The effect of carbon tetrachloride poisoning on the activity of digestive proteases in rats and correction of the violations with vegetable oils
AbstractThe results of the study of activity of digestive proteases (pepsin, trypsin, chymotrypsin) in homogenates of stomach, pancreas and duodenum in experimental animals have been presented. Rats were exposed to intoxication with carbon tetrachloride (subcutaneous administration of a 50% oil solution of ССl4 in thedose of 0,5 ml per 100 g body weight) for three days and then they were given analysed oils (black nut, walnut and flax oil) intragastrically by gavage at a dose of 0,2 ml per day within 23 days. Pepsin level in gastric mucosa homogenates and chymotrypsin activity in pancreatic homogenates were determined by method of N.P. Pyatnitskiy based on on the ability of enzymes to coagulate dairyacetate mixture, respectively, at 25 °C and 35 °C. Trypsin activity in homogenates of pancreatic was determined by method of Erlanger – Shaternikova colorimetrically. It has been established that intoxication with CCl4 decreased the synthesis of proteolytic enzymes of the stomach (by 51%) and pancreas (by 70–78%). Injections of analysed vegetable oils to animals contributed to the normalization of proteolytic enzymes synthesis. The conclusion that there are prospects of using the analysed vegetable oils containing large quantity of polyunsaturated fatty acids (ω-3 and ω-6) for the correction of detected biochemical abnormalities has been done.
Keywords:intoxication with carbon tetrachloride, rats, digestive proteases, vegetable oils
Вопр. питания. - 2013. - № 5. - С. 36-40.
В настоящее время заболевания, связанные с токсическими поражениями печени, занимают ведущее место среди патологий, вызывающих необратимые нарушения в функционировании всех систем организма. Это связано с тем, что печень является не только органом, в котором протекают центральные звенья обмена белков, липидов и углеводов, но и барьером на пути всех чужеродных веществ, попадающих в организм человека [1, 4, 6].
Печень способна инактивировать ряд сильнодействующих чужеродных токсических веществ.
Четыреххлористый углерод является одним из наиболее хорошо изученных гепатотропных ядов.
Отравление экспериментальных животных четыреххлористым углеродом по биохимическим изменениям и морфологической характеристике близко к острым поражениям печени различной этиологии у человека [3, 7, 11, 21].
Гепатотоксический эффект ССl 4 обусловлен свободнорадикальным окислением микросомальных липидов, возникающим вследствие воздействия свободных радикалов, образуемых при метаболизме этого соединения в эндоплазматическом ретикулуме печени (ССl4 → ССl3+ + Сl− ) под влиянием микросомальных ферментных систем. Активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) ведет к распаду внутриклеточных мембран микросом, митохондрий и лизосом, высвобождению активных ферментов, денатурации белков с последующей гибелью клетки, в связи с чем воздействие CCl 4 на живой организм не ограничивается только повреждением печени [2, 9, 13, 15, 16, 22]. Гепатотоксичность является лишь основным проявлением действия тетрахлорметана, тогда как в условиях окислительного стресса образующиеся свободные радикалы способны оказывать повреждающий эффект и на другие органы пищеварительной системы, что особенно заметно при пероральном поступлении CCl 4 в организм человека или животного. Повреждению желудка, кишечника и поджелудочной железы способствуют также нарушения взаимодействия между различными отделами пищеварительной системы, возникающие вторично на фоне формирования острой печеночной недостаточности [12].
В связи с этим изучение биохимических механизмов регуляции функциональной активности пищеварительных желез в условиях воздействия токсических агентов, а также разработка мер, направленных на устранение обнаруживаемых нарушений, в настоящее время остаются важными направлениями современной экспериментальной и клинической гепатологии.
Цели настоящего исследования - изучить изменение активности протеиназ желудочно-кишечного тракта крыс, подвергнутых воздействию четыреххлористого углерода, и определить возможность коррекции обнаруженных нарушений с помощью растительных масел.
Материал и методы
В экспериментах использовано 150 белых беспородных крыс-самцов с массой тела 150-200 г.
В каждой опытной и контрольной группе животные были одного возраста и веса. Они содержались в стандартных условиях, с соблюдением всех правил и международных рекомендаций [10].
На основании результатов модельных экспериментов (оценка метаболической доступности, антиоксидантной и антирадикальной активности) для проведения исследований in vivo по влиянию на метаболические процессы и функцию печени крыс были выбраны 3 растительных масла: льняное, черного и грецкого орехов. В связи с этим опытные животные были распределены на следующие группы. 1-я группа (25 крыс) - интактные животные, биохимические параметры у которых исследовали в 2 этапа: первая часть (12 крыс) на 7-е сутки после начала эксперимента вместе с животными 2-й группы, вторая часть (13 крыс) на 30-е сутки после начала эксперимента вместе с животными 3-й группы. 2-я группа (25 крыс) - животные с моделью токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода, биохимические параметры у которых исследовали на 7-е сутки после начала эксперимента.
3-я группа (25 крыс) - животные с моделью токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода, биохимические параметры у которых исследовали на 30-е сутки после начала эксперимента. 4-я группа (75 крыс) - животные с предварительно созданным экспериментальным токсическим гепатитом, которым по гастральному зонду вводили изучаемые масла: масло черного ореха - подгруппа IV А (n=25), масло грецкого ореха - подгруппа IV Б (n=25), льняное масло - подгруппа IV В (n=25). Растительные масла вводили с 7-е по 29-е сутки включительно после начала эксперимента в дозе 0,2 мл/сут.
Для создания модели острого токсического поражения печени крысам подкожно вводили 50% масляный раствор CCl 4 из расчета 0,5 мл на 100 г массы тела животного 1 раз в сутки в течение 3 сут [11, 21, 22]. Забор внутренних органов (желудка, кишечника, поджелудочной железы) для исследования у животных опытных и контрольной групп проводили на 7-е и на 30-е сутки эксперимента после декапитации под нембуталовым наркозом (35 мг/кг). Забой крыс проводили после их 14-часового голодания, в утренние часы, согласно принятым инструкциям и законодательным актам [10]. Органы животных промывали холодным физиологическим раствором. Участки слизистой желудка отделяли от серозной оболочки и тщательно измельчали. Отдельно измельчали двенадцатиперстную кишку и поджелудочную железу. Измельченные органы взвешивали, готовили из них 10% гомогенаты на дистиллированной воде и активировали их. Для этого в гомогенаты желудка добавляли 0,1 н раствор НCl в расчете 0,2 мл НCl на 1 мл гомогената. К гомогенатам поджелудочной железы добавляли гомогенаты двенадцатиперстной кишки (в соотношении 1:10).
Все гомогенаты инкубировали в водяном термостате в течение 1 ч при температуре 37 °С. После этого их центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об./мин, отделяли надосадочную жидкость и определяли в ней активность ферментов.
Все исследования выполняли в день забора внутренних органов.
Для определения активности пепсина в гомогенатах слизистой оболочки желудка использовали экспресс-метод [20], основанный на способности пепсина створаживать забуференное молоко (молочно-ацетатную смесь) при рН 5,0 и температуре 25 о С. Время появления хлопьев казеина в пробирке находится в обратной зависимости от активности фермента. Данный метод позволяет определять количество пепсина не только в условных единицах, но, пользуясь эталонным раствором кристаллического пепсина, и в мг. Содержание фермента выражали в мг/г влажной ткани слизистой оболочки желудка [19, 20]. Активность трипсина в гомогенатах поджелудочной железы определяли методом Эрлангера-Шатерникова, основанным на способности трипсина расщеплять синтетический субстрат - бензоиларгинин-п-нитроанилид (БАПНА) с образованием окрашенного п-нитроанилида, количество которого, определяемого колориметрически (λ=410 нм), пропорционально активности фермента [17]. Содержание трипсина выражали в мг на 1 г влажной ткани поджелудочной железы. Активность химотрипсина в гомогенатах поджелудочной железы определяли по методу Н.П. Пятницкого [18], который имеет сходство с методом определения пепсина в желудочном соке и основан на способности фермента свертывать молочно-ацетатную смесь при температуре 35 °С. Активность химотрипсина выражали в условных единицах на 1 г влажной ткани поджелудочной железы [18].
Полученные экспериментальные данные были обработаны методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.
Достоверным считали различие при р<0,05 [8].
Результаты и обсуждение
Как показали результаты исследования (см. таблицу), под действием CCl 4 в организме крыс наблюдалось снижение образования протеолитических ферментов желудка и поджелудочной железы.
На 7-е сутки от начала эксперимента содержание пепсина понизилось на 51,0% (р<0,001), трипсина - на 77,9% (р<0,001), активность химотрипсина уменьшилась на 69,9% (р<0,001) по сравнению с данными, полученными в контрольной группе.
На 30-е сутки от начала эксперимента наблюдалось увеличение содержания и активности протеиназ по сравнению с данными, полученными во 2-й опытной группе. Так, содержание пепсина в 3-й группе было выше соответствующего параметра во 2-й группе на 62,6% (р<0,001), трипсина - на 54,2% (р<0,001), активность химотрипсина - на 114,6% (р<0,001). Однако количество и активность всех изучаемых протеаз в 3-й экспериментальной группе были ниже контрольных значений.
Введение в организм животных растительных масел (4-я группа) способствовало увеличению содержания протеолитических ферментов по сравнению с данными, полученными в 3-й группе (см. таблицу). В группах животных, в рацион питания которых были введены масла льна, черного и грецкого орехов, наблюдалась тенденция к увеличению содержания протеолитических ферментов: количество пепсина приблизилось к уровню этого показателя у интактных крыс, составив 90-94%, трипсина - 82-86%, а активность химотрипсина - 93-95%.
Активность и содержание протеолитических ферментов слизистой оболочки желудка и ткани поджелудочной железы крыс при острой интоксикации четыреххлористым углеродом и находящихся на лечении исследуемыми гепатопротекторами (М±m)
)
Таким образом, у крыс с моделью острого токсического поражения печени, вызванного воздействием четыреххлористого углерода, наблюдается снижение образования пищеварительных протеаз.
Наиболее вероятной причиной данного явления, по нашему мнению, является свободнорадикальное повреждение указанных органов.
Применение исследованных липофильных продуктов для лечения животных с моделью острого токсического поражения печени характеризовалось тенденцией к восстановлению выработки пищеварительных протеиназ, что, по-видимому, связано с наличием в составе данной группы пищевых продуктов полиненасыщенных жирных кислот. Эти кислоты принимают участие в синтезе структурных компонентов клеточных мембран, отвечающих за нормальное функционирование последних и их устойчивость к повреждающим воздействиям токсических веществ. [5, 14]. Это также создает предпосылки для использования данных растительных масел в комплексном лечении патологических состояний, возникающих после попадания в организм различных токсических агентов.
Литература
1. Алексеева А.С., Белобородова Э.И., Рачковский М.И. и др. // Бюл. экспер. биол. - 2008.- Т. 146, № 11. - С. 512-514.
2. Белоногова В.Д., Корепанова Н.С., Олешко Г.И. и др. // Вопр. биол. мед. и фармацевт. химии. - 2003. - № 4. - С. 16-20.
3. Бойчук С.В., Шаймарданов Р.Ш., Миннебаев М.М. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. - Т. 17, № 6. - С. 32-36.
4. Бунятян Н.Д., Власов А.П., Литвиненко А.В. и др. // Бюл. экспер. биол. - 2004. - № 7. - С. 94.
5. Викторова Е.В., Кулакова С.Н., Гаппаров М.М. // Вопр. питания. - 2005. - Т. 74, № 2. - С. 36-38.
6. Гарбузенко Д.В. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т. 18, № 6. - С. 14-21.
7. Гейвандова Н.И., Ягода А.В., Гудзовская Д.А. и др. // Там же. - 2008. - Т. 18, № 6. - С. 38-42.
8. Герасимов А.Н. Медицинская статистика: Учеб. пособие. - М.: Мед. информ. Агентство, 2007. - 480 с.
9. Гойкова Л.А., Зорян Е.В., Анисимова Е.Н. и др. // Вопр. биол. мед. и фармацевт. химии. - 2004. - № 3. - С. 3-5.
10. Европейская Конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.) ETS N 123.
11. Забродский П.Ф., Древко Б.И., Мандыч В.Г. и др. // Экспер. и клин. фармакол. - 2008. - Т. 71, № 6. - С. 42-44.
12. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Патохимия (эндокринно-метаболические нарушения). - СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2007. - 768 с.
13. Ивашкин В.Т., Буеверов А.О. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т. 18, № 1. - С. 4-8.
14. Королева Л.Р. // Рос. мед. журн. - 2005. - № 2. - С. 35-37.
15. Кушнерова Н.Ф., Спрыгин В.Г., Фоменко С.Е. и др. // Гиг. и сан. - 2005. - № 5. - С. 17-21.
16. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
17. Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике. - М., 1969. - С. 206-210.
18. Пятницкий Н.П., Проскуряков М.Т. Материалы 17-й науч. конф. физиологов юга РСФСР. - Ставрополь, 1969. - Т. 2. - С. 80-82.
19. Пятницкий Н.П. // Клин. мед. - 1955. - № 4. - С. 74-75.
20. Пятницкий Н.П. Способ определения количества пепсина: А. с. № 211030, 1968.
21. Сапожникова Т.А., Зарудий Ф.С., Басченко Н.Ж. и др. // Бюл. экспер. биол. - 2008. - Т. 145, № 2. - С. 183-184.
22. Сапожникова Т.А., Зарудий Ф.С., Басченко Н.Ж. и др. // Экспер. и клин. фармакол. - 2007. - Т. 70, № 4. - С. 30-31.
All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)
© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.