Rapid determination of food grain infection by fungi Fusarium and their species detection (part 1)

• Lyudmila P. Minaeva
• Korotkevich Yu.V.
• Svetlana A. Sheveleva

Abstract

Currently contamination of food grains with Fusarium spp. is determined by conventional mycological methods and can last up to 30–40 days. The method specificity is highly dependent on the subjective evaluation of the researchers. The alternative to traditional mycological methods is detection by PCR. The purpose of the study was to improve the contamination analysis method of food grains infected by Fusarium for analysis time reducing and species detection specificity increasing. Investigations were carried out on food grains samples harvested in 2009–2011 from 5 federal regions of Russia. On the first stage, 100 grains were sowing on potato-sucrose medium and then incubated at 24 °C for 7–10 days. At the second stage, the Fusarium species composition grown from food grains was estimated by two methods. The first method was mycological for monospore isolates. The second one was PCR analysis of DNA extracts from the combined sample of Fusarium mycelium which grew on a foodgrains sample. Species-specific primers of such mycotoxins producers as F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrchiodes, F. langsethiae, F. poae, F. avenaceum, F. tricinctum were used for PCR detection. The species composition of viable Fusarium spp. fungi revealed in foodgrains samples by mycological method completely concided with the results of PCR analysis. In result, the method that combines traditional mycological sowing for detection of viable species with PCR species detection of the mycelium in integrated sample has been developed. The method significantly reduces test duration (3–4 times) by excluding the sieving step in obtaining monospore fungi isolates for further species identification. The method also allows obtaining reliable data on the viable Fusarium speсies including producers of toxins in foodgrains. Thus, the idea of improving of the identification stage allowing reducing labor costs and increasing of the method specificity was realized.

Keywords:Fusarium spp., rapid detection of mycotoxigenic molds, real-time PCR, food grains, infection of food grains by Fusarium spp, species detection Fusarium

В настоящее время зараженность зерна Fusarium spp. Выявляется общепринятым методом микологического посева [2], осуществляемым в несколько этапов: первичный посев поверхностно стерилизованного зерна на агаризованную среду с последующим отбором характерных колоний по внешним признакам и под контролем микроскопии; рассевы для выделения моноспоровых изолятов; посев на идентификационные среды для оценки макро- и микроморфологических признаков и определение видовой принадлежности при сопоставлении с описанием в определителях. Общие затраты времени на весь комплекс исследований до получения окончательного результата составляют от 30 до 40 сут. При таком подходе специфичность метода в большой степени зависит от субъективной оценки исследователя. Однако известно, что виды, сходные фенотипически и морфологически, могут проявлять очень большие различия (F. langsethiae и F. poae, первый из них является сильнейшим продуцентом Т-2- и НТ-2-токсинов, а второй образует их лишь в следовых количествах и то не всегда) [11, 12].

Кроме того, по мере накопления данных филогенетических, морфологических и токсикологических исследований многие существовавшие ранее самостоятельно виды Fusarium реклассифицированы в одноименные комплексы видов, например F. graminearum, F. oxysporum, F. solani. Вид F. moniliforme, в соответствии с изменениями в систематике грибов, принятыми на VIII Международном совещании по грибам рода Fusarium в 1998 г., был переименован в F. verticillioides, а близкородственные виды отнесены к комплексу грибов Gibberella fujikuroi, включающему F. verticillioides, F. sacchari, F. fujikuroi, F. proliferatum, F. subglutinans, F. thapsinum, F. nygamai, F. circinatum, F. konzum. Общим признаком для этого комплекса грибов является присутствие в окраске мицелия различных оттенков лилового цвета, отсутствие розового и красного пигментов, а также отсутствие способности к биосинтезу трихотеценовых микотоксинов [4]. Идентификация видов комплекса G. fujikuroi сложна морфологически и для точного разграничения видовой принадлежности изолятов требуется проведение дополнительных исследований, в частности по спектру продуцируемых метаболитов.

Учитывая вышеизложенное, очевидно, что в испытательных лабораториях для видовой идентификации Fusarium spp. требуется наличие специально подготовленного (в области микологии) квалифицированного персонала.

Альтернативой традиционным микологическим методам являются методы идентификации с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с различными форматами детекции результатов (гель-электрофорез, флуоресценция в процессе амплификации - ПЦР в реальном времени или после ее завершения - FLASH ПЦР) [7]. Высокая чувствительность и специфичность методов на основе ПЦР-анализа позволяет выявлять ДНК токсигенных грибов не только в культуре, но и непосредственно в пищевых продуктах, а при сочетании с анализом загрязненности тех же партий зерна микотоксинами позволяет получить цельную картину присутствия конкретных продуцентов и их токсинов в продовольственных цепях. Быстрота анализа (в течение суток) и возможность одновременного тестирования большого количества образцов зерна и зерновых продуктов, а также выделенных продуцентов дает методам ПЦР неоспоримые преимущества перед классическим микологическим методом посева.

Целью настоящего исследования с учетом вышеизложенного было совершенствование метода анализа зараженности продовольственного зерна грибами рода Fusarium, их видовой идентификации с применением метода ПЦР для повышения специфичности и скорости определения.

Поставленную задачу решали двумя способами:

- ускорение этапа идентификации Fusarium spp. в зерне с помощью ПЦР, минуя стадии рассева и получения моноспоровых изолятов;

- прямое обнаружение в зерне ДНК наиболее вероятных продуцентов трихотеценовых микотоксинов (ТТМТ).

Материал и методы

Отработку данного подхода к изучению зараженности грибами рода Fusarium и определение видовой принадлежности Fusarium spp. проводили на образцах продовольственного зерна урожая 2009-2011 гг. из 5 федеральных округов РФ с известными уровнями загрязнения ТТМТ - Т-2- и НТ-2-токсинами [13].

Метод микологической идентификации Fusarium spp. Содержание Fusarium spp. во внутренней микофлоре зерна оценивали путем посева 100 поверхностно стерилизованных зерен исследуемого образца на агаризованную картофельносахарозную среду (КСА). После термостатирования при 24±1 °С через 7-14 сут проводили рассевы для получения моноспоровых изолятов, что особенно важно для корректной видовой идентификации, в соответствии с ранее описанной методикой [2]. В качестве идентификационных сред использовали: картофельно-сахарозную среду (КСА), синтетическую среду Ниренберг (СНА) и гвоздичнолистовой агар (ГЛА). Видовую принадлежность моноспоровых изолятов Fusarium spp. устанавливали по совокупности макро- и микроморфологических признаков при сопоставлении с описаниями в определителях грибов рода Fusarium широко используемых в мире в настоящее время [8-10].

Идентификацию Fusarium spp. на основе ПЦР в режиме реального времени проводили в 2 этапа:

1. Экстракция ДНК из мицелия грибов. Пробу объединенного мицелия, полученного на 7-14-е сутки после посева 100 зерен, составляли (с соблюдением правил асептики) путем отбора частей мицелия от всех выросших грибов, исключая мукоровые, темноокрашенные, аспергиллы и пенициллы, и последующего объединения. Для экстракции ДНК использовали набор "Проба ГС" производства ООО "ДНК-технология", рекомендованный для диагностики фитопатогенов методом ПЦР [6], в том числе для грибов рода Fusarium. Общую пробу мицелия растирали в фарфоровой ступке с 0,3 см3 лизирующего буфера из набора. Полученную суспензию переносили в пластиковые пробирки объемом 1,5 см3 и термостатировали при 50 °С в течение 20 мин, периодически перемешивая. Затем после центрифугирования при 16 000g в течение 5 мин супернатант переносили в пробирки, добавляли предварительно ресуспендированный сорбент, после чего проводили экстракцию в соответствии с методикой, прилагаемой к набору. В результате получали экстракт ДНК из пробы объединенного мицелия жизнеспособных видов Fusarium spp. для каждого образца зерна.

2. Проведение ПЦР в режиме реального времени. Использовали коммерческие наборы реагентов (производства ООО "Агродиагностика") для ПЦР-амплификации с видоспецифичными праймерами для определения: F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrchiodes, F. langsethiae, F. poae, F. avenaceum, F. tricinctum с фрагментами ДНК гена фактора элонгации трансляции 1α (tef-1α) [7].

Набор включал амплификационную смесь (ПЦРбуфер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, видоспецифичные праймеры для Fusarium spp., флуоресцентные ДНК-зонды, внутренний контрольный образец); минеральное масло; раствор Taq-полимеразы; положительный контрольный образец ДНК. Реакцию амплификации проводили в формате "Real-Time PCR" на детектирующем амплификаторе ABI PRISM 7500 (Applied Biosistems, США) по режиму, представленному в табл. 1.

Таблица 1. Режим амплификации

Результаты и обсуждение

На первом этапе работы было проведено исследование зараженности зерна видами Fusarium spp. традиционным методом микологического посева. Видовой состав грибов в исследуемых образцах зерна был количественно выражен в виде показателя - зараженность зерна определенным видом Fusarium, который рассчитывали как отношение числа зерен, зараженных определенным видом Fusarium, к числу анализируемых зерен в образце (100 шт.) в процентном выражении [2]. Полученные данные представлены в табл. 2.

Из данных табл. 2 следует, что зараженность исследованных образцов зерна грибами рода Fusarium варьировала в широком диапазоне - от 0 до 83%. Доминировал комплекс грибов G. fujikuroi (встречаемость от 0 до 39%). Далее в порядке убывания следовали F. tricinctum, F. sporotrichiodes, F. avenaceum, F. poae, F. culmorum, F. semitectum, F. graminearum, F. oxisporum, F. sambucinum. В ячмене выявлены 10 видов Fusarium, а также виды комплекса G. fujikuroi. В образцах овса чаще отмечалось присутствие F. tricinctum.

Среди выявленных видов грибов к потенциальным продуцентам фузариотоксинов относятся: F. sporotrichiodes (Т-2- и НТ-2-токсины, диацетоксисцирпенол), F. graminearum (дезоксиниваленол, ниваленол) и F. culmorum (дезоксиниваленол, ниваленол), F. poae (ниваленол, диацетоксисцирпенол), F. sambucinum (Т-2-токсин, диацетоксисцирпенол).

На втором этапе определение видового состава Fusarium в тех же образцах зерна проводили методом ПЦР с видоспецифичными праймерами.

Обнаружение Fusarium spp. в экстрактах ДНК из пробы объединенного мицелия проводили методом ПЦР в реальном времени с праймерами для 7 наиболее часто встречаемых видов на территории РФ [1-3, 5], продуцирующих ТТМТ. Полученные данные в сравнении с результатами микологического посева приведены в табл. 3 (образцы зерна № 6-18).

Из полученных данных следует, что видовой состав жизнеспособных Fusarium spp., обнаруженный в образцах зерна микологическим методом, полностью совпал с результатами ПЦР-анализа.

Таблица 2. Зараженность образцов зерна определенными видами Fusarium spp. (% зерен из 100 исследуемых)

Таблица 3. Видовой состав жизнеспособных Fusarium spp., обнаруженных в зерне методом полимеразной цепной реакции с видоспецифичными праймерами и методом микологического посева

Таблица 4. Сравнительная характеристика использованных методов обнаружения жизнеспособных грибов рода Fusarium в продовольственном зерне

Проведенная сравнительная характеристика двух используемых подходов представлена в табл. 4.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что длительный и трудоемкий метод микологической идентификации может быть заменен методом, сочетающим микологический посев с видовой идентификацией методом ПЦР в реальном времени из объединенной пробы мицелия. Применение такого подхода значительно - в 3-4 раза! - позволяет сократить время исследований, исключив стадии рассева при получении моноспоровых изолятов для последующей видовой идентификации. Предложенный новый подход позволяет получать достоверные данные о жизнеспособных видах Fusarium, в том числе продуцентах фузариотоксинов, в продовольственном зерне. Таким образом, реализована идея усовершенствования этапа идентификации, позволяющая сократить трудозатраты и увеличить специфичность.

Стоит отметить, что в настоящее время систематика на основе филогенетических исследований в микологии еще находится в стадии развития, ведется активный поиск новых генетических маркеров для таксономической характеристики видов, поэтому набор видоспецифичных праймеров, позволяющих определять широкий спектр видов Fusarium, пока ограничен. Но бурное развитие этой области исследований в последнее время позволит в будущем перевести метод ДНК-идентификации токсигенных грибов в разряд рутинных методов для контроля их в зерне и зернопродуктах.

Литература

1. Гаврилова О.П., Гагкаева Т.Ю. // Защита и карантин растений. - 2010. - № 2. - С. 23-25.

2. Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П., Левитин М.М. и др. Фузариоз зерновых культур // Приложение к журн. "Защита и карантин растений". - 2011. - № 5. - 52 с.

3. Гагкаева Т.Ю., Ганнибал Ф. Б., Гаврилова О.П. // Защита и карантин растений. - 2011. - № 5. - С. 37-41.

4. Гагкаева Т.Ю., Левитин М.М. // Микология и фитопатология. - 2005. - Т. 39, № 6. - С. 1-14.

5. Гагкаева Т.Ю., Левитин М.М., Санин С.С.и др. // Агро ХХI. - 2009. - № 4-6. - С. 4-6.

6. Методические указания. Диагностика токсигенных возбудителей фузариоза зерна методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией результатов с использованием наборов производства ООО "АгроДиагностика". - М., 2012. - 20 с.

7. Рязанцев Д.Ю., Абрамова С.Л., Евстратова С.В. и др. // Биоорганическая химия. - 2008. - Т. 34(6). - С. 799-807.

8. Gerlach W., Nirenberg H. The genus Fusarium - a Pictorial Atlas Mitt. - Berlin: Biol. Bundesanst, 1982. - 406 p.

9. Leslie J.F., Summerell B.A. The Fusarium laboratory manual. - Blackwell, 2006. - 388 p.

10. Nelson P.E., Toussoun T.A., Marasas W.F.O. Fusarium species: An Illustrated Manual for Identifications. - The Pennsylvania State University Press, 1983. - 193 p.

11. Thrane U., Adler A., Clasen P. E., Galvano F. et al. // Int. J. Food Microbiol. - 2004. - Vol. 95. - P. 257-266.

12. Torp M., Nirenberg H.I. // Int. J. Food Microbiol. - 2004. - Vol. 95. - P. 247-256.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.