Характерная особенность рациона современного человека - повышение в нем уровня полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), причем главным образом за счет ПНЖК семейства ω-6, что приводит в питании к относительному дефициту ПНЖК ω-3 [12, 25]. Так, в современном западном рационе соотношение ПНЖК ω-6: ω-3 варьирует от 10:1 до 20:1, в то время как оптимальное отношение, согласно [4], не должно превышать 5-10:1.
Результаты, накопленные за 25 лет изучения функциональной роли ПНЖК ω-3, свидетельствуют о том, что их адекватное потребление в раннем возрасте абсолютно необходимо для обеспечения здоровья в последующие возрастные периоды [6]. Получены доказательства их значения для снижения риска развития и лечения наиболее распространенных хронических заболеваний - сердечнососудистых, сахарного диабета, ожирения, ряда неврологических болезней [5, 28].
Биологические эффекты ПНЖК ω-3 прежде всего связывают с их влиянием на функции мембран клеток. Являясь эссенциальным компонентом фосфолипидов всех клеточных мембран, ПНЖК ω-3 определяют их текучесть, тем самым они могут влиять на свойства мембраносвязанных рецепторов, сигнальную трансдукцию, активность большого числа мембраносвязанных ферментов. В то же время до сих пор недостаточно изучена роль ПНЖК ω-3 в развитии процессов свободнорадикального окисления, являющегося общим патогенетическим фактором многих из вышеперечисленных заболеваний человека. Наличие большого числа ненасыщенных двойных связей в структуре длинноцепочечных ПНЖК ω-3 делает их главной мишенью для активных форм кислорода (АФК), что приводит к усилению процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и возрастанию вероятности развития окислительного стресса [18, 29]. Наряду с данными о прооксидантных свойствах ПНЖК ω-3 в ряде сообщений рассматривается их антиоксидантное действие - способность подавлять ПОЛ и проявления окислительного стресса [7, 27]. Особого внимания заслуживают полученные в последние годы данные, указывающие на возможное участие ПНЖК ω-3 (в составе липопротеидов) в формировании антиоксидантной системы крови [6].
Полагают, что антиоксидантное действие ПНЖК ω-3 является результатом как их радикал-связывающей способности, так и влияния на активность антиоксидантных ферментов. Данные, полученные in vitro, показали, что ПНЖК ω-3 и, в наибольшей степени, эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) могут напрямую связывать супероксидный радикал [27]. Высокая радикал-связывающая активность in vitro характерна и для докозагексаеновой кислоты (ДГК) [32]. В исследованиях на клеточных культурах обнаружено, что ПНЖК ω-3 способны индуцировать активность и экспрессию генов антиоксидантных ферментов - глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы, гемоксигеназы-1, ключевого фермента синтеза глутатиона - γ-глутамилцистеинсинтетазы [11, 30]. Обогащение рациона крыс ПНЖК ω-3 сопровождалось подавлением окислительного стресса, возрастанием в печени активности каталазы и глутатионтрансферазы [26]. В эксперименте показано, что включение в рацион мышей льняного масла или рыбьего жира с высоким содержанием ПНЖК ω-3 приводит к усилению у них экспрессии генов глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы и γ-глутамилцистеинсинтетазы в сердечной мышце [10].
Целью настоящей работы было изучение влияния ПНЖК ω-3 на антиоксидантный потенциал у крыс, который оценивали по активности антиоксидантных ферментов, резистентности микросом печени к индуцированному ПОЛ ex vivo и показателям стабильности лизосомальных мембран, отличающихся высокой чувствительностью к действию АФК.
Материал и методы
Исследования проводили на крысах-самцах Вистар с исходной массой тела 135-150 г. Животные были разделены на 3 группы по 8 крыс в каждой. На протяжении всего эксперимента крысы находились в клетках из высокотемпературного полисульфона по 2 особи при естественном освещении. В работе придерживались нормативов содержания лабораторных животных в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и других научных целях (Совет Европы, Страсбург, 1986 г.).
Крысы 1-й группы (контрольная) получали стандартный полусинтетический рацион [3], крысы 2-й группы - тот же рацион с добавлением смеси ЭПК и ДГК в количестве, соответствующем дозе 0,3 г на 1 кг массы тела, рацион животных 3-й группы содержал ту же смесь ЭПК и ДГК в дозе 1 г/кг. Использованные в работе дозы ПНЖК ω-3 с учетом коэффициента конверсии соответствуют дозам 2,8 и 9,6 г для человека с массой тела 60 кг и вписываются в диапазон доз, используемых в клинических исследованиях [21]. В качестве источника ЭПК и ДГК использовали препарат Omacor (Abbott products, Германия), содержащий ЭПК и ДГК в соотношении 1,2:1. Корм животные получали в режиме свободного доступа в количестве 25-30 г на крысу, что соответствовало 15 г сухой смеси. Длительность эксперимента составила 4 нед. Наблюдение за состоянием животных и поедаемостью корма проводили ежедневно, определение массы тела - еженедельно.
Для оценки антиоксидантного статуса крыс в плазме крови определяли общую антиоксидантную активность (АОА) с использованием тест-системы FRAP [16], активность параоксоназы-1 [14] и содержание жирорастворимых витаминов - витамина Е (α-токоферола) и витамина А (ретинола). В последнее время значительно возрос интерес к параоксоназе-1, в частности к ее роли как фермента антиатерогенного действия, играющего ключевую роль в защите липопротеидов высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП) от окисления.
В микросомах, выделенных из печени, определяли активность параоксоназы-1 и гемоксигеназы-1 [24], во фракции цитозоля печени - активность хинонредуктазы [15], общую активность глутатионтрансферазы с использованием 1-хлор-2,4динитробензола в качестве субстрата [20] и АОА. В печени определяли также содержание витаминов Е и А (пальмитата ретинола), а также уровень малонового диальдегида (МДА) [2].
Для изучения влияния ПНЖК ω-3 на резистентность микросом к индуцированному NADPH-Fe2+ ПОЛ использовали микросомы, выделенные из печени животных 1-3-й групп. Окислительную модификацию липидов оценивали по накоплению ТБК-реактивных продуктов ПОЛ. Реакционную смесь, содержащую микросомы (1 мг белка в 1 мл), NADPH в конечной концентрации 0,025 мМ, 12 мкМ Fe(NH4)2 (SO4)2 Ч 6H2O и 0,2 мМ Na4 P2O 7 Ч H2O, инкубировали при 37 оС в течение 10 мин. После остановки реакции 30% ТХУ определяли количество образовавшихся ТБК-реактивных соединений.
Стабильность лизосомальных мембран оценивали по изменению неседиментируемой активности лизосомальных ферментов - арилсульфатаз, β-глюкуронидазы и β-галактозидазы [1]. Общую активность ферментов лизосом определяли в гомогентатах печени, неседиментируемую - во фракции цитозоля печени и выражали в процентах от общей.
Содержание витаминов А (ретинола, пальмитат ретинола) и Е (α-токоферола) в плазме крови и печени крыс определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [8].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни и t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р≤0,05.
Результаты и обсуждение
Содержание крыс в течение 4 нед на рационах, обогащенных ПНЖК ω-3, не оказывало какого-либо влияния на массу тела и суточные привесы, а также на относительную массу печени (табл. 1). При этом в плазме крови крыс опытных групп обнаруживали небольшое, но статистически достоверное уменьшение общей АОА, оцениваемой по восстанавливающей способности плазмы [16], - на 14 и 17% во 2-й и в 3-й группах соответственно (табл. 2). Активность параоксоназы-1 была несколько понижена (на 14%; р<0,05) в плазме крови крыс 2-й группы, но не отличалась от контрольного уровня у крыс 3-й группы. Включение в рацион крыс ПНЖК ω-3 приводило к существенному снижению содержания витаминов Е и А в плазме крови: α-токоферола - соответственно на 31 и 30% у крыс 2-й и 3-й групп, ретинола - на 32 и 19%.
Как видно из данных, представленных в табл. 3, не обнаружено различий в АОА цитозоля печени крыс контрольной группы и крыс, получавших рационы с различным содержанием ПНЖК ω-3 (2-я и 3-я группы). В то же время активность изученных антиоксидантных ферментов в печени возрастала в зависимости от уровня ПНЖК ω-3 в рационе. Так, у животных2-й и 3-й групп активность параоксоназы-1 была выше, чем в 1-й группе, соответственно на 40 и 45%. Активность гемоксигеназы-1 в печени крыс 3-й группы превышала таковую у крыс 1-й группы на 21% (р>0,05) и 2-й группы - на 35% (р<0,05). Активность хинонредуктазы у крыс 2-й и 3-й групп превышала контрольный уровень соответственно на 28 и 68% (p<0,05). Небольшое, но достоверное возрастание общей активности глутатионтрансферазы (на 19% по сравнению с контролем) выявлено у животных 3-й группы. Следует отметить, что дозозависимое возрастание в печени антиоксидантных ферментов сопровождало дозозависимое увеличение в ней содержания продуктов ПОЛ. Уровень МДА в печени крыс 2-й и 3-й групп достоверно превышал контрольный уровень соответственно на 74 и 107%.
В отличие от плазмы крови в печени крыс, получавших обогащенные ПНЖК ω-3 рационы, не обнаружено каких-либо изменений в содержании витамина А (пальмитат ретинола), а уровень витамина Е (α-токоферола) у крыс 3-й группы был выше, чем в контроле на 29% (p<0,05).
Таблица 1. Масса тела и относительная масса печени крыс, получавших рационы с различным содержанием полиненасыщенных жирных кислот ω-3 (М±m)
Таблица 2. Антиоксидантная активность, активность параоксоназы-1 и содержания α-токоферола и ретинола в плазме крови крыс, получавших рационы с различным содержанием полиненасыщенных жирных кислот ω-3
Таблица 3. Антиоксидантная активность, активность антиоксидантных ферментов, содержание α-токоферола, пальмитата ретинола и малонового диальдегида в печени крыс, получавших рационы с различным содержанием полиненасыщенных жирных кислот ω-3 (M±m)
Определение скорости NADPH-Fe2+-индуцированных микросом, выделенных из печени крыс, не выявило существенных изменений чувствительности микросомальных мембран к ПОЛ при увеличении содержания ПНЖК ω-3 в рационе. Интенсивность ПОЛ составила для всех групп соответственно 7,93±0,63; 9,37±0,59 и 8,99±0,45 нмоль МДА/мг белка за 10 мин.
Не обнаружено также какого-либо влияния ПНЖК ω-3 на общую и неседиментируемую активность ферментов лизосом печени крыс (табл. 4), что указывает на отсутствие изменений стабильности лизосомальных мембран.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что непродолжительное, в течение 4 нед, содержание крыс на рационах, обогащенных ДГК и ЭПК, приводит к умеренно выраженному усилению процессов ПОЛ и началу развития окислительного стресса. Это проявлялось в небольшом, но статистически достоверном уменьшении АОА (восстанавливающей емкости) плазмы крови, снижении в ней концентрации витаминов Е и А и активности параоксоназы-1.
Аналогичные изменения показателей антиоксидантного потенциала плазмы крови наблюдали в экспериментальных исследованиях с использованием различных источников ПНЖК ω-3 [22, 23]. Уменьшение содержания витамина Е в плазме крови авторы связывают главным образом с гиполипидемическим действием ПНЖК ω-3. Менее вероятно снижение его концентрации за счет окисления в условиях усиления процессов ПОЛ. Так, в исследованиях [23] при длительном содержании крыс на рационах с разными видами рыбьего жира снижение уровня α-токоферола в плазме крови не сопровождалось образованием в плазме или печени продуктов окисления α-токоферола.
Известно, что параоксоназа-1 синтезируется в печени, где выявляется во фракции микросом и циркулирует в кровотоке в связанном с ЛПВП виде. Считается, что уровень параоксоназы-1 в плазме крови отражает ее экспрессию в печени. Можно предположить, что обнаруженное снижение активности параоксоназы-1 в плазме крови при одновременном ее увеличении в печени крыс, получавших ПНЖК ω-3, связано с нарушением синтеза и секреции ЛПВП или взаимодействия фермента с ЛПВП [17]. В работе [22] у крыс, получавших рыбий жир в течение 20 дней, установлена прямая корреляция между степенью снижения активности параоксоназы-1 и уменьшением уровня ЛПВП в плазме крови. Нельзя исключить возможность ингибирующего действия на параоксоназу окисленных ЛПНП [13].
Как уже отмечалось, антиоксидантные свойства ПНЖК ω-3 связывают с их способностью индуцировать активность и экспрессию генов ферментов антиоксидантной защиты, что нашло подтверждение и в настоящей работе. В ряде исследований возрастание активности антиоксидантных ферментов также сопровождалось усилением накопления в печени продуктов ПОЛ. Так, по данным [26], увеличение содержания в печени крыс α-линоленовой кислоты, ЭПК и ДГК приводило к росту образования продуктов ПОЛ и одновременному повышению активности каталазы и глутатионтрансферазы. В исследованиях [10] получены прямые доказательства наличия корреляционной связи между накоплением продуктов перекисного окисления ПНЖК ω-3 (4-гидроксигексинала) и активацией антиоксидантных ферментов - глутатионредуктазы, гемоксигеназы-1, глутатионтрансферазы, экспрессия генов которых, как и изученных нами ферментов, находится под контролем транскрипционного фактора Nrf2, активаторами которого являются АФК. Имеются экспериментальные доказательства способности окисленных ЭПК и ДГК активировать Nrf2 и усиливать его транслокацию в ядро с последующим усилением транскрипции мРНК глутатионтрансферазы, хинонредуктазы, гемоксигеназы-1 и других антиоксидантных ферментов [19, 31].
Таблица 4. Общая и неседиментируемая активность ферментов лизосом печени крыс, получавших рационы с различным содержанием полиненасыщенных жирных кислот ω-3 (M±m)
В заключение следует отметить отсутствие каких-либо изменений уровня АОА в печени у крыс, получавших рацион с включением ПНЖК ω-3. Не обнаружено также влияния ПНЖК ω-3 на общую и неседиментируемую активность ферментов лизосом, что указывает на отсутствие изменений стабильности лизосомальных мембран. Резистентность к индуцированному ex vivo ПОЛ микросом, выделенных из печени крыс, получавших ПНЖК ω-3, существенно не отличалась от показателя в контрольной группе. Это позволяет предположить, что усиление процессов ПОЛ, происходящее при включении ПНЖК ω-3 в рацион в достаточной степени сбалансировано индуцированной этими же ПНЖК активностью антиоксидантных ферментов и увеличением содержания витамина Е в печени. Е. Anderson [9] предположил, что в определенной степени терапевтическое действие ПНЖК ω-3 является результатом вызванного ими липоокислительного стресса, который приводит к активации транскрипционных факторов (Nrf2) и последующей индукции генов большого числа антиоксидантных ферментов и других защитных факторов.
Литература
1. Дингл Дж. Лизосомы. Методы исследования. - М.: Мир, 1980. - 342 с.
2. Костюк В.А., Потапович А.И. // Вопр. мед. химии. - 1987. - № 3. - С. 115-118.
3. Кравченко Л.В ., Аксенов И.В., Трусов Н.В и др. // Вопр. питания. - 2012. - № 1. - С. 24-29.
4. Методические рекомендации МР2.3.1.2432-08. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.
5. Погожева А.В. Сердечно-сосудистые заболевания, диета и ПНЖК -3. - М., 2000. - 320 с.
6. Шилина Н.М. // Вопр. питания. - 2010. - № 5. - С. 15-23.
7. Шилина Н.М., Медведев Ф.А., Нетребко О.К. и др. // Вопр. дет. диетологии. - 2012. - № 6. - С. 17-22.
8. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Харитончик Л.А. и др. // Вопр. питания. - 1993. - № 1. - С. 43-47.
9. Anderson E.J., Taylor D.A. // 1000 Med. Rep. - 2012. - Vol. 4. - P. 13.
10. Anderson E.J., Thayne K., Harris M. et al. // Biochem. J. - 2012. - Vol. 441. - P. 359-366.
11. Arab K., Rossary A., Flouriе F. et al. // Br. J. Nutr. - 2006. - Vol. 95. - P. 18-26.
12. Aranceta J., Pеrez-Rodrigo C. // Br. J. Nutr. - 2012. - Vol. 107. - Suppl. 2. - P. S8-S22.
13. Aviram M., Rosenblat M., Billecke S. et al. // Free Radic. Biol. Med. - 1999. - Vol. 26. - P. 892-904.
14. Beltowski J., Jamroz-Wisniewska A., Borkowska E. et al. // Pharmacol. Res. - 2005. - Vol. 51. - P. 523-532.
15. Benson A., Hunkeler M. J., Talalay P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1980. - Vol. 77. - P. 5216-5220.
16. Benzie I.F.F., Strain J.J. // Anal. Biochem. - 1996. - Vol. 239. - P. 70-76.
17. Ferretti G., Bacchetti T. // Nutr. Met. Cardiovas. Dis. - 2012. - Vol. 22. - P. 88-94.
18. Filaire E., Massart A., Portier H. et al. // Int. J. Sport Nutr. Exerc. Metab. - 2010. - Vol. 20. - P. 496-506.
19. Gao L., Wang J., Sekhar K.R. et al. // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282. - P. 2529-2537.
20. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249. - P. 7140-7150.
21. Kanji S., Seely D., Yazdi F. et al. // Syst. Rev. - 2012. - Vol. 1. - P. 26-28.
22. Kudchodkar B.J., Lacko A.G., Dory L. et al. // J. Nutr. - 2000. - Vol. 130. - P. 2427-2433.
23. McGuire S.O., Alexander D.W., Fritshe K.L. // J. Nutr. - 1997. - Vol. 127. - P. 1388-1394.
24. McNally S.J., Ross J.A., Garden O.J. et al.. // Anal. Biochem. - 2004. - Vol. 332. - P. 398-400.
25. Patterson E., Wall R., Fitzgerald G.F. et al. // J. Nutr. Met. - Vol. 2012. - Article ID 539426, 16 p.
26. Ramaprasad T.R., Baskaran V., Krishnakantha T.P. et al. //Mol. Cell Biochem. - 2005. - Vol. 280. - P. 9-16.
27. Richard D., Kefi K., Barbe U. et al. // Pharmacol. Res. - 2008. - Vol. 57. - P. 451-455.
28. Simopoulos A.P. // Exp. Biol. Med. - 2008. - Vol. 233. - P. 6 74 - 6 8 8 .
29. Song J.H., Miyazawa T. // Atherosclerosis. - 2001. - Vol. 155. - P. 9 -18 .
30. Van Beelen V.A., Aarts J.M.M.J.G., Reus A. et al. // FEBS Lett. - 2006. - Vol. 580. - P. 4587-4590.
31. Varady J., Gessner D.K., Most E. et al. // Lipids Health Dis. - 2012. - Vol. 11. - P. 31-37.
32. Yavin E. // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. - 2006. - Vol. 75. - P. 203-211.