С каждым годом в Республике Саха (Якутия),характеризующейся эктремальными природно-климатическими условиями, среди взрослого населения наблюдается неуклонный рост сердечно-сосудистой патологии, онкологических заболеваний и сахарного диабета типа 2, особенно у коренного населения. В структуре заболеваемости детей до 17 лет преобладают болезни органов пищеварения и дыхания. Развитие этих хронических неинфекционных заболеваний связано с нарушениями питания, снижением потребления биологически ценных пищевых продуктов, являющихся источниками незаменимых аминокислот, витаминов, микроэлементов, биологически активных соединений. Одним из пищевых продуктов, ценных легкоусвояемыми сахарами, а также содержащих пыльцу и маточное молочко [1-4], повышающих сопротивляемость организма к заболеваниям в экстремальных условиях Севера, является мед. Ввиду высокой калорийности мед может быть полезен для восстановления сил людям после тяжелых заболеваний, спортивных соревнований, тяжелых физических нагрузок, а также детям во время их интенсивного роста.
Несмотря на то что в состав меда входят легкоусвояемые сахара - фруктоза и глюкоза, мед иногда разрешают включать в рацион питания больных сахарным диабетом на ранней или средней его стадиях. Следует отметить, что с недавних пор на рынке появился продукт, представляющий собой сбор верхнего слоя меда, так называемая "пенка", которую рекомендуют больным сахарным диабетом, поскольку, как утверждают производители этого продукта, "пенка" содержит фруктозу в высоких концентрациях. Фруктоза, в отличие от глюкозы, галактозы и сахарозы, не обладает способностью высвобождать полипептидные гормоны кишечника, стимулирующие секрецию инсулина. Она быстро и почти полностью удаляется из крови воротной вены, где превращается в лактат или пируват и в гликоген. В результате после орального приема фруктозы концентрация глюкозы в крови повышается значительно медленнее и в гораздо меньшей степени, чем после приема эквивалентного количества глюкозы или углевода, превращающегося в глюкозу. Поэтому для больных сахарным диабетом необходимо соблюдать диету с контролем количества и качества углеводов в пищевом рационе. Избыточное потребление меда может нанести вред и здоровому человеку. Кроме того, известно, что при нагревании выше 60 °С и переплавки меда с целью прекращения брожения, для придания ему жидкой консистенции, а также при производстве фальсифицированного меда в нем образуется 5-оксиметилфурфурол, а сам мед при нагревании теряет абсолютно все свои полезные качества. Однако изучение поверхностного слоя меда и влияния избыточного температурного воздействия на мед еще не проводилось [5-7]. Кроме того, на данный момент отсутствует методика ГОСТ на определение нагретого меда.
Таким образом, целью работы явилось исследование углеводного спектра кристаллизованного меда, его поверхностного слоя и определение критериев термического воздействия на мед.
Материал и методы
В качестве объектов исследования были выбраны образцы весового закристаллизованного меда с частных пасек, отличающиеся своим геоботаническим происхождением и годом сбора:
- № 1 Мед "Разнотравье", урожай 2008 г. (Башкирия);
- № 2 Мед "Липовый", урожай 2010 г. (Приморский край);
- № 3 Мед "Гречишный", урожай 2009 г. (Амурский край);
- № 4 Мед "Разнотравье", урожай 2010 г. (Алтайский край);
- № 5 Поверхностный слой меда п. 4.
Эти же образцы были подвергнуты термическому воздействию на водяной бане до их перехода в вязкотекучее состояние с полным расплавлением кристаллов. Так как в водном растворе глюкоза и фруктоза проявляют кольчато-цепную таутомерию и через определенный промежуток времени существуют в виде 5 таутомеров: α- и -аномеров пиранозных и фуранозных циклических форм и оксоформе, поэтому для чистоты эксперимента анализировали свежеприготовленные водные пробы меда. Известно, что в смеси таутомеров доминируют пиранозные формы с преобладанием термодинамически более устойчивого аномера [8].
Так, равновесный состав индивидуальных водных растворов при нормальных условиях: глюкозы - 36% -D-глюкопиранозы и 64% -D-глюкопиранозы, а фруктозы - 28% -D-фруктопиранозы и 72% -D-фруктопиранозы. 13С-спектры были получены на ЯМР-спектрометре высокого разрешения Avance III ("Bruker") с рабочей частотой по углероду 100 МГц. Исследуемые образцы готовили путем растворения 200 мг меда в смеси тяжелой и дистиллированной воды (1:9) объемом 0,5 см3.
13С-спектры регистрировали в режиме широкополосной развязки от протонов с применением составной импульсной последовательности WALTZ-16. Параметры регистрации: количество сканов - 140, длина 30°-импульса - 21,6 мкс, время релаксации между сканами - 10 c. Фазовую коррекцию и коррекцию базовой линии осуществляли с помощью пакетов, входящих в программу TopSpin. Температура проведения экспериментов составляла 27 °С, длительность анализов - 30 мин. Спектры записывали без вращения образца. Во всех случаях были получены спектры высокого качества с шириной линий на полувысоте меньше 0,5 Гц. Все спектры калибровались относительно TSP. Отнесение химических сдвигов производили при помощи электронной базы [9, 10], по опубликованным данным [5-7], а также по спектрам индивидуальных веществ, снятых отдельно: глюкозы, фруктозы и сахарозы. Для каждой линии была рассчитана интегральная интенсивность, нормированная на суммарную интенсивность линий спектра. Далее путем суммирования интенсивностей линий по всем атомам углерода, входящим в молекулу аномера, и отнесением его к общей интенсивности, было рассчитано содержание сахаров (табл. 1). Инструментальная ошибка интегрирования составляет 3% [11].
Таблица 1. Содержание и соотношение аномеров глюкозы и фруктозы в образцах меда до и после их температурной обработки
Результаты и обсуждение
Полученные углеродные спектры всех водных проб меда имели идентичный характер и отличались только интенсивностями отдельных линий. На рисунке представлена область 52-108 м.д. спектров образца меда № 2 до и после термической обработки. Видно, что интенсивность пиков α-глюкозы в меде до термической обработки выше, чем β-аномера, а после термического воздействия распределение аномеров глюкозы обратное.
Для определения достоверной значимости полученных результатов были рассчитаны изменения в содержании аномеров основных моносахаридов в образцах меда до и после его нагревания (табл. 2).
Из данных табл. 2 видно, что полученные значения по изменению содержания α- и β-форм глюкозы превышают инструментальную ошибку, что позволяет рассматривать отличия полученных экспериментальных данных на уровне достоверной значимости, тогда как значения концентраций аномеров фруктозы находятся в пределах ошибки.
Во всех пробах сахароза присутствовала в следовых количествах, что свидетельствует о зрелости исследуемых проб меда. Во всех образцах глюкоза и фруктоза содержались в приблизительно равных пропорциях (см. табл. 1). В образцах до нагревания преобладали α-глюкоза и β-фруктоза, причем температурное воздействие на распределение аномеров фруктозы не влияло. Вероятно, это можно объяснить тем, что изначально в натуральном меде аномеры фруктозы находятся в концентрациях, близких к равновесным. В противоположность этому глюкоза находится в состоянии, далеком от равновесного, и среди таутомеров доминирует неустойчивый изомер - α-D-глюкопираноза, вследствие этого отношение α-/-глюкоза >1.
При нагреве проб произошла аномеризация -глюкозы с образованием более термодинамически выгодного диастереомера - -D-глюкопиранозы. Это подтверждается приближением концентраций аномеров глюкозы к равновесным, и отношение -/-глюкоза становится <1.
Таким образом, температурное воздействие на мед приводит к перераспределению аномеров глюкозы в сторону образования более термодинамически выгодного -аномера. Следовательно, в качестве показателя термической преобразованности меда может служить соотношение аномеров глюкозы как наиболее чувствительных к температурному воздействию.
Исследование углеводного состава поверхностного слоя показало, что по основным сахарам "пенка" отличается от самого меда большим содержанием глюкозы (см. табл. 1) и меньшим фруктозы, поэтому ее следует полностью исключить из рациона больных при тяжелой форме диабета. При компенсации углеводного обмена у больных сахарным диабетом, а также при регулярном контроле уровня сахара в крови употребление небольшого количества меда, в том числе его поверхностного слоя, вполне допустимо. Но, как было показано, мед и его поверхностный слой наряду с фруктозой содержат и глюкозу при соотношении этих углеводов примерно 1:1, поэтому рекомендации предпочтительного использования продуктов пчеловодства в диетах больных сахарным диабетом не могут быть общепринятыми.
Таким образом, по результатам проведенного ЯМР-исследования продуктов пчеловодства установлено, что нагретый мед можно идентифицировать по распределению аномеров глюкозы. Показано, что в меде диастереомеры фруктозы содержатся в концентрациях, близких к равновесным, поэтому при нагревании их распределение не изменяется. Обнаружено, что по сравнению с самим медом его поверхностный слой ("пенка") обогащен глюкозой и обеднен фруктозой, поэтому этот продукт следует полностью исключить из рациона питания при декомпенсации углеводного обмена у больных, страдающих тяжелой формой сахарного диабета.
Таблица 2. Разница в концентрации аномеров глюкозы и фруктозы в образцах меда до и после его нагрева, %
Спектры ЯМР 13С образца меда № 2 до (a) и после (б) его термической обработки
Литература
1. Лавренова Г.В. Медовая аптека. - М.: АСТ; СПб.: АстрельСПБ, 2005. - 160 с.
2. Хорн Х., Люлльманн К. Все о меде: производство, получение, экологическая чистота и сбыт. - М.: АСТ; Астрель, 2007. - 320 с.
3. Младенов С. Мед и медолечение. - София: Земиздат, 1974. - 228 с.
4. Чепурной И.П. Заготовка и переработка меда. - М.: Агропромиздат, 1987. - 80 с.
5. Ангервакс А.Е., Апушкинский Е.Г. Применение ЯМР - спектроскопии 13С для анализа состава углеводов меда // Химия растительного сырья. - 1999. - № 4. - С. 17-23.
6. Consonni R., Cagliani L.R. Geographical Characterization of Polyfloral and Acacia Honeys by Nuclear Magnetic Resonance and Chemometrics // J. Agric. Food Chem. - 2008. - Vol. 56. - Р. 6873-6880.
7. Mazzoni V., Bradesi P., Tomi F., Casanova J. Direct Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Mixtures Using 13C NMR Spectroscopy: Application to Honey // Magn. Reson. Chem. - 1997. - Vol. 35. - P. S81-S90.
8. Ким А.М. Органическая химия: Учеб. пособие, 2-е изд. испр. и доп. - Новосибирск: Сибир. универ. изд-во, 2001. - 814 с.
9. Wishart D.S., Knox C., Guo A.C. et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome // Nucleic Acids Res. - 2009. - Vol. 37 (Database issue):D603-610.
10. Wishart D.S., Tzur D., Knox C. et al. HMDB: the Human Metabolome Database // Nucleic Acids Res. - 2007. - Jan. - Vol. 35 (Database issue):D521-6.
11. Калабин Г.А., Каницкая Л.В., Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки. - М.: Химия, 2000. - 408 с.