Пищевая аллергия (ПА) и синдром раздраженной кишки (СРК) относятся к наиболее распространенным алиментарно-зависимым патологиям. Однако несмотря на прогресс, достигнутый в последние годы в раскрытии этиологии и патогенеза данных заболеваний, роль такого его значимого звена, как дисбиоз кишечника, до сих пор нуждается в изучении. Известно, что при всех формах ПА и СРК постоянны количественные изменения микробных популяций, в первую очередь относящихся к защитной флоре [1, 3]. Как нами было показано ранее [2, 4] при ПА эти изменения зависят от возраста. У детей до 7 лет в фекалиях преобладает пониженный уровень лактобактерий (ЛАБ) при сохранении нормального содержания бифидобактерий. Для детей старше 7 лет и взрослых характерно снижение бифидокомпонента на фоне возрастной нормы ЛАБ. При СРК снижается уровень как бифидо-, так и ЛАБ, а также энтерококков. Отмеченные проявления дисбаланса микроорганизмов в кишечнике довольно устойчивы и не всегда эффективно поддаются коррекции при применении пробиотиков.
В последние годы появились вполне обоснованные предположения, согласно которым одним из факторов, способствующих аллергическим состояниям, является нарушение видового спектра ведущих защитных популяций микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Так, при отсутствии сдвигов в количественных уровнях бифидофлоры измененный качественный состав ее представителей поддерживал атопический дерматит у детей [3, 7]. Установлено, что в каскаде реакций, обеспечивающих специфическую гиперреактивность организма в ответ на поступающие с пищей антигены, определяющая функция принадлежит резидентным представителям микрофлоры, имеющим рецепторы к пищевым белкам и активно участвующим в метаболических процессах. Сегодня в этом качестве главным образом рассматривают ЛАБ, которые, проявляя кислотоустойчивость и имея численное преимущество в микрофлоре тонкой кишки, своими энзимами способны модифицировать белковые структуры пищевых антигенов, которые после этого уже не воспринимаются как чужеродные [5-8].
Также известно, что определенная часть штаммов Lactobacillus spp., Lactococcus spp. способна синтезировать в ЖКТ высокомолекулярные соединения - полипептиды с бактерицидной активностью. Это позволяет им конкурировать с патогенными и условно-патогенными микробами, а также элиминировать последние из ЖКТ и тем самым снижать число чужеродных микробных антигенов. Особенно это важно при СРК, поскольку ЛАБ, вырабатывающие бактериоцины, предупреждают колонизацию слизистой оболочки ЖКТ микробами, которые обусловливают развитие воспалительной реакции [3, 5].
Однако подобная информация крайне скудна. Поэтому для дальнейшего понимания роли кишечных ЛАБ в механизмах ПА и СРК необходимо изучить качественный состав указанной популяции. Целью настоящего исследования явилось изучение уровня количественного содержания и видовой структуры ЛАБ, находящихся в толстой кишке у лиц с ПА и СРК.
Материал и методы
Материал для исследований (фекалии) был получен в 2008 г. от больных, находившихся на стационарном или амбулаторном лечении в Клинике питания НИИ питания РАМН, НЦЗД РАМН, Московской детской городской клинической больнице Св. Владимира. Для исследований были отобраны 2 группы больных разного возраста, которые в стационаре прошли полное клинико-биохимическое обследование, анализ нутритивного статуса, инструментальные и другие исследования, подтвердившие наличие у больных ПА и СРК. Больные с разными формами ПА (подострой формой и в период ремиссии) вошли в 1-ю группу; больные СРК с запором, гастритом и гастродуоденитом - во 2-ю группу. Общее число обследуемых составило 30; в 1-й группе было 9 взрослых (от 16 до 68 лет) и 6 детей старше 1 года; во 2-й группе - 14 взрослых (от 18 до 78 лет) и 1 ребенок старше 1 года. Не позже 4 ч после взятия материала образцы фекалий разводили фосфатно-тиогликолевым буфером и количественно засевали на дифференциально-диагностические и селективные среды для выделения и подсчета основных защитных популяций (бифидобактерии - на среду ГЦБ, ЛАБ - на среду MRS). По окончании культивирования посевы микроскопировали. Количество микроорганизмов выражали в lg колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г фекалий. Для определения видовой принадлежности ЛАБ изучали все типы колоний, вырастающих на среде MRS. Изоляты, отнесенные по признаку морфологии к бесспоровым грамположительным палочкам и коккам, проверяли на отсутствие каталазы и подвергали расширенной биохимической идентификации с использованием тест-панелей API CHL 50 (BioMerieux, Франция), включающих 50 тестов.
Полученные результаты с помощью компьютерной программы обработаны статистически по критерию Стьюдента с вычислением средней арифметической (М), ее ошибки (m), достоверности устойчивости (t) и коэффициента сравнения (р).
Результаты и обсуждение
Результаты исследований изложены в табл. 1-4.
Как видно из табл. 1, у больных ПА содержание ЛАБ в фекалиях находилось в границах физиологической нормы, но было ниже, чем при СРК, что носило характер устойчивой тенденции (t=1,8). Причем у взрослых больных найденные различия были достоверными (t=2,6; р<0,05). Это сочеталось с пониженным по сравнению с нормой содержанием бифидобактерий, составившим lg 7,4±0,4 КОЕ/г, что, как известно, характерно для лиц с ПА старшего возраста [6].
В качественном составе популяций ЛАБ обнаруженные различия между группами больных с ПА и СРК в основном касались относительного содержания в сумме изолятов отдельных представителей, в том числе видов нерезидентной микрофлоры. Доминировали при обеих патологиях грамположительные кокки, доля которых при ПА и СРК составляла соответственно 40 и 41,4%. Однако качественный состав их оказался различным. Так, доля молочнокислых кокков у больных с ПА не превышала 2,5%, а у больных с СРК составляла 17% (т.е. была в 7 раз больше). При этом у больных с ПА педиококков в фекалиях выделялось в 4 раза больше, чем у больных с СРК. Это может свидетельствовать о наличии в дистальных отделах кишечника при ПА повышенных количеств неутилизированных аминокислот, в которых нуждаются педиококки.
При оценке значимости микробных популяций различной групповой и родовой принадлежности проведена статистическая обработка данных с использованием критерия χ2 для вычисления сопряженности признаков (см. табл. 2).
Как видно из этой таблицы, различия в содержании в фекалиях больных молочнокислых кокков родов Lactococcus и Leuconostoc оказались достоверными при уровне значимости p<0,025%, что свидетельствует о влиянии ПА на снижение доли этих микробов в популяции ЛАБ, обнаруживаемой у больных при наличии указанного заболевания. Повышение же удельного веса педиококков у этих больных имело лишь характер тенденции: различия в содержании ЛАБ и дрожжей были незначимыми. Это согласуется с данными, опубликованными ранее [7]. Однако в наших исследованиях не подтвердилась установленная в указанной работе связь между наличием атопического дерматита и повышением содержания дрожжевых грибов в микробиоценозе у обследованных.
Полученные данные о низком содержании молочнокислых кокков у лиц, страдающих ПА, логично связать с ранее обнаруженными в наших исследованиях признаками функционального дефицита лактофлоры, а именно со снижением антагонистической активности ЛАБ [2].
В этой связи важно отследить видовую принадлежность аналогичных популяций, микробов, выделенных из фекалий конкретных больных, и проанализировать потенциал функциональной активности идентифицированных микробов в зависимости от характера рассматриваемых нами заболеваний (см. табл. 3). Как следует из этой таблицы, функционально-активные ЛАБ (представители родов Lactobacillus и Lactococcus) обнаруживаются не у всех больных. В группе больных с ПА частота выделения была меньше (73%), чем у больных, страдающих СРК (93%). Кроме того, в фекалиях больных ПА в 5 раз реже, чем в группе сравнения, выявлялось несколько видов ЛАБ у одного человека одновременно.
Таблица 1. Характеристики кишечной лактофлоры у больных пищевой аллергией и синдромом раздраженной кишки с запором
Таблица 2. Зависимость присутствия различных популяций бактерий в составе лактофлоры от наличия у больных пищевой аллергии или синдрома раздраженной кишки
Таблица 3. Индивидуальные данные о видовой принадлежности лактобактерий в толстой кишке у лиц, страдающих пищевой аллергией и синдромом раздраженной кишки
Таблица 4. Обобщенные данные о видовой принадлежности лактобактерий, присутствующих в толстой кишке у лиц, страдающих пищевой аллергией и синдромом раздраженной кишки
Спектр выявленных видов бактерий у больных ПА был в 1,5 раза более узким, чем у больных с СРК (8 против 12). При ПА с большей частотой обнаруживались 3 вида ЛАБ - Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbruekii ssp. delbruekii, Lactobacillus plantarum, а при СРК - 4 (Lactococcus lactis, Lactobacillus delbruekii ssp. delbruekii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus ssp. curvatus). Среди идентифицированных изолятов присутствовали виды микробов, которые, согласно современным представлениям, способны к выработке бактериоцинов (L. delbruekii ssp. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum, L. acidophilus, Lactococcus lactis ssp. lactis, L. paracasei ssp. paracasei). Содержание упомянутых выше потенциальных продуцентов иммунопептидов в изученных выборках больных с ПА и СРК составило соответственно 5 и 10 штаммов. При этом все идентифицированные ЛАБ в группе лиц с СРК относились к гомоферментативным видам, основным конечным продуктом метаболизма которых является молочная кислота. В то же время у больных с ПА присутствовали как гомо-, так и гетероферментативные ЛАБ, способные продуцировать разные типы органических кислот. Вместе с тем вопрос, обладают ли типы ЛАБ, участвующие в сбраживании углеводов, протеолитической активностью и, соответственно, способностью видоизменять конфигурацию белковых антигенов, требует дальнейшего изучения.
Учитывая потенциальную роль ЛАБ, обусловливающих положительное воздействие на механизм пищевой толерантности, можно сказать, что у больных, страдающих ПА, возможностей для реализации таких эффектов значительно меньше, чем у больных СРК.
Таким образом, нарушения качественного состава лактофлоры толстой кишки при ПА независимо от формы проявления и периода заболевания имеют иной характер, чем при СРК. Они проявляются меньшей частотой выявления функционально активных видов ЛАБ при более узком видовом спектре ЛАБ и присутствии меньшего числа видов - потенциальных продуцентов бактериоцинов.
Это перспективно в плане дифференциации ПА и других длительно протекающих заболеваний, сопровождающихся дисбиозом кишечника: при диагностике как ПА, так и СРК целесообразно использовать комплексную оценку микробиоценоза с определением уровня и соотношения бифидо- и лактофлоры, а также исследовать характеристики ЛАБ (морфологический состав популяции, долю в нем функционально активных Lactobacillus и Lactococcus spp., идентификацию штаммов данных групп микроорганизмов).
С учетом сказанного выше работа по изучению видовой принадлежности представителей ведущих защитных популяций, вегетирующих в кишечнике лиц с ПА (лакто- и бифидобактерий), должна быть продолжена при использовании современных методов идентификации, которые основаны на полифазном таксономическом подходе с сочетанием ключевых биохимических и генотипических характеристик штаммов. Это крайне важно не только для повышения информативности диагностики и, соответственно, обоснования выбора более эффективных путей коррекции заболеваний, но и для дальнейшего понимания роли кишечной микрофлоры в механизмах ПА и СРК.
Литература
1. Киркман М.Ф., Седгард Л. Контракт с кишечником. Микробиология пищеварительного тракта и пробиотики: Пер. с англ. - М.: Арнебия, 2004. - 160 с.
2. Кузнецова Г.Г., Шевелева С.А., Орлова Н.Г. и др. // Вопр. дет. диетол. - 2003. - Т. 1, № 6. - С. 15-20.
3. Руш К., Руш Ф. Микробиологическая терапия. Теоретические основы и практическое применение: Пер. с нем. - М.: Арнебия, 2003. - 160 с.
4. Флуер Ф.С., Кузнецова Г.Г., Батищева С.Ю. и др. // Вопр. питания. - 2006. - Т. 75, № 4. - С. 46-49.
5. Червинец Ю.В. Высоко антагонистические штаммы лактобацилл, перспективные для конструирования новых пробиотических препаратов: Автореф. дис. - канд. мед. наук. - М., 2006. - 24 с.
6. Isolaury E., Arlova T., Sutas Y. et al. // Clin. Exp. Allergy. - 2000. - Vol. 30. - Р. 1604-1610.
7. Kalliomaki M., Kirjavainen P., Eerola E. et al. // J. Аllergy Сlin. Immunol. - 2001. - N 1. - Р. 129-134.
8. Salminen S., Bouley C., Boutron-Ruault M.C. et al. // Br. J. Nutr. - 1998. - Vol. 80, suppl. 1. - Р. 147-171.