Витамин А играет важную роль в процессах роста, репродукции, дифференцировки эпителиальной и костной ткани, а также в поддержании иммунитета и зрения. Витамин Е представлен группой токоферолов и токотриенолов, которые обладают антиоксидантными свойствами. Он является универсальным стабилизатором клеточных мембран, защищая полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), липопротеиды низкой плотности от окисления свободными радикалами. Витамин Е прежде всего необходим для функционирования половых желез, сердечной мышцы. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о том, что оптимальное содержание витаминов А и Е в рационе снижает риск развития таких тяжелых хронических заболеваний, как сердечнососудистая недостаточность, возрастная макулярная дегенерация, онкологических и др.
Ряд эндо- и экзогенных факторов, в том числе окислительный стресс, неадекватное содержание липидов в рационе приводят к ухудшению обеспеченности организма витаминами А и Е даже при нормальном уровне их потребления. Так, снижение поступления жира с рационом (до 5 г в сут или до 30% от общей калорийности рациона) сопровождалось достоверным ухудшением обеспеченности организма (особенно у детей) жирорастворимыми витаминами [17, 26]. В то же время у людей, получавших пищу с высоким содержанием жира, уровень витамина Е в плазме крови был значительно выше, чем у получавших такое же количество витамина на фоне рациона с низким содержанием жира [19]. Увеличение содержания пальмитата ретинола обнаруживали в печени экспериментальных животных (крысы и хорьки), находившихся в течение 4 нед на рационе с повышенным содержанием жира [14, 24]. В то же время установлено, что избыточное поступление с рационом жира, выявляемое у значительной части населения нашей страны [2, 7], является одним из факторов развития окислительного стресса, характеризующегося снижением антиоксидантного потенциала организма. В ряде исследований у лиц с ожирением выявляли достоверное снижение уровня витаминов А и Е в плазме крови [12, 20].
Флавоноиды и пищевые индолы являются биологически активными соединениями (БАС), частота потребления которых с рационом обратно пропорциональна риску развития сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [18, 21]. В настоящее время представители этих классов БАС - индол-3карбинол (И-3-К) и кверцетин, который в природе находится главным образом в виде гликозида рутина (Р), - широко используются в составе биологически активных добавок к пище. Изучение в условиях in vitro и in vivo механизма биологической активности указанных БАС показало, что эти соединения вступают в реакции инактивации активных форм кислорода и защищают ДНК клетки от повреждений, вызванных окислительным стрессом [5, 13], индуцируют гибель опухолевых клеток [22], повышают активность ферментов метаболизма ксенобиотиков и антиоксидантной защиты [8, 27].
Несмотря на многочисленные доказательства антиоксидантной активности Р и в меньшей степени И-3-К, публикаций по изучению влияния Р на обеспеченность организма витаминами А и Е весьма немного, а в отношении индолов они практически отсутствуют. Повышение уровня α-токоферола в плазме крови и печени крыс обнаруживали при их содержании в течение 30 дней на рационе с включением 0,2% кверцетина (агликона Р) [16]. В другом исследовании содержание мышей в течение 40 дней на рационе с 0,1% кверцетина приводило к достоверному уменьшению концентрации α-токоферола в печени [10]. В модельных системах in vitro флавоноиды, в том числе кверцетин, защищали α-токоферол от окисления [16].
С учетом неоднозначной роли жирового компонента рациона в обеспечении организма жирорастворимыми витаминами-антиоксидантами было изучено влияние И-3-К и Р на обеспеченность крыс витаминами А и Е при различном содержании жира в рационе.
Материал и методы
Проведено 4 серии экспериментов на 84 крысах- самцах Вистар с исходной массой тела 80-110 г (животные получены из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая"). На протяжении всего эксперимента животные находились в клетках (Techniplast, Италия) по 2-3 особи при приглушенном естественном освещении, относительной влажности воздуха от 40 до 60%, температуре 23±2 оС и имели свободный доступ к воде и корму (15 г сухой массы на крысу в сутки). Массу тела животных определяли еженедельно.
После 7-дневного карантина на рационе вивария крысы были распределены на 12 групп (по 6-8 особей в каждой) с одинаковой массой тела. Рационы животных всех групп содержали 21% казеина, 1% сухой смеси водорастворимых витаминов, 0,2% смеси жирорастворимых витаминов в подсолнечном масле, 4% солевой смеси, 0,3% метионина, 2% микрокристаллической целлюлозы [4]. Содержание витаминов в 100 г рациона за счет внесения в него смесей жиро- и водорастворимых витаминов составило: А - 400 МЕ, Е - 6 МЕ, D3 - 70 ME, K - 100 мкг, В1 - 0,4 мг, В2 - 0,6 мг, В6 - 0,4 мг, В9 - 0,2 мг, В12 - 3 мкг, РР - 3 мг, кальция D-пантотената - 1,5 мг, D-биотина - 0,01 мг. Жировой компонент рациона у всех крыс был представлен смесью лярда и подсолнечного масла (1:1). Массовая доля липидов в рационах крыс была разной: низкая (1% от массы корма, по калорийности - 3%; жир в рационе был представлен исключительно остаточным количеством липидов в казеине, крахмале и смесью жирорастворимых витаминов), физиологическая (11% от массы корма, 26% от общей энергетической ценности рациона за счет внесения в него жирового компонента в дозе 10 г на 100 г сухой массы корма) и повышенная (31% от массы корма, 56% от общей энергетической ценности рациона в результате внесения в него жирового компонента из расчета 30 г на 100 г сухой массы корма). Содержание витамина Е в рационе крыс с разным количеством жира в корме составило соответственно 6, 9 и 15 МЕ на 100 г корма за счет токоферолов в подсолнечном масле (60 МЕ/100 г масла). Общая калорийность 100 г рациона с содержанием 1, 11 и 31% жира (от массы корма) составила соответственно 323, 381 и 496 ккал.
В 1-й серии эксперимента животные в течение 6 нед получали рационы, содержащие жир в количестве (по массе корма) соответственно 1% (группа IЖ1), 11% (группа IЖ11) и 31% (группа IЖ31) без добавления И-3-К. Во 2-й серии экспериментов животные (группы IIЖ1, IIЖ11, IIЖ31) находились в течение такого же времени на тех же рационах, что и животные в 1-й серии опытов, но с добавлением в корм в течение последних 7 дней эксперимента И-3-К из расчета 20 мг на 1 кг массы тела в сут. В 3-й и 4-й сериях эксперимента животных в течение 4 нед содержали на тех же рационах, что и животных в 1-й серии эксперимента (с низким, физиологическим или повышенным содержанием жира), но с включением в корм животным 3-й серии опытов (группы IIIЖ1, IIIЖ11, IIIЖ31) ежедневно в течение 7 и 14 дней до окончания эксперимента И-3-К из расчета 20 мг на 1 кг массы тела в сутки, а в корм животным 4-й серии опытов (группы IVЖ1, IVЖ11, IVЖ31) - ежедневно в течение 7 и 14 дней до окончания эксперимента Р из расчета 0,4 г на 100 г корма. В каждой серии эксперимента животные, находившиеся на рационах с физиологическим (11%) количеством жира, служили контролем для остальных групп (рационы с низким или повышенным количеством жира).
После окончания эксперимента животных под легким эфирным наркозом умерщвляли и подвергали патологоанатомическому вскрытию. Во время декапитации животных собирали кровь, центрифугировали ее в течение 15 мин при 1000 об, отбирали сыворотку и хранили при -20 оС; на секции брали печень, которую взвешивали для определения ее абсолютной и относительной массы, затем гомогенизировали в 50 мМ трис-HCl буфере (рН=7,4). В сыворотке крови и в гомогенате печени каждого животного методом ВЭЖХ [6, 9] определяли содержание витаминов А (ретинола и пальмитата ретинола) и Е (α-токоферола).
Полученные данные обрабатывали с помощью пакетов IBM SPSS Statistics Version 20. Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для независимых переменных. В каждом эксперименте изучали статистические различия между анализируемыми показателями по сравнению с группой относительного контроля, а между экспериментами I и II - в группах с одинаковым уровнем жира в рационе. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
В табл. 1 представлены данные о массе тела, а также об абсолютной и относительной массе печени крыс всех групп в проведенных сериях эксперимента. Видно, что увеличение доли жира в корме с 1 до 11% и до 31% сопровождалось в 1-й серии эксперимента возрастанием массы тела крыс соответственно на 17% (р=0,003) и на 5% (р=0,294). Аналогичное влияние количества жира в рационе на массу тела отмечали и во 2-4-й сериях эксперимента. Включение в рацион И-3-К и Р не влияло на характер изменений массы тела животных, наблюдаемых при повышении содержания жира в корме. Увеличение массы тела животных, происходящее при повышении квоты жира в рационе с 1 до 11% и до 31%, очевидно, связано с увеличением при этом общей калорийности рациона с 323 до 496 ккал/100 г. Однако, как показали данные, полученные в 1-й серии эксперимента, количество жира в рационе не влияло на абсолютную массу печени, но на фоне повышенного поступления липидов (группа IЖ31) отмечалось снижение ее относительной массы на 11% (p=0,011) по сравнению с показателем у животных контрольной группы (IЖ11). У крыс, получавших И-3-К на фоне высокожирового рациона (группа IIЖ31, 2-я серия эксперимента) абсолютная и относительная масса печени возрастала, соответственно на 22% (p=0,004) и на 26% (p=0,006) по сравнению с данными, характерными для животных группы IЖ31 1-й серии эксперимента.
Во 2-4-й сериях эксперимента с включением в рацион БАС при повышении доли жира в рационе с 1 до 11% и далее до 31% отмечали последовательное нарастание абсолютной массы печени крыс соответственно на 7-22% и 5-22%. При этом относительная ее масса достоверно не изменялась.
Таблица 1. Масса тела, абсолютная и относительная масса печени крыс, получавших рационы с различным уровнем жира и с включением биологически активных соединений (БАС) (М±m)
Рис. 1. Влияние содержания жира в рационе с включением биологически активных соединений на концентрацию ретинола в плазме крови крыс
Здесь и на рис. 2 и 3 римскими (I-IV) обозначены серии эксперимента; различия между значениями, обозначенными разными буквами, статистически достоверны (р<0,05).
Рис. 2. Влияние содержания жира в рационе (в % от массы корма) с включением биологически активных соединений на уровень пальмитата ретинола в печени крыс
Данные о влиянии количества жира в рационе и дополнительного поступления с ним И-3-К и Р на уровень витаминов А и Е в плазме крови и печени животных представлены на рис. 1-3 и в табл. 2. Как видно из рис. 1, в 1-й серии эксперимента при увеличении уровня жира в корме с 1% (группа IЖ1) до 11% (группа IЖ11) концентрация витамина А (ретинола) в плазме крови крыс не изменилась, а при дальнейшем (примерно 3-кратном) повышении квоты жира в корме до 31% (группа IЖ31) увеличилась на 26% (р=0,005) по сравнению с таковой у животных группы IЖ11 из этой серии эксперимента.
Во 2-й серии эксперимента (продолжительностью 6 нед) при включении И-3-К в рацион животных контрольной группы (IIЖ11) отмечено парадоксальное снижение концентрации ретинола в крови крыс на 13% (p=0,010) по сравнению с показателем в группе IIЖ1 в 1-й серии. При этом обращает на себя внимание достоверное (р=0,024) снижение уровня ретинола в плазме крови крыс, получавших И-3-К на фоне высокожирового рациона, по сравнению с уровнем витамина А, обнаруженным у животных группы IЖ31, получавших такой же высокожировой рацион, но без И-3-К.
В 3-й и 4-й сериях эксперимента (продолжительность 4 нед) характер зависимости концентрации ретинола в плазме крови крыс от количества липидов в рационе с добавкой БАС был аналогичен таковому у животных в 1-й серии эксперимента: повышение уровня липидов в корме животных от минимального (1%) до физиологического (11%) не влияло на содержание витамина А в крови, а последующее повышение доли жира в рационе до 31% сопровождалось увеличением концентрации витамина А на 18% (p=0,873) и на 36% (p=0,006) соответственно в группах IIIЖ31 и IVЖ31 по сравнению с контрольными показателями (группы IIIЖ11 и IVЖ11) (см. рис. 1).
Как показано на рис. 2, во всех сериях эксперимента снижение уровня жира в рационе до 1% сопровождалось выраженным уменьшением (в 1,5-2,2 раза; р<0,05) содержания витамина А (пальмитата ретинола) в печени крыс. Данный результат отражает общепринятые представления о том, что уменьшение содержания липидов в рационе до критически минимального уровня снижает усвоение жирорастворимых витаминов. При последующем возрастании в корме квоты жира (до 31%) в группе IЖ31 у животных, не получавших добавок (1-я серия эксперимента), уровень этого витамина в органе незначительно повышался (на 10,6%, р=0,248) по сравнению с таковым в группе относительного контроля (IЖ11). Во 2-4-й сериях эксперимента включение БАС на фоне высокожирового рациона, наоборот, вызывало снижение содержания пальмитата ретинола в печени крыс: в группах IIЖ31, IIIЖ31 и IVЖ31 соответственно на 35% (p=0,002), 22% (p=0,078) и 52% (p=0,004) по сравнению с таковым у контрольных крыс (группы IIЖ11, IIIЖ11 и IVЖ11), получавших рацион с содержанием жира на физиологическом уровне (11% от массы корма). Следует подчеркнуть, что включение И-3-К в высокожировой рацион крыс (IIЖ31) приводило к значительному снижению (на 37%; р=0,002) уровня витамина А в печени животных по сравнению с крысами группы IЖ31 (1-я серия эксперимента), не получавших И-3-К.
Таким образом, включение И-3-К и Р на фоне повышенного количества жира в рационе сопровождалось достоверным уменьшением уровня витамина А в печени животных по сравнению с таковым в группах относительного контроля. Это можно расценивать как ухудшение обеспеченности организма данным витамином. При этом концентрация ретинола в крови (традиционный биомаркер обеспеченности витамином А) не снижалась.
Рис. 3. Влияние содержания жира в рационе (в % от массы корма) с включением биологически активных соединений на уровень α-токоферола в печени крыс
В целом уровни витамина А в плазме крови и печени крыс в 1-й и 2-й сериях эксперимента оказались выше, чем у крыс в 3-й и 4-й сериях эксперимента (см. рис. 1 и 2). Это, по-видимому, является следствием разного возраста животных и различной их массы тела к концу опытов во 2-й и 4-й сериях эксперимента продолжительностью соответственно 6 и 4 нед (см. табл. 1). При этом при проведении 2-й и 3-й серий эксперимента была выявлена статистически значимая связь между массой тела и уровнем витамина А в крови и печени животных, что, очевидно, связано с различной продолжительностью опытов в указанных сериях эксперимента, а следовательно, и с возрастом животных к моменту завершения опытов. Коэффициенты корреляции по Спирмену (ρ) составили соответственно 0,545 (p<0,001) и 0,471 (p=0,002). Повышение уровня витамина А в печени крыс с возрастом отмечалось также в ряде исследований при низком, оптимальном и повышенном содержании витамина А в рационе [11, 15].
Как видно из табл. 2, в 1-й серии эксперимента увеличение в рационе животных массовой доли липидов с 1 до 31% не отражалось на уровне витамина Е в плазме крови, несмотря на то что содержание этого витамина в рационе увеличилось в 2,5 раза: с 6 МЕ (при физиологическом уровне содержания липидов в рационе) до 15 МЕ в 100 г корма (при повышенном содержании жира в рационе) за счет естественного присутствия токоферолов в подсолнечном масле. Во 2-4-й сериях эксперимента концентрация α-токоферола в плазме крови крыс не зависела от уровня липидов в рационе, а также от продолжительности экспериментов (4 и 6 нед). Полученные данные согласуются с результатами исследований [1, 3], выполненных на крысах, в которых было показано, что уровень токоферолов в плазме крови животных на фоне адекватного поступления жира не изменялся при повышении содержания витамина Е в рационе на 78% (с 3,6 до 6,4 МЕ в 100 г корма).
Как видно из рис. 3, в 1-й серии эксперимента (продолжительность 6 нед) наблюдалась прямая связь между квотой жира в рационе, содержанием в нем витамина Е (см. табл. 2) и уровнем α-токоферола в печени крыс. При увеличении массовой доли жира в корме с 1 до 11% уровень витамина Е в печени животных достоверно повышался на 44,5% (р=0,002), а при высоком содержании жира в рационе (до 31%) возрастал в 1,9 раза (р=0,006). Это свидетельствует о том, что повышение квоты жира в рационе сопровождается накоплением витамина Е в печени, хотя концентрация токоферолов в плазме крови при этом достоверно не изменялась (см. табл. 2).
Во 2-й серии эксперимента (продолжительность 6 нед) с включением в рацион животных И-3-К зависимость между содержанием α-токоферола в печени крыс и количеством жира в их корме была такая же, как у животных в 1-й серии эксперимента. При добавлении в рацион И-3-К содержание токоферолов в печени животных в группах, получавших в течение 6 нед, одинаковое количество жира, достоверно не различалось. Таким образом, И-3-К не влиял на обеспеченность организма крыс витамином Е при пониженном, физиологическом и повышенном содержании липидов в рационе.
В 3-й и 4-й сериях эксперимента (продолжительность 4 нед) содержание α-токоферола в печени животных, получавших И-3-К или Р, достоверно не изменялось при повышении содержания жира в рационе с минимального (1%) до повышенного (31%). Возможно, продолжительность этих серий эксперимента была недостаточной для накопления в печени токоферолов. Полученные данные противоречат результатам других исследований [14, 16], в которых было показано, что у крыс, находившихся в течение 4 нед на рационах с физиологическим (5-10%) и повышенным (20%) количеством жира и получавших с кормом в течение всего эксперимента другие флавоноиды (кверцетин, катехин, эпикатехин и порошок косточек винограда), содержание витаминов А и Е в крови и печени, достоверно повышалось. Возможно, эта противоречивость может быть связана как с составом жирового компонента применяемых рационов, так и с использованием различных БАС.
Оценивая в целом полученные результаты, можно отметить, что влияние жирового компонента в рационе на обеспеченность организма крыс витаминами А и Е согласуется с общепринятыми представлениями о роли липидов в усвоении жирорастворимых витаминов. Снижение уровня жира в рационе до 1% сопровождалось выраженным уменьшением содержания витамина А (пальмитата ретинола) в печени крыс при неизменной концентрации ретинола в плазме крови. При увеличении содержания жира до 31%, наоборот, наблюдалось повышение уровня витамина А в печени и плазме крови. Содержание витамина Е в печени крыс увеличивалось с повышением уровня жира и витамина Е рационе, тогда как концентрация α-токоферола в плазме крови не изменялась.
Включение в рацион крыс И-3-К на фоне пониженного и оптимального уровня липидов в корме практически не отражалось на концентрации ретинола в плазме крови и печени. При повышенном поступлении жира с рационом в течение 4 или 6 нед добавление И-3-К сопровождалось ухудшением обеспеченности крыс витамином А. На фоне избыточного содержания (31%) в рационе жира дополнительное потребление Р приводило к снижению содержания пальмитата ретинола в печени крыс по сравнению с таковым у крыс, получавших рацион с содержанием жира в пределах физиологической нормы
Обсуждая возможные причины обнаруженного существенного снижения содержания витамина А в печени крыс, получавших И-3-К и Р на фоне высокожирового рациона, следует отметить возможность как усиления метаболизма и выведения витамина, так и усиление его транспорта в другие органы и ткани. Установлено, что основными ферментами, осуществляющими окончательное окисление метаболитов витамина А, являются цитохромы Р450 26А1 и 26В1 [23, 25], а И-3-К и Р, как известно, представляют собой природные индукторы многих изоформ цитохрома Р450. Кроме этого, используемый в работе высокожировой рацион также приводил к росту активности отдельных изоформ цитохрома Р450 [4]. Для выяснения механизмов наблюдаемого эффекта необходимы дополнительные исследования.
Таблица 2. Содержание витамина Е в корме и плазме крови крыс, получавших рационы с различным уровнем жира и с включением биологически активных соединений
Литература
1. Бекетова Н.А., Коденцова В.М., Вржесинская О.А. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 6. - С. 35-42.
2. Блохина Л.В., Кондакова Н.М., Погожева А.В., Батурин А.К. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 5. - С. 35-40.
3. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 4. - С. 56-61.
4. Кравченко Л.В., Аксенов И.В., Трусов Н.В. и др. // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 1. - С. 24-29.
5. Кравченко Л.В., Гладких О.Л., Авреньева Л.И., Тутельян В.А. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. - 2008. - № 4. - С. 70-75.
6. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. - М.: Брандес-Медицина, 1998. - 340 с.
7. Сазонова О.В., Батурин А.К. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 3. - С. 46-50.
8. Трусов Н.В., Гусева Г.В., Аксенов И.В. и др. // Бюл. экспер. биол. - 2010. - Т. 149, № 2. - С. 174-179.
9. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Харитончик Л.А. и др. // Вопр. питания. - 1993. - Т. 62, № 1. - С. 43-47.
10. Bando N., Wakamatsu S., Terao J. // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2007. - Vol. 71, N 10. - P. 2569-2572.
11. Blomhoff R., Berg T., Norum K.R. // Br. J. Nutr. - 1988. - Vol. 60, N 2. - P. 233-239.
12. Botella-Carretero J.I., Balsa J.A., Vazquez C. et al. // Obes. Surg. - 2010. - Vol. 20, N 1. - Р. 69-76.
13. Cai Q.Y., Rahn R.O., Zhang R. // Cancer Lett. - 1997. - Vol. 119, N 1. - P. 99-107.
14. Choi S.K., Zhang X.H., Seo J.S. // Nutr. Res Pract. - 2012. - Vol. 6, N 1. - Р. 3-8.
15. Dawson H.D., Yamamoto Y., Zolfaghari R. et al. // J. Nutr. - 2000. - Vol. 130, N 5. - P. 1280-1286.
16. Frank J., Budek A., Lundh T. et al. // J. Lipid Res. - 2006. - Vol.47, N 12. - P. 2718-2725.
17. Jayarajan P., Reddy V., Mohanram M. // Indian J. Med. Res. - 1980. - Vol. 71. - P. 53-56.
18. Keli S.O., Hertog M.G., Feskens E.J., Kromhout D. // Arch. Intern. Med. - 1996. - Vol. 156, N 6. - P. 637-642.
19. Lodge J.K., Hall W.L., Jeanes Y.M., Proteggente A.R. // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2004. - Vol. 1031. - P. 60-73.
20. Mehmetoglu I., Yerlikaya F.H., Kurban S. // J. Clin. Biochem. Nutr. - 2011. - Vol. 49, N 3. - P. 159-163.
21. Middleton E. Jr., Kandaswami C., Theoharides T.C. // Pharmacol. Rev. - 2000. - Vol. 52, N 4. - Р. 673-751.
22. Nakamura Y., Yogosawa S., Izutani Y. et al. // Mol. Cancer. - 2009. - Vol. 8. - P. 100. (цит. по: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2784428/).
23. Ross A.C., Cifelli C.J., Zolfaghari R. et al. // Physiol. Genomics. - 2011. - Vol. 43, N 1. - Р. 57-67.
24. Sundaresan P.R., Marmillot P., Liu Q.-H. et al. // Int. J. Vitam. Nutr. Res. - 2005. - Vol. 75, N. 2. - P. 133-141.
25. Topletz A.R., Thatcher J.E., Zelter A. et al. // Biochem. Pharmacol. - 2012. - Vol. 83, N 1. - Р. 149-163.
26. Vobecky J.S., Vobecky J., Normand L. // Ann. Nutr. Metab. - 1995. - Vol. 39, N 2. - Р. 124-133.
27. Williamson G., Plumb G.W., Uda Y. et al. // Carcinogenesis. - 1996. - Vol. 17, N 11. - P. 2385-2387.