Change of blood antioxidant capacity of experimental animals during nutritional correction under oxidative stress

• A.A. Basov
• Bykov I.M.

AbstractThe effect of nutritional correction (a diet high in foods with antioxidant content) on blood parameters in laboratory animals with metabolic disorders associated with oxidative stress has been studied. In experimental models of laboratory animals (male rabbits weighing 3,5–4,0 kg, n=40) with purulent septic diseases it has been demonstrated that the use of nutritive correction (replacement of 100 g of the cereal mixture through day on a mixture of cabbage 50 g, carrots 50 g, beet 25 g, apple 25 g, kiwi 10 g and garnet 10 g per 1 rabbit) is not inferior to its efficiency of glutathione use (2 g per day). The use of these antioxidants in laboratory animals significantly reduced the phenomenon of oxidative stress on the 5th day: blood antioxidant capacity significantly increased by 14,9 and 26,6%, and the area of the flash of luminol-dependent H2O2-induced chemiluminescence of blood plasma reduced by 44,2 and 48,6% in the experimental groups receiving respectively nutritive correction and glutathione. The low-molecula level of blood antioxidant capacity was restored and the balance of the activity of superoxide dismutase (decrease) and catalase (increase) was achieved on the 10th day of the experiment. These figures significantly (p<0,05) differed from than in the group of animals receiving no antioxidant correction. The latter studied parameters of prooxidant-antioxidant system reached values comparable with those in intact animals (n=10) only on the 30th day, confirming the advisability of appointing a complex antioxidant therapy.

Keywords:antioxidant system, energy potential, oxidative stress, nutrients

Одной из актуальных проблем современной медицины является изучение окислительного стресса (ОС), возникающего в организме при многих патологических и некоторых физиологических состояниях. В связи с этим поиск новых способов коррекции нарушений свободнорадикального окисления (СРО) является актуальным. Необходимость в пищевых веществах с антиоксидантными свойствами особо возрастает в связи с увеличением энергетических потребностей организма, которые наблюдаются при интенсивных физических нагрузках [22], что объясняется усилением генерации свободных радикалов, сопровождающей анаэробные и анаэробно-аэробные процессы при выполнении короткой и интенсивной работы, например в скоростно-силовых видах спорта. Психоэмоциональные и физические нагрузки, ведущие к увеличению потребности в витаминах в качестве коэнзимов в ферментных системах, участвующих в утилизации энергии при мышечной деятельности, могут приводить к истощению неспецифических защитных систем, прежде всего антиоксидантной, что в свою очередь является причиной активации процессов перекисного окисления биомолекул (белков, липидов, нуклеиновых кислот) [25].

Нельзя не отметить, что коррекцию процессов СРО необходимо проводить для профилактики и лечения ряда заболеваний, таких как сахарный диабет, бронхиальная астма, инфаркт миокарда, инсульт, ревматоидный артрит, катаракта, нейродегенеративные заболевания и некоторых других [10].

Кроме того, одна из существующих концепций рассматривает поддержание скорости реакций перекисного окисления на физиологическом уровне с помощью антиоксидантов как способ замедления процессов старения и увеличения продолжительности активной жизнедеятельности человека. Этим также объясняется больший интерес в научной литературе к профилактике и коррекции нарушенного гомеостаза в результате патофизиологических проявлений ОС, а разработка новых профилактических и лечебных мероприятий, позволяющих корригировать антиоксидантный статус организма, продолжает оставаться одной из основных задач современной медицины [1, 3, 11, 13, 15, 21, 23, 27, 30, 36]. Необходимо указать, что дополнительный прием витаминов и микроэлементов с целью коррекции их недостатка в рационе питания и потерь в процессе физических нагрузок является широко распространенной практикой среди спортсменов [11, 35]. Однако недостаток информации в ряде аспектов по эффективности и взаимодействию различных классов антиоксидантов не позволяет максимально использовать в спортивном питании комбинации нутриентов и лекарственных средств для коррекции дисбаланса эндогенной антиоксидантной системы.

В клинической практике использование лекарственных средств с антиоксидантным действием распространено достаточно широко, но нередко применяют их только в комплексной терапии уже при сформированном остром или хроническом патологическом процессе [17], когда на фоне сформировавшегося патобиохимического состояния затраты на лечение достигают максимальных показателей, а эффективность становиться невысокой, что связано с формированием различных инкурабельных осложнений.

Большой практический интерес в настоящее время представляет использование диетотерапии для коррекции прооксидантно-антиоксидантного статуса. Поскольку любые потребляемые человеком пищевые продукты влияют на состояние прооксидатно-антиоксидантного баланса в разной степени и с различной направленностью, это создает предпосылки для коррекции антиоксидантного потенциала без использования фармацевтических препаратов при достаточно высокой эффективности за счет длительного систематического воздействия факторов питания [2, 4, 9, 14, 29, 33, 34, 36]. Известно, что применение синтетических антиоксидантов, в том числе парафармацевтиков, ограничено из-за их возможного побочного действия, что проводит к необходимости поиска альтернативных соединений в пищевых продуктах, обладающих высокой антиоксидантной активностью и безвредных для человека.

Учитывая все вышесказанное, целями настоящего исследования были разработка и апробация экспериментального комплексного подхода в диагностике окислительного стресса, а также поиск путей для нутритивной коррекции дисбаланса прооксидантно-антиоксидантной системы организма.

Материал и методы

Изучение эффективности способа нутритивной коррекции антиоксидантного потенциала организма была апробирована на лабораторных животных (кроликах-самцах весом 3,5-4,0 кг, n=50), у которых моделировали ОС путем формирования гнойной раны (абсцесса). После развития у лабораторных животных клиники нагноения раны, которая соответствовала первому (острому) периоду моделирования ОС, снимали швы (на 5-е сутки), что соответствовало второму периоду ОС и в дальнейшем проводили местное лечение гнойной раны под мазевыми повязками до ее полного заживления вторичным натяжением (патент на изобретение № 2 455 703 [5]). Для создания модели абсцесса у животных до начала эксперимента срезали и выбривали шерсть на средней и нижней третях спины. Затем под местной анестезией раствором новокаина 0,5% наносили повреждение мягких тканей (область длинных мышц спины) в предполагаемой зоне формирования абсцесса. В день начала эксперимента проводили разрез скомпрометированной накануне области длиной 3-5 см и в мягкие ткани вводили марлевый шарик диаметром 10 мм, пропитанный 1 мл жидкости с патогенным штаммом S. aureus с концентрацией 10 3 -10 8 КОЕ/мл, в последующем на рану накладывали первичные швы. Через 120 ч с момента проведения имплантации инфицированного инородного тела переводили воспалительный процесс в хронический, формируя гнойную рану, путем снятия кожных швов и удаления инородного тела с последующей санацией полости абсцесса, что обеспечивало регулируемую по тяжести и длительности, двухфазную по характеру экспериментальную модель ОС, позволяющую достоверно оценивать эффективность мероприятий, корригирующих состояние прооксидантно-антиоксидантной системы и направленных на выздоровление животных.

Коррекцию ОС осуществляли с помощью нутритивной терапии, для этого в пищевой рацион вводили продукты, содержащие антиоксиданты (овощи и фрукты). В группе сравнения использовали глутатион, который входит в состав многих биологически активных добавок к пище. Все животные (кролики) были разделены на 4 группы. Животные 1-й группы (контрольная группа, n=12) получали после моделирования ОС обычный рацион (зерновая смесь 100 г/сут) в течение 30 дней. Кролики 2-й группы (опытная группа, n=14) получали после моделирования ОС через день (по перемежающейся схеме) обычный рацион (зерновая смесь 100 г/сут), на другой день диету с антиоксидантами (капуста 50 г, морковь 50 г, свекла 25 г, яблоко 25 г, киви 10 г, гранат 10 г в расчете на 1 кролика в сут). 3-я группа животных (группа сравнения, n=14) получала после моделирования ОС через день (по перемежающейся схеме) обычный рацион (зерновая смесь 100 г/сут), на другой день смесь обычного рациона с глутатионом (2 г глутатиона смешивали с первой порцией зерновой смеси).

4-я группу (интактная группа, n=10) составили животные, которым не проводили моделирование ОС, и они получали обычный рацион (зерновая смесь 100 г/сут). Забор биологического материала (крови) у животных осуществляли на 5-е, 10-е и 30-е сутки эксперимента.

С целью оценки интенсивности СРО был использован метод люминолзависимой H 2 O 2 -индуцированной хемилюминесценции плазмы крови, которую измеряли на хемилюминотестере ЛТ-01 (НПО "Люмин", РФ) по методике [7, 18, 19], полученные результаты выражали в виде максимума вспышки хемилюминесценции (МВХЛ) и площади вспышки хемилюминесценции (ПВХЛ) в условных единицах (усл. ед.). Определение антиокислительной активности (АОА) плазмы крови проводили амперометрическим способом на анализаторе антиоксидантной активности "Яуза-01-ААА" (ОАО НПО "Химавтоматика", РФ) по методу [26] в собственной модификации [8].

Определение активности каталазы (КАТ) проводили в гемолизате эритроцитов (1:200) по методу [28] в собственной модификации [20]. Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) использовали методику [12] в собственной модификации [20]. Комплексную оценку состояния ферментного звена антиоксидантной системы проводили при помощи интегрального показателя функционирования ферментов антирадикальной защиты (ИПФФАРЗ), выражаемому в единицах соотношения каталаза/супероксиддисмутаза (КАТ/СОД) по разработанному методу (патент на изобретение № 2 436 101 [6]).

Для определения базального количества продуктов окислительной модификации в эритроцитах использовали методику [16], в плазме крови - методику [24], полученные результаты выражали в виде тиобарбитурового числа (ТБЧ) в единицах оптической плотности (е.о.п.). Количество тиоловых групп в гемолизате крови определяли с помощью реактива Эллмана по методике [16, 31].

Расчет интегрального показателя состояния прооксидантно-антиоксидантной системы для диагностики окислительного стресса производили по разработанному методу (патент на изобретение № 2 236 008 [17]) и выражали в виде коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов (КОМБэр) в окислительных единицах активности (ОЕА).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли методами вариационной статистики при помощи ЭВМ с использование свободного программного обеспечения - системы статистического анализа R (R Development Core Team, 2008, достоверным считали различие при р<0,05).

Результаты и обсуждение

В ходе проведенных исследований на 5-е сутки было установлено, что во всех экспериментальных группах (1-й, 2-й и 3-й) наблюдалось развитие дисбаланса в работе прооксидантно-антиоксидантной системы. Наиболее выраженные изменения выявлены в 1-й группе, что характеризовалось достоверными изменениями всех показателей прооксидантно-антиоксидантной системы в сравнении с параметрами в 4-й группе (табл. 1). АОА плазмы крови снизилась на 51,2%, МВХЛ и ПВХЛ повысились соответственно в 2,9 и 2,6 раза, количество SH-групп уменьшилось на 51,8%. В работе ферментного звена АОС развился дисбаланс со снижением каталазной емкости и адаптивным повышением активности СОД, приводящим к нарушению утилизации реактивных молекул перекисной природы и повышению риска образования вторичных свободных радикалов в организме. Во 2-й и в 3-й группах аналогичные изменения были менее выражены, хотя и достоверно отличались от показателей интактных животных (4-я группа). При этом необходимо отметить достоверно более выраженный эффект воздействия низкомолекулярного антиоксиданта глутатиона на показатели антиоксидантной емкости крови.

По-видимому, это происходит за счет частичного восстановления окислено модифицированных дисульфидных групп и пополнения пула свободных тиолов, что, в свою очередь, приводит к достоверным изменениям показателей в сравнении с 1-й группой (табл. 1): повышению АОА на 26,6%, снижению ПВХЛ на 48,6%, интегрального показателя КОМБэр в 2,73 раза и свидетельствует об активной роли глутатиона в регенерации низкомолекулярных антиоксидантных факторов крови [32]. Также следует отметить, что во 2-й группе, получавшей коррекцию с помощью пищевых продуктов с антиоксидантной направленностью, восстановление работы ферментного звена АОС происходило более сбалансировано, что отражает более высокий показатель ИППФАРЗ - на 37,5% выше, чем в 3-й группе. Подобные различия можно объяснить наличием в овощах и фруктах большого разнообразия кофакторов, необходимых для адекватного функционирования в крови ферментов первой и второй линии антирадикальной защиты, повышающих активность КАТ и СОД в условиях ОС. Кроме того, ряд нутриентов с антиоксидантной направленностью способны сами проявлять дисмутазную и пероксидазную активность [4], что также способствует ускорению утилизации первичных свободных радикалов и реактивных молекул в организме, снижая прооксидантную нагрузку на АОС организма.

Проведенное исследование показало, что антиоксидантная диета по эффективности коррекции нарушений прооксидантно-антиоксидантного баланса и влиянию на большинство показателей статистически значимо не отличалась от способа с применением глутатиона (табл. 1).

На 10-е сутки эксперимента в обеих группах, получающих антиоксидантную коррекцию, отмечалось практически полное возвращение к физиологическим значениям показателей АОС, что характеризуется отсутствием статистически значимых отличий неферментативного и ферментативного звеньев АОС лабораторных животных во 2-й и в 3-й группах от показателей интактных животных (табл. 2). Из особенностей применения диеты с высоким антиоксидантным потенциалом стоит отметить несколько замедленное развитие протективного эффекта в сравнении с результатами у животных из группы, получающей глутатион. Это подтверждается отсутствием статически достоверных отличий полученных результатов во 2-й группе для показателей АОС (АОА плазмы, количества SH-групп) на 5-е сутки эксперимента в сравнении с данными в 1-й группе (p>0,05), тогда как в 3-й группе аналогичные показатели отличались статические значимо (p<0,05). Вместе с тем восстановление пролонгированных защитных факторов при использовании одной антиоксидантной диеты во 2-й группе было неполным и на 10-е сутки эксперимента, что подтверждается сохраняющимся повышением ПВХЛ на 25,9% (p<0,05) по сравнению с показателями группы 4.

Восстановление антиоксидантного потенциала крови с одновременным возвращением интенсивности СРО до физиологических значений в 3-й группе связано как с высокой способность глутатиона непосредственно нивелировать избыточное образование свободных радикалов, так и с его участием в регенерации многих низкомолекулярных антиоксидантов, что повышает адаптационные возможности организма в условиях ОС.

В то же время следует указать, что в крови животных 1-й группы, не получающих никакой пищевой коррекции с антиоксидантной направленностью, выявлено выраженное наличие дисбаланса в работе прооксидантно-антиоксидантной системы, характеризующееся достоверным отличием ее показателей от данных, полученных в группе интактных животных (табл. 2).

В 1-й группе установлены достоверные изменения интегральных показателей: повышение КОМБэр (до 17,29 ОЕА), отражающее дефицит факторов, ингибирующих реакции СРО в крови, и снижение ИППФАРЗ на 38,3%, указывающее на разбалансированное функционирование ферментов первой и второй линий антиоксидантной защиты с преобладанием дисмутазной активности, что свидетельствует о перенапряженной работе неспецифических защитных систем и может приводить к избыточному накоплению перекисей в условиях снижения активности КАТ.

Проведенные исследования показателей АОС выявили отсутствие статистически значимых различий между показателями 1-й и 4-й групп (p>0,05) только на 30-е сутки эксперимента, что показывает, насколько длительный период требуется для восстановления баланса прооксидантно-антиоксидантной системы в крови у лабораторных животных при отсутствии дополнительной антиоксидантной коррекции с помощью пищевых нутриентов (2-й группа) и глутатиона (3-й группа).

Полученные результаты позволяют говорить о возможности нутриционной коррекции нарушений прооксидантно-антиоксидантной системы в клинических условиях, однако такие мероприятия возможны только при строгом соблюдении пациентами всех предписаний в рамках диетотерапии.

Выводы

Таким образом, в проведенном исследовании продемонстрирован достаточно высокий уровень эффективности коррекции дисбаланса прооксидантно-антиоксидантной системы с помощью обогащения рациона пищевыми продуктами, содержащими антиоксиданты. Стоит отметить также тот факт, что предложенная методика восстановления потенциала эндогенной АОС приобретает особый интерес в рамках превентивных мероприятий, направленных на профилактику ОС и поддержание активной жизнедеятельности современного человека, в том числе при повышенных физических нагрузках.

Следует отметить, что существуют пищевые продукты как с преобладанием антиоксидантных факторов (овощи, фрукты, молочные продукты), так и с преобладанием прооксидантных компонентов (продукты категории быстрого питания) [4].

При разработке превентивных мероприятий, направленных на поддержание процессов СРО на физиологическом уровне, можно рассматривать использование пищевых продуктов с высокой АОА как потенциальных средств коррекции прооксидантно-антиоксидантного баланса организма человека. Использование антиоксидантной коррекции в модельной системе с гнойно-септическими заболеваниями на лабораторных животных позволяет значительно уменьшить проявления ОС уже на 5-е сутки: статистически значимо повысить антиокислительную емкость крови на 14,9 и 26,6%, а также снизить площадь вспышки хемилюминесценции соответственно на 44,2 и 48,5% в опытных группах, получающих нутриционную коррекцию и глутатион. Используя данный способ, удается практически полностью устранить ОС уже на 10-е сутки, что существенно быстрее в сравнении с методами лечения без применения средств с антиоксидантной направленностью. При этом не отмечено статистически значимых отличий (p>0,05) эффективности диеты, содержащей продукты с высоким антиоксидантным потенциалом, в сравнении с использованием традиционного низкомолекулярного антиоксиданта-парафармацевтика (глутатиона).

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта вуза (ГБОУ ВПО "Кубанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 2010-2011 гг., грант № 7).

Литература

1. Базарнова Ю.Г. // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 1. - С. 22-26.

2. Байляк М., Господарев Д., Семчишин Г. и др. // Биохимия. - 2008. - Т. 73, вып. 4. - С. 515-523.

3. Балаболкин М.И., Креминская В.М., Клебанова Е.М. // Пробл. эндокринол. - 2005. - Т. 51, № 3. - С. 22-33.

4. Басов А.А., Быков И.М. // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 3. - С. 77-80.

5. Басов А.А., Быков И.М., Федосов С.Р., Малышко В.В. Патент на изобретение № 2455703 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 (2006.01). - 10.07.2012. - Бюл. № 19. - 12 с.

6. Басов А.А., Павлюченко И.И., Быков И.М., Федосов С.Р., Губарева Е.А. Патент на изобретение № 2436101, Российская Федерация, МПК G01N33/573. - 10.12.2011. - Бюл. № 34. - 20 с.

7. Басов А.А., Павлюченко И.И., Плаксин А.М. и др. // Вестн. новых мед. технологий. - 2003. - Т. 10, № 4. - С. 67-68.

8. Басов А.А., Федосов С.Р., Канус И.С. и др. // Соврем. пробл. науки и образов. - 2006. - № 4, прил. 1. - С. 149.

9. Гаппаров М.М.Г., Суханов Б.П., Тутельян В.А. Питание в борьбе за выживание. - М.: Академкнига, 2003. - 448 с.

10. Евсеев В.Н., Кузнецов О.Р., Румянцева С.А. // Рос. мед. журн. - 2009. - Т. 17, № 5. - С. 332-334.

11. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Никитюк Д.Б. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 3. - С. 67-77.

12. Костюк А.В., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. // Вопр. мед. химии. - 1990. - № 2. - С. 88-91.

13. Кулинский В.И., Леонова З.А., Колесниченко Л.С. и др. // Биомед. химия. - 2007. - Т. 53, вып. 1. - С. 91-98.

14. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленикова Е.И. и др. // Биохимия. - 2005. - Т. 70, вып. 1. - С. 97-104.

15. Макеева А.В., Попова Т.Н., Матасова Л.В. // Биомед. химия. - 2007. - Т. 53, вып 2. - С. 181-189.

16. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - 293 с.

17. Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. Патент на изобретение № 2236008, Российская Федерация, МПК G01N33/48. - 10.09.2004. - Бюл. № 25.- 10 с.

18. Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. Патент на полезную модель № 54787 Российская Федерация, A61K 33/00. - 27.07.2006. - Б. 21. - 2 с.

19. Павлюченко И.И., Федосов С.Р., Басов А.А. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2006611562. - 16.03.2006. - 1 с.

20. Павлюченко И.И., Федосов С.Р., Басов А.А. и др. // Открытое образование. - 2006. - № 3. - С. 425-427.

21. Перевозкина М.Г., Кудрявцев А.А., Третьяков Н.Ю., Сторожок Н.М. // Биомед. химия. - 2007. - Т. 53, вып. 2. - С. 146-158.

22. Полиевский С.А. Основы индивидуального и коллективного питания спортсменов. - М.: Физкультура и спорт, 2005. - 384 c.

23. Тутельян В.А. // Вопр. питания. - 1996. - № 6. - С. 3-12.

24. Ушкалова В.Н., Иоанидис Н.В., Кадочникова Г.Д. и др. - Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1993. - 182 с.

25. Яковлев Н.Н. Факторы, определяющие потребность в витаминах при мышечной деятельности // Теория и практика физической культуры. - 1977. - № 5. - С. 22-27.

26. Яшин А.Я. // Рос. хим. журн. - 2008. - Т. LII, № 2. - С. 130-135.

27. Arora A., Byrem T.M., Nair M.G. et al. // Arch. Biochem. Biophys. - 2000. - Vol. 373. - P. 102-109.

28. Beers R., Sizer I. // J. Biol. Chem. - 1952. - Vol. 195. - P. 133.

29. Cos P., De Bruyne T., Hrmans N. et al. // Curr. Med. Chem. - 2003. - Vol. 10. - P. 1345-1359.

30. Lichenthaler R., Marx F. // J. Agric. Food Chem. - 2005. - Vol. 53. - P. 103-110.

31. Robyt J.F., Ackerman R.J., Chittenden C.G. // Arch. Biochem. - 1971. - Vol. 147. - P. 262-269.

32. Song J.J., Rhee J.G., Suntharalingan M. et al. // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277. - P. 46566-46575.

33. Verhoeyen M.E., Bovy A., Collins G. et al. // J. Exp. Bot. - 2002. - Vol. 11. - P. 2099-2106.

34. Vladimorov Yu. Abstrakt Book The 11th International Congress PHYTOPHARM. - Leiden, 2007. - P. 32.

35. Volpe S.L. // Clin. Sports Med. - 2007. - Vol. 26, N 1. - P. 119-130.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.