Effect of phytosterols and alkylglycerols in the diet on morphometric indicators of liver structure in rats

• Z.M. Gadzhieva
• Svetlana N. Kulakova

AbstractIn the experiment where rats were fed a diet with phytosterols and alkylglycerols for 1,5 months, changes were observed in morphometric parameters in the liver structure in rats. In animals, which were fed a diet with 20% replacement of the fat component (lard) on phytosterols (stanols derived from rapeseed and conifers), blood circulatory disorders of the liver were observed. There was dilatation of the lumens of the central veins and hepatic veins in the interlobular vascular bundles. On the periphery of the lobules, around the vascular bundles, abundant clusters of lymphocytes were revealed. In both groups of rats fed a diet containing various amounts of alkylglycerols obtained from Berrytenthis magister liver (7 and 50 mg per day) and lard as a fat component, in peripheral areas of hepatic lobules the reticuloendothelial cell count was increased as compared with the control group of animals fed a diet containing as fatty component a mixture of lard and sunflower oil (1:1). These cells contained polysaccharides in the cytoplasm and formed thin bands along the hepatic tubules. In addition, in all groups of rats receiving diets with lipid components (both stanols and alkylglycerols), the occurrence of reticuloendothelium proliferation foci in the middle and central zones of liver lobules were 1,8, 2,3 and 2,1 fold higher than in control group. As compared to control animals, the foci in the above groups contained 1,8, 1,7 and 1,6 fold more cells. Furthermore, the number of animals with reticuloendothelium proliferation foci in the groups receiving investigated lipid components was also increased by 2 fold, as compared to controls.

Keywords:liver, phytosterols, alkylglycerols, reticuloendothelial cells, hepatocytes

В настоящее время с целью предотвращения риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и ожирения, а также их лечения в питании человека в качестве источника жира обычно используют растительные масла, содержащие такие компоненты, как полиненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды, фитостерины [6, 8, 9, 10, 12]. Эти вещества широко используются в диетотерапии, а также в качестве биологически активных добавок к пище и пищевых продуктов функционального назначения. Как известно, эти биологически активные вещества входят в состав клеточных мембран [4] и играют большую роль в жировом обмене [2, 5, 9, 14].

Фитостерины в форме станолов и стеролов представляют собой вещества растительного происхождения, которые и по структуре, и по функциям близки холестерину - веществу животного происхождения. Растительные стерины присутствуют в ежедневном рационе человека в малых количествах, при добавлении в пищу они эффективно снижают абсорбцию всех стеролов, в том числе холестерина, из пищеварительного тракта и вследствие этого снижают уровень холестерина в сыворотке крови [20]. Было показано, что включение в рацион фитостеринов и станолов в дозе от 0,7 до 4 г/сут сопровождалось снижением повышенного уровня холестерина липопротеидов низкой плотности, наблюдаемого при сердечно-сосудистых заболеваниях [15, 16, 18].

Липиды морского происхождения также широко используются в медицинской практике и являются источниками ценных полиненасыщенных жирных кислот семейства ω-3, фосфолипидов, сквалена, каротиноидов, сапонинов, алкоксиглицеридов и других биологически активных компонентов, спектр которых постепенно пополняется за счет использования человеком новых видов источников морского сырья.

Алкоксиглицериды - это глицеролипиды с алкильной связью. Алкилглицериновые эфиры представляют собой простые эфиры длинноцепочечных жирных кислот С 16:0, С 18:0 и С 18:1 и глицерина в α-положении. Алкоксиглицериды обнаружены в печени рыб (налим, сом и др.), мясе, коровьем молоке. Обычно алкоксиглицериды встречаются в органах гемопоэза (кроветворения), таких как костный мозг, селезенка, печень. Наибольшее количество алкоксиглицеридов содержится в печени акул.

Данные по влиянию отдельных фракций морских липидов, таких как фосфолипиды, сквален, алкоксиглицериды, обладающих большей активностью, чем ПНЖК семейства ω-3, пока немногочисленны.

В литературе обсуждается иммуностимулирующее действие алкоксиглицеридов, их антиоксидантное действие, но практически отсутствуют сведения о возможных безопасных для человека уровнях потребления этих биологически активных компонентов [17, 19].

Несмотря на многообразие используемых в питании жировых компонентов, их воздействие на организм человека до сих пор изучено недостаточно. В частности, мало исследовано влияние этих компонентов рациона на структуру внутренних органов. В этой связи целью настоящего исследования стало изучение влияния биологически активных липидов растительного и животного происхождения - фитостеринов и алкоксиглицеридов - на структуру печени крыс.

Материал и методы

Эксперимент был проведен на 27 белых крысах - самцах линии Вистар, разделенных на 5 групп: контрольную (7 животных) и 4 опытных группы (по 5 животных в каждой группе). Все животные в течение 1,5 мес получали полноценный полусинтетический рацион. Жировая часть рациона крыс контрольной группы состояла из подсолнечного масла и лярда в соотношении 1:1, у животных 1-й опытной группы - из одного лярда; во 2-й опытной группе крысы получали на фоне лярда фитостерины, полученные из рапса и хвойных растений ("Бениколь", "Raisio Life Science", Финляндия), в количестве 20% от массы жирового компонента, которое соответствует адекватному суточному потреблению для человека. Крысы 3-й и 4-й опытных групп получали корм, в который, наряду с лярдом, были включены алкоксиглицериды в количестве соответственно 7 и 50 мг на крысу в сут, которые были получены из печени командорского кальмара Berrytenthis magister, важного объекта морского промысла, печень которого содержит около 50% алкоксиглицеридов.

На 45-е сутки опыта животных умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом и подвергали вскрытию. При вскрытии были взяты кусочки печени для проведения гистологических исследований. Кусочки органа были зафиксированы в жидкости Карнуа и залиты в парафин. Парафиновые срезы 2-4 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Гликоген выявляли с помощью Шифф-реактива по методу Шабадаша, плазматические клетки - при окраске метилгрюнпиронином по Браше. На гистологических препаратах при увеличении 200× и 400× изучали микроструктуру органа и проводили морфометрические исследования: подсчет гепатоцитов в поле зрения печеночной дольки, количество содержащихся среди них двуядерных клеток и лимфоцитов; для характеристики ретикулоэндотелия подсчитывали количество скоплений ретикулоэндотелиальных клеток (очагов их пролиферации) и содержание клеток в этих пролифератах. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования показали, что у крыс контрольной группы структура печени была без особенностей. Печеночные дольки, составляющие паренхиму печени, были выражены отчетливо, имели обычную величину и форму. Гепатоциты обычной формы и размера располагались в дольке с умеренной плотностью. Ядра в большинстве гепатоцитов средней величины, содержали по одному, реже 2-3 ядрышка. Гликоген в цитоплазме гепатоцитов у всех крыс этой группы выявлялся в виде четкой зернистости. Его распределение по территории дольки было равномерным, с небольшим преобладанием в цитоплазме клеток центральной зоны долек. Междольковые вены и артерии были без особенностей, просветы их умеренно расширены, большей частью пусты.

В центральной зоне печеночных долек в отдельных случаях наблюдали редкие мелкие очаги пролиферации ретикулоэндотелия.

У крыс опытных групп, получавших экспериментальные рационы, в структуре печени по сравнению с контролем были выявлены некоторые особенности. При этом у крыс, получавших рационы с разными жировыми компонентами, по сравнению с контролем в структуре печени выявлены разные, но довольно характерные для каждого жирового продукта изменения. Наблюдали нарушение кровообращения, лимфоидные инфильтраты по ходу сосудистых пучков, выраженную реакцию клеток ретикулоэндотелия.

Содержание в ткани двуядерных гепатоцитов было несколько увеличено (на 8,6%), что рассматривают в литературе как проявление защитноприспособительной реакции [11]. Наряду с этим при проведении реакции Шабадаша у некоторых животных отмечали слабое окрашивание цитоплазмы гепатоцитов Шифф-реактивом. Характерной для гликогена зернистости в цитоплазме гепатоцитов было мало, а местами ее не обнаруживали совсем. Цитоплазма таких клеток была окрашена гомогенно в бледно-розовый цвет.

У крыс 2-й опытной группы, получавших рацион с добавлением в качестве жирового компонента фитостерины, структура печени отличалась от печени контрольных животных. У крыс, получавших фитостерины, так же, как и у животных 1-й опытной группы, наблюдали изменения кровообращения в печени - расширенные просветы центральных вен в печеночных дольках и вен в междольковых сосудистых пучках. Были расширены просветы внутридольковых синусоидных капилляров.

По ходу междольковых сосудистых пучков, главным образом вокруг желчных протоков, у всех крыс, получавших фитостерины, выявляли массивные лимфоидные инфильтраты. Среди лимфоцитов в инфильтратах встречали и плазматические клетки. Как и в 1-й группе, в печени крыс, получавших фитостерины, число двуядерных гепатоцитов было незначительно увеличено. Наряду с этим на уровне центральной и средней зон печеночных долек у них достоверно в 1,8 раза чаще, чем у крыс контрольной группы и у получавших рацион с лярдом, выявляли очаги пролиферации ретикулоэндотелиальных клеток. Число клеток в них также было достоверно увеличено в 1,8 раза по сравнению с подобными образованиями в печени крыс контрольной и 1-й групп (табл. 2).

Иногда в пролифератах обнаруживали отдельные гибнущие, не содержащие гликогена гепатоциты, в то время как богатые им клетки выявляли вне очагов пролиферации по всей территории печеночных долек. В цитоплазме гепатоцитов вне очагов пролиферации наблюдали четкую окрашенную Шифф-реактивом зернистость. При этом наиболее интенсивную реакцию обнаруживали в цитоплазме гепатоцитов центральных зон печеночных долек.

У крыс 3-й и 4-й опытных групп, получавших алкоксиглицериды, характер изменений структуры печени отличался от того, что наблюдали у животных 1-й и 2-й опытных групп. У крыс, получавших разные количества алкоксиглицеридов, более заметные по сравнению с контролем, изменения выявляли в состоянии ретикулоэндотелия. Так, у крыс 3-й опытной группы, получавших меньшую дозу алкоксиглицеридов на фоне лярда, просветы центральных вен и внутридольковых синусоидных капилляров мало отличались от подобных у крыс контрольной группы. Обильных лимфоидных инфильтратов вокруг междольковых сосудистых пучков, какие наблюдали у животных 1-й и 2-й опытных групп, у крыс 3-й группы не обнаружено. У крыс, получавших рацион с 7 мг алкоксиглицеридов, по сравнению с контролем выявляли увеличение количества ретикулоэндотелиальных клеток в периферических зонах печеночных долек. В этих зонах клетки ретикулоэндотелия образовывали довольно четкие, прерывистые тяжики между печеночными балками по ходу синусоидных капилляров. В этих тяжиках местами обнаруживали слабое окрашивание Шифф-реактивом, что указывало на содержание в их цитоплазме полисахаридов. Наряду с этим (тяжиками клеток ретикулоэндотелия в периферических зонах долек) в средних и центральных зонах печеночных долек так же, как у крыс, получавших рацион с фитостеринами, клетки ретикулоэндотелия образовывали скопления - очаги пролиферации. Эти очаги имели небольшие размеры, неровные контуры. В них наряду с клетками ретикулоэндотелия обнаруживали лимфоциты.

Иногда выявляли в пролифератах бледно окрашенные структуры и неокрашенные контуры разрушающихся гепатоцитов. Подобные очаги пролиферации ретикулоэндотелиальтных клеток на срезах печени животных, получавших алкоксиглицериды, встречали в 2,3 раза чаще, чем в печени контрольных крыс. По сравнению с контролем, в них в 1,7 раза было увеличено и содержание клеток (табл. 2). Гликоген в гепатоцитах печени выявляли в виде четкой зернистости, однако распределение его по дольке было менее равномерным, чем в печени крыс контрольной группы.

У крыс 4-й опытной группы, получавших рацион с увеличенным количеством алкоксиглицеридов (50 мг), просветы центральных вен, вен междольковых сосудистых пучков, а также просветы внутридольковых синусоидных капилляров были слегка расширены. В одном случае по ходу междольковых сосудистых пучков наблюдали небольшие скопления лимфоцитов. Так же, как и у крыс 3-й группы, в периферических зонах печеночных долек было увеличено количество клеток ретикулоэндотелия, которые образовывали тяжики между печеночными балками, по ходу синусоидных капилляров. В цитоплазме ретикулоэндотелиальных клеток, образующих тяжики, наблюдали слабое гомогенное окрашивание Шифф-реактивом, свидетельствующее о содержании полисахаридов и некотором огрубении этих структур. В средней и центральной зонах печеночных долек, так же как и в печени животных других групп, обнаруживали очаги пролиферации ретикулоэндотелиальных клеток (табл. 3). В печени крыс 4-й опытной группы, по сравнению с контролем, они выявлялись в 2,1 раза чаще и содержали в 1,6 раза больше клеток (табл. 2 и 3). В очагах пролиферации наряду с клетками ретикулоэндотелия обнаруживали лимфоциты. Иногда наблюдали отдельные бледно окрашивающиеся, не содержащие гликогена, гибнущие гепатоциты, чаще в виде лизирующихся структур. Гликоген в гепатоцитах печеночной дольки выявляли в виде окрашенной Шифф-реактивом мелкой зернистости. Однако интенсивность реакции по территории дольки была неодинаковой.

Местами гепатоциты с интенсивно окрашенными гранулами чередовались с клетками, в которых зернистости выявляли мало или не обнаруживали совсем.

Использование рациона с жировым компонентом, содержащим фитостерины (20%) на фоне лярда, не снимало нарушений кровообращения, которые мы наблюдали в печени у крыс, получавших рацион только с лярдом. У них также были расширены просветы вен центральных и вен печеночных в междольковых сосудистых пучках. По наблюдениям некоторых авторов, подобные изменения ведут к замедлению кровотока, снижению насыщенности и обеднению крови кислородом [3]. Вследствие этого в организме может возникать состояние гипоксии, на которую наиболее остро реагируют активно работающие клетки [3]. На рационе с фитостеринами не уменьшалась и степень лимфоцитарной инфильтрации по ходу сосудистых пучков по сравнению с печенью у крыс, получавших рацион только с лярдом.

Возможно, образование подобных скоплений лимфоцитов связано с поступлением в организм соединений, на которые активно реагирует и печень, включаясь, таким образом, в реализацию иммунного ответа, в осуществлении которого печень играет заметную роль [9, 13].

В печени крыс 3-й и 4-й групп, получавших рацион с различным количеством алкоксиглицеридов (7 и 50 мг/сут) на фоне лярда, отмечена некоторая нормализация кровоснабжения по сравнению с печенью животных 1-й группы, получавших рацион только с лярдом. У крыс на рационе с алкоксиглицеридами просветы вен в печени близки к контролю или слегка расширены. Не выявлялось у них и лимфоидных инфильтратов по ходу сосудистых пучков. Однако у крыс, получавших алкоксиглицериды, в периферических зонах печеночных долек прослеживали довольно активную реакцию клеток ретикулоэндотелия. В этих зонах было увеличено количество ретикулоэндотелиальных клеток.

При этом ретикулоэндотелиальные клетки образовывали тонкие, местами прерывистые тяжики вдоль печеночных балок, по ходу синусоидных капилляров. В цитоплазме клеток обнаруживали полисахариды, что может указывать на огрубение ретикулоэндотелия и некоторую тенденцию к его склерозированию с нарушением гомеостаза [1].

Кроме различий, выявляемых в состоянии печени крыс, получавших рацион с разными жировыми компонентами [фитостерины (20%) и алкоксиглицериды (7 и 50 мг/сут)], наблюдаемых в периферических зонах печеночных долек, во всех трех группах по сравнению с контролем, было увеличено количество очагов пролиферации ретикулоэндотелиальных клеток в средних и центральных зонах печеночных долек в 1,8, 2,3 и 2,1 раза соответственно. Подобная реакция ретикулоэндотелия с образованием пролифератов происходит в местах распада и гибели клеток. Возможно, пусковым моментом возникновения очагов пролиферации в условиях нашего эксперимента являются характерные для каждой группы нарушения: изменение кровообращения и возникновение в связи с этим гипоксии в печени крыс, получавших рацион с фитостеринами (2-я группа); склерозирование ретикулоэндотелия и нарушение гомеостаза печени крыс, получавших алкоксиглицериды (3-я и 4-я группы). По-видимому, наиболее чувствительными к описанным изменениям оказались гепатоциты, находящиеся на определенной стадии зрелости, расположенные по длине печеночной балки на уровне средней и центральной зон печеночных долек. При этом, по наблюдению некоторых авторов, гибнущие клетки в подобных условиях теряют способность к окрашиванию и гранулообразованию [6, 7]. На срезах они не всегда выявляются и, как правило, не видны [4].

В нашей работе в некоторых очагах пролиферации отдельные бледно окрашенные, гибнущие и распадающиеся гепатоциты наблюдали среди клеток ретикулоэндотелия пролифератов. Очаги пролиферации ретикулоэндотелиальных клеток имели небольшие размеры, неровные контуры, их выявляли лишь в средних и центральных зонах печеночных долек. Необходимо отметить, что очаги пролиферации встречали и в печени контрольных животных. Однако в печени крыс опытных групп, получавших рацион с различными жировыми компонентами (фитостеринами и алкоксиглицеридами), их количество по сравнению с контролем было не только значительно увеличено, о чем упоминалось выше, но пролифераты значительно больше содержали клеток (соответственно в 1,8, 1,7 и 1,6 раза) по сравнению с печенью контрольных животных. Можно предположить, что увеличение количества очагов пролиферации ретикулоэндотелиальных клеток способно косвенно указывать и на увеличение количества погибающих и лизирующихся гепатоцитов в печени крыс, получавших рацион с фитостеринами (20%) и алкоксиглицеридами (7 и 50 мг/сут) на фоне лярда. Любопытно отметить, что на рационе только с лярдом (1-я группа, лярд 100%) количество очагов пролиферации ретикулоэндотелия и содержание в них клеток мало отличалось от соответствующих показателей контроля (см. табл. 2). Хотя в печени этих животных изменения в кровоснабжении (расширенные просветы вен, лимфоидные инфильтраты) также были выявлены. Но наряду с этим в печени крыс, получавших рацион только с лярдом, было отмечено некоторое, хотя и недостоверное, увеличение числа двуядерных гепатоцитов (см. табл. 1), что может быть одним из признаков активизации физиологической компенсаторной регенерации клеток [11]. Возможно, это и способствовало более быстрому их восстановлению (даже в условиях гипоксии при нарушенном кровоснабжении). При включении в рацион фитостеринов условия изменились, и наблюдаемой тенденции к увеличению числа двуядерных гепатоцитов могло быть недостаточно для поддержания нужного уровня восстановительного процесса.

Таким образом, полученные результаты позволяют прийти к заключению о необходимости проведения морфологических исследований при оценке возможности использования различных биологически активных жировых компонентов как растительного, так и животного происхождения в профилактических целях.

Литература

1. Авцын А.П, Шахламов В.А. Общая патология клетки и ее ультраструктурные элементы // Вестн. АМН СССР. - 1979. - № 11. - С. 20-29.

2. Беляева Н.Н. Значимость морфологических показателей в гигиенических исследованиях // Гиг. и сан. - 2000. - № 5. - С. 56-58.

3. Котовский Е.Ф., Шимкевич Л.А Проблемы космической биологии / Под ред. В.Н. Черниговского. - М.: Наука, 1971. - Т. 15. - 385 с.

4. Логинов Л.С., Аруин Л.И. Клиническая морфология печени. - М.: Медицина, 1985. - 240 с.

5. Мельникова Н.В. Клинико-биохимические и морфологические изменения печени у больных с атерогенной дислипидемией: Автореф. дис. - канд. мед. наук. - М., 2008. - 24 с.

6. Негода С.В. Выбор статина для гиполипидемической терапии с позиций клинической фармакологии и доказательной медицины // Кардиоваскуляр. тер. и профилактика. - 2008. - Т. 1, № 7. - С. 112-115.

7. Острянина А.Д. Сергеева К.В. Влияние качественно различных жиров на состояние липидного обмена при развитии экспериментального цирроза печени // Теоретические и практические аспекты изучения питания человека: Сборник. - М.: Наука, 1980. - Т. 1. - С. 66.

8. Перковец М.В. Спреды пониженной жирности и функционального назначения // Масла и жиры. - 2007. - Т. 75, № 5. - С. 8-9.

9. Пища и пищевые добавки. Роль БАД в профилактике заболеваний / Под ред. Дж. Ренсли, Дж. Джонелли, Н. Рид. - М.: Мир, 2004. - 304 с.

10. Погожева А.В., Каганов Б.С, Дербенева С.А. и др. Применение фитостеринов в диетотерапии при сердечно-сосудистых заболеваниях // Вопр. питания. - 2008. - Т. 77, № 5. - С. 37-40.

11. Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях / Под ред. Ю.А. Рахманина, Л.С. Сычевой. - М.: Гениус, 2007. - 312 с.

12. Самойлов А.В., Кочеткова А.А., Севериненко С.М., Банков В.Г. Некоторые аспекты моделирования сбалансированного жирнокислотного состава спредов // Вопр. питания. - 2008. - Т. 77, № 3. - С. 74-78.

13. Хлыстова З.С. Становление системы иммуногенеза плода человека (морфологические основы). - М.: Медицина, 1987. - 254 с.

14. Ширинский И.В., Козлов В.А., Ширинский В.С. Использование статинов - новый подход к терапии аутоиммунных заболеваний // Вестн. РАМН. - 2009. - № 2. - С. 26-30.

15. Gupta A.K., Savopoulos C.G., Ahuja J., Hatzitolios A.I. Role of phytosterols in lipid-lowering: current perspectives // QJM. - 2011. - Vol. 104, N 4. - Р. 301-308.

16. John S., Sorokin A.V., Thompson P.D. Phytosterols and vascular disease // Curr. Opin. Lipidol. - 2007. - Vol. 18, N 1. - Р. 35-40.

17. Kang S.J., Lall S.P., Ackman R.G. Digestion of the 1-O-Alkyl Diacylglycerol ethers of Atlantic Dogfish Liver oils by Atlantic Salmon Salmo salar // Lipids. - 1997. - Vol. 32, N 1. - P. 19-30.

18. Mensink R.P., de Jong A., Lьtjohann D. et al. Plant stanols dose-dependently decrease LDL-cholesterol concentrations, but not cholesterol-standardized fat-soluble antioxidant concentrations, at intakes up to 9 g/d // Am. J. Clin. Nutr. - 2010. - Vol. 92, N 1. - Р. 24-33.

19. Palmdlad J. Interactions between alkylglycerols and human neutrophil granulocytes // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1990. - Vol. 50. - P. 363-370.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.