 без метаболического синдрома и больные с СД 2 с метаболическим синдромом) продемонстрировало наивысшее содержание маркеров воспаления у пациентов с СД2 и метаболическим синдромом, среднее значения - у больных с СД 2 без метаболического синдрома и низкое - в группе здоровых волонтеров [45]. Авторы связывают наличие ГЛП, инсулиновой резистентности, нарушенной инсулиновой секреции, атеросклероза у больных СД 2 с активацией врожденного иммунитета и острофазным ответом. Концепция аутоиммунной составляющей в патогенезе СД 2 подтверждается обнаружением у больных аутоантител класса IgG к тканям поджелудочной железы [8].
Экспрессия активационных маркеров и CD95-антигена (Fas/АРО-1) на лимфоцитах периферической крови в группах сравнения (1), у больных сахарным диабетом типа 2 (2) и ожирением (3)
Особенности нарушений липидного обмена при СД 2 в настоящее время освещены в достаточной мере [5, 14, 42]. Патогенетическая роль ГЛП при СД выходит за рамки нарушения обмена липидов. Известно, что липопротеиды крови активно участвуют в обмене липидных компонентов (холестерина, фосфолипидов) клеточных мембран [6]. Нарушения этого обмена приводят к серьезным изменениям структуры мембран и их физико-химических свойств у иммунокомпетентных клеток. В настоящем исследовании у преобладающего большинства больных СД 2 и ОЖ выявлено наличие ГЛП (см. табл. 1). Известно, что развитие гиперхолестеринемии при СД 2 связано с нарушением гормональной регуляции углеводно-жирового обмена в целом. При этом инсулярная недостаточность усиливается продукцией контринсулярных гормонов, таких как кортизол и адреналин [11]. Гипертриглицеридемия сопряжена с повышением содержания липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) [12, 42]. По мнению авторов, это связано с повышением образования ЛПОНП в печени, что происходит благодаря активному поступлению в нее жирных кислот, а также отсутствию ингибирующего влияния инсулина на продукцию и формирование ЛПОНП [6, 42]. Кроме того, обсуждается возможность увеличения синтеза жирных кислот в печени de novo [40, 41]. Определенную патогенетическую роль в развитии иммунных дисфункций у больных СД 2 и ОЖ могут играть нарушения энергетического обмена клетки и активация свободнорадикального окисления, возникающие у больных СД при гипергликемиии дислипопротеидемии [1]. В этих условиях запускаются универсальные механизмы дезорганизации плазматических мембран, которые являются причиной нарушения их физико-химических свойств [10].
Важную патогенетическую роль в иммунной дисфункции больных с ОЖ играет лептин, который синтезируется адипоцитами [33]. Рецептор к лептину экспрессируется на иммуноцитах и, по-видимому, активирует ряд цитокиноподобных сигнальных путей.
Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты, подтверждающие взаимосвязь между иммунными сдвигами и клинико-метаболическими нарушениями у больных СД2 и ОЖ, согласуются с данными литературы об участии иммунных механизмов в патогенезе заболеваний.
Таким образом, у больных групп СД2 и ОЖ выявлены нарушения клеточного звена иммунитета, заключающиеся в повышении величины ИРИ >2 (норма -1) за счет снижения относительного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов, что является неблагоприятным фактором в прогнозе развития заболеваний. У больных из групп СД 2 и ОЖ обнаружено статистически значимое повышение количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер активации HLA-DR (CD3+HLA-DR+), что свидетельствует о возрастании активности Т-клеточного звена иммунитета. Повышение относительного числа NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+) в периферической крови больных СД 2, коррелирующее с содержанием ТГ, может служить маркером иммунометаболических нарушений при данном заболевании. У больных группы СД 2 отмечается статистически значимое повышение количества лимфоцитов, экспрессирующих CD95-антиген. Это свидетельствует о том, что проапоптотическая активность при СД 2 выражена в большей степени, чем у здоровых и у больных с ОЖ. Выявленные нарушения субпопуляционного состава лимфоцитов и увеличение числа клеток, экспрессирующих маркеры активации, у больных групп СД 2 и ОЖ подтверждает участие иммунных механизмов в патогенезе заболеваний.
Литература
1. Балаболкин М.И. // Сахарный диабет. - 2002. - № 3. - С. 8-17.
2. Белякова Н.А., Михайлова Д.Г., Гогина Е.Н. и др. // Клин. лаб. диагн. - 2010. - № 3. - С. 14-18.
3. Беляков Н.А., Мазуров В.И. (ред.) Ожирение. - СПб.: СПбМАПО, 2003. - 520 с.
4. Бондарь И.А., Шабельникова О.Ю. // Сахарный диабет. - 2009. - № 4. - С. 52-55.
5. Дедов И.И., Фадеев В.В. Введение в диабетологию. - М.: Берег, 1998. - 200 с.
6. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. Российские рекомендации. IV пересмотр. - М., 2009. - 80 с.
7. Земсков А.М., Земсков В.М., Караулов А.В. Клиническая иммунология. - М: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 319 с.
8. Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., Захарова М.Ю. и др. // Кубан. науч. мед. вестн. - 2008. - № 5. - С. 91-94.
9. Никитин В.Ю., Сухина И.А., Цыган В.Н. и др. // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2007. - № 1. - С. 65-71.
10. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. - Томск: Изд-во Том. Ун-та, 2004. - 202 с.
11. Панин Л.Е. Детерминантные системы в физике, химии, биологии. - Новосибирск: Сибирское университетское изд-во, 2006. - 201 с.
12. Панин Л.Е., Рязанцева Н.В., Бутусова В.Н. и др. // Сахарный диабет. - 2008. - № 4. - С. 56-59.
13. Потапнев М.П. // Иммунология. - 2002. - № 4. - С. 237-242.
14. Потеряева О.Н., Панин Л.Е., Шевкопляс О.П. и др. // Пробл. эндокринол. - 2003. - Т. 49, № 4. - С. 4-8.
15. Райт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. - М., 2000. - 582 с.
16. Трошина И.А., Петров И.М., Гагина Т. А. и др. // Бюл. Сибир. мед. - 2007. - № 1. - С. 97-105.
17. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 345 с.
18. Шишкина Н.С., Сунцов Ю.И., Болотская Л.Л. и др. // Сахарный диабет. - 2005. - № 2. - С. 7-9.
19. Ющук Н.Д., Дудина К.Р., Знойко О.О. и др. // Тер. арх. - 2005. - № 11. - С. 32-37.
20. Ярилин А.А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999. - 607 с.
21. Allard R., Leclerc P., Tremblay C. et al. // Diabetes Care. - 2010. - Vol. 33. - P. 1491-1493.
22. Dixit V.D. // J. Leukoc. Biol. - 2008. - Vol. 84. - P. 882-892.
23. Dood A.K., Tayyar M.A., Fouda I.M. et al. // J. Immunotoxicol. - 2009. - Vol. 6. - P. 36-41.
24. Ealovega M.W., Tabaei B.P. // Diabetes Care. - 2004. - Vol. 27. - P. 9-12.
25. Fenandez-Real J.M., Pickup J.C. // Diabetologia. - 2012. - Vol. 55. - P. 273-278.
26. Flegal K.M., Graunbard B.I., Williamson D.F. et al. // JAMA. - 2007. - Vol. 298. - P. 2028-2037.
27. Friedman J.M. // Nat. Med. - 2004. - Vol. 10. - P. 563-569.
28. Geerlings S.E., Hoepelman A.I. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1999. - Vol. 26. - P. 259-265.
29. Godfrey D.I., Kronenberg M. // J. Clin. Invest. - 2004. - Vol. 114. - P. 1379-1388.
30. Hengartner M.O. // Nature. - 2000. - Vol. 407. - P. 770-776.
31. Joshi N., Caputo G.M., Weitekamp M.R. et al. // N. Engl. J. Med. - 1999. - Vol. 341. - P. 1906-1912.
32. Komura T., Sakai Y., Honda M. et al. // Diabetes. - 2010. - Vol. 59. - P. 634-643.
33. Lamas O., Marti A., Martinez J.A. // Eur. J. Clin. Nutr. - 2002. - Vol. 56, suppl. 3. - P. 42-45.
34. McManus L.M., Blood R.C., Prihoda T.J. et al. // J. Leukoc. Biol. - 2001. - Vol. 70. - P. 395-404.
35. Mercer J.C., Ragin M.J., August A. // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2005. - Vol. 37. - P. 1337-1343.
36. Olefsky J.M., Glass C.K. // Ann. Rev. Physiol. - 2010. - Vol. 72. - P. 2 19 - 24 6 .
37. Pozzilli P., Leslie R.D. // Diabet. Med. - 1994. - Vol. 11. - P. 9 3 5 - 9 41.
38. Samartin S., Chandra R.K. // Nutr. Res. - 2001. - Vol. 21. - P. 24 3 - 2 6 2 .
39. Shah B.R., Hux J.E. // Diabetes Care. - 2003. - Vol. 26. - P. 510-513.
40. Shimomura I., Matsuda M., Hammer R.E. et al. // Mol. Cell. - 2000. - Vol. 6. - P. 77-86.
41. Tobe K., Suzuki R., Aoyama M. et al. // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276. - P. 38337-38340.
42. Verg S.B. // Diabetes Metab. - 2005. - Vol. 31, N 5. - P. 4 2 9 - 4 3 9 .
43. Yang H.,Yom Y-H., Vandanmagsar B. et al. // Blood. - 2009. - Vol. 114. - P. 3803-3812.
44. Yende S., van der Poll T., Lee M. et al. // Thorax. - 2010. - Vol. 65. - P. 870-877.
45. Yki-Jarvinen H., Williams G. Textbook of Diabetes. 2nd ed. / Eds J.C. Pickup, G. Williams. - Oxford: Blackwell Science, 1997. - P. 20.1-20.14.