В настоящее время белковая недостаточность - далеко не редкое явление, возникающее вследствие преобладания в пищевом рационе белков с низкой биологической ценностью [21, 27, 29], замены полноценного пищевого белка на содержащий ингибитор трипсина соевый [2, 7], самолечения физиологически не обоснованными диетами (например, только растительная пища ограниченного ассортимента) [19, 28], избыточного содержания углеводов и жиров в рационе с одновременным ограничением количества белка и т.д. Длительное белковое голодание или несбалансированный рацион по количеству белка является одним из основных факторов снижения пула свободных аминокислот в организме. Алиментарные нарушения белкового обмена, связанные с недостаточностью, однообразием, дефицитом или доминированием отдельных аминокислот, играют важную роль в формировании различных патологий и определяют особенности их протекания [5, 12].
Эндогенный L-аргинин (1-aмино-4-гуанидиновалериановая кислота) - основной субстрат аргиназы (КФ 3.5.3.1) и NO-синтазы (КФ 1.14.13.39, NOS) - важнейший регулятор гомеостаза организма, поскольку используется не только в процессах синтеза белков, но и функционирует как сигнальная молекула, стимулируя образование цитокинов, высвобождение гормонов поджелудочной железы и т.д. [6, 31]. Метаболизм L-аргинина может осуществляться путем окислительного превращения в оксид азота (NO) и L-цитруллин с участием NOS и неокислительного - в аргиназной реакции с образованием мочевины и орнитина. Соотношение активности между этими 2 ферментами обеспечивает в клетках определенный пул аргинина [10, 20].
Физиологическая потребность тканей и органов в аргинине удовлетворяется его эндогенным синтезом и/или поступлением с пищей, однако в молодом возрасте и у взрослых при стрессе или определенной патологии эта аминокислота становится эссенциальной [17]. Известно, что в организме человека аргинин может синтезироваться клетками печени в условиях ненарушенного баланса питания. Дефицит аргинина ведет к переключению орнитинового цикла на синтез пиримидиновых оснований [14]. Кроме того, участие аргинина в метаболизме определяет широкий спектр его терапевтического действия, проявляя гепатотропные, противомикробные, иммунотропные, психотропные свойства [4, 6]. Имеюся также сведения [16], что L-аргинин активно влияет на обмен жиров в организме.
Целью работы было исследование активности ферментов метаболизма L-аргинина в субклеточных фракциях печени крыс при алиментарной белковой недостаточности.
Материал и методы
Исследования проводили на самцах белых нелинейных крыс (n=180) массой тела 100-120 г и воз- растом 3-3,5 мес. Содержание экспериментальных животных и манипуляции с ними проводили с соблюдением требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, использующихся для исследовательских и научных целей (Страсбург, 1986).
Животных содержали по одному в пластмассовых клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum. Суточный рацион нормировали с учетом принципов парного кормления [25]. На протяжении эксперимента крысы получали полусинтетический рацион [13, 30].
Опытные животные были разделены на равные группы:
1 - животные, содержащиеся на полусинтетическом рационе (14% белка, 10% жиров, 76% углеводов), сбалансированном по всем нутриентам - группа контроля;
2 - животные, содержащиеся на безбелковой диете в течение всего экспериментального периода;
3 - животные, получающие в течение эксперимента полусинтетический рацион с частичной недостаточностью белка (1/2 количества казеина от общепринятой нормы). Рацион включал 7% белка, 10% жиров и 83% углеводов.
Энергетическая ценность рационов составляла 3601 ккал/кг.
Цервикальную дислокацию животных осуществляли под легким эфирным наркозом на 14-е и 28-е сутки.
Митохондриальную фракцию клеток печени получали методом дифференциального центрифугирования [33]. Чистоту митохондриальной фракции контролировали путем сравнительного определения активности сукцинатдегидрогеназы как специфического маркера внутренней мембраны митохондрий и глюкозо-6-фосфатазы - маркера эндоплазматического ретикулума во фракциях микросом и митохондрий. Загрязнение митохондриальной фракции микросомами составляло 7,32%.
Активность аргиназы в митохондриальной фракции и цитозоле клеток печени определяли по образованию мочевины [10] и выражали в нмоль мочевины за 1 мин на 1 мг белка.
Содержание свободного L-аргинина в митохондриальной фракции и цитозоле клеток печени определяли по методу [10].
Определение активности NOS проводили модифицированным методом [11]. Активность NOS определяли как разницу между показателями экстинкции субстратного и бессубстратного окисления NADPH и выражали в нмоль окисленного NADPH за 1 мин на 1 мг белка.
Содержание NO определяли по модифицированному методу [23] путем образования нитрит-аниона (NO2 -), который является стабильным метаболитом NO. Калибровочную кривую для определения количества NO2
- строили по стандартным растворам NaNO2 различной концентрации в 20 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,4) при добавлении реактива Грисса.
Концентрацию белка определяли методом Лоури [24].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрического критерия
Манна-Уитни с применением программы обработки статистических данных Statistica 6.0. Различия считали достоверными при р≤0,05.
Результаты и обсуждение
Аргиназа І, локализующаяся в цитозоле гепатоцитов, участвует в детоксикации аммиака в цикле мочевины [14, 18]. Кроме того, активность данного изофермента часто используется в качестве раннего маркера повреждений печени [15].
Результаты исследований показали, что в условиях содержания животных на безбелковой диете в цитозоле клеток печени в течение всего эксперимента происходит снижение аргиназной активности по сравнению с контролем (рис. 1а). Следует отметить, что если на 14-е сутки потребления безбелкового рациона активность фермента была ниже показателя животных группы контроля в 1,7 раза, то на завершающем этапе - в 2,7 раза, что свидетельствует о более глубоких метаболических изменениях. Пребывание крыс на рационе с частичной недостаточностью белка сопровождалось повышением активности аргиназы в цитозоле по сравнению с предыдущей опытной группой, которая все же оставалась ниже контроля в 1,5 раза в течение всего эксперимента (рис. 1а).
)
Вероятно, выявленное изменение активности исследуемого фермента в цитозоле связано со снижением интенсивности цикла мочевины вследствие алиментарной белковой недостаточности.
В то же время орнитин и мочевина - продукты аргиназной реакции - могут ингибировать метаболизм L-аргинина в цикле мочевины, что, возможно, ведет к уменьшению активности цитозольной изоформы фермента [18].
Следует отметить, что аргинин - единственный субстрат аргиназы, обладающей абсолютной субстратной специфичностью [4, 14]. Исследование содержания L-аргинина в цитозоле клеток печени свидетельствует о его уменьшении в течение эксперимента у животных опытных групп (рис. 1б).
Более интенсивное снижение количества аргинина наблюдается в группе крыс, содержащихся на безбелковой диете. Максимальное снижение концентрации аргинина в условиях как полного отсутствия, так и частичной недостаточности белка в пищевом рационе наблюдается на завершающем этапе эксперимента (28-е сутки). Исследуемый показатель в данный период оказался ниже значений контрольной группы соответственно в 9 и 3 раза.
Таким образом, снижение активности аргиназы в цитозоле клеток печени опытных групп животных, вероятно, обусловлено недостатком субстрата.
По данным литературы [6, 15], уменьшение клеточного пула L-аргинина может обусловливаться нарушением поступления его в клетку или интенсивным использованием в метаболических процессах. Основным поставщиком эндогенного аргинина является катаболизм белка в организме [14]. Известно, что значительные количества аргинина расходуются на синтез креатина, являющегося субстратом креатинкиназной реакции с образованием креатинфосфата [4, 6]. Следовательно, можно предположить, что в условиях недостаточности белка интенсифицируются системы восстановления клеточного фонда креатина в результате усиленного использования L-аргинина в анаболических процессах [18].
Кроме того, известно, что метаболизм L-аргинина осуществляется с помощью NOS, конкурирующей с аргиназой за субстрат. Продуктом окислительного пути метаболизма аргинина является NO [1, 20].
Изменение NO-синтазной активности в сторону повышения по сравнению с контролем в обеих опытных группах животных (в условиях безбелкового рациона - в 3,8 раза, частичной обеспеченности белком - в 2,2 раза) наблюдается лишь в конце эксперимента (28-е сутки) (рис. 2а). Отсутствие изменений уровня NO-синтазной активности по сравнению с контролем на 14-е сутки эксперимента в группе животных, находившихся на безбелковой диете, сопровождается усиленным образованием NO в цитозоле клеток печени (рис. 2б).
)
По данным литературы [3, 9], кроме результата NO-синтазной реакции образование NO в цитозоле может происходить с участием фермента ксантиноксидоредуктазы, обладающей способностью восстанавливать нитриты (NO2 -) и нитраты (NO3 -) в NO, а также в качестве побочного продукта циклооксигеназной и липооксигеназной реакций.
С учетом вышесказанного можно предположить, что чрезмерное образование NO на 14-е сутки эксперимента на фоне отсутствия измений активности NO-синтазы по сравнению с контрольными значениями в цитозоле клеток печени в условиях безбелкового рациона может происходить именно за счет активации указанных сигнальных систем с целью реализации потенциального воздействия NO как внутриклеточного мессенджера [8].
Исследование содержания NO в цитозоле клеток печени свидетельствует об увеличении его уровня в обеих опытных группах по сравнению с контролем (рис. 2б). Однако в группе животных, пребывающих на безбелковой диете, повышение уровня NO наблюдается уже на 14-е сутки, продолжая возрастать до завершения эксперимента. На 28-е сутки отсутствие белка в рационе сопровождается максимальным образованием NO, превышающим значения контроля в 6 раз. Что касается группы животных, частично обеспеченных белком, то увеличение уровня NO в клетках печени происходит лишь на 28-е сутки и составляет 3,4 раза по сравнению со значениями контроля (рис. 2б).
Вероятно, поначалу NO выступает как внутриклеточный посредник, однако на завершающих этапах эксперимента может оказывать токсическое воздействие путем образования нитрозильных комплексов с гемовым и негемовым железом или через активные формы азота, вызывающие эндогенную интоксикацию организма [8, 9].
Итак, алиментарная белковая недостаточность сопровождается угнетением аргиназного пути метаболизма L-аргинина с одновременной активацией его окислительного NO-синтазного преобразования с повышенной генерацией NO.
В митохондриальной фракции клеток локализуется аргиназа ІІ, регулирующая клеточную концентрацию L-аргинин/орнитин. Кроме того, аргиназа ІІ ингибирует активность NOS, непосредственно регулируя синтез NO [14]. Многочисленные исследования [15, 18] показывают, что дефицит аргиназы І индуцирует форму аргиназы ІІ, компенсирующую недостаток первой путем регуляции концентрации клеточного L-аргинина.
Результаты исследований аргиназной активности в митохондриальной фракции клеток печени крыс свидетельствуют о ее снижении по сравнению с контролем в обеих опытных группах, однако лишь в конце эксперимента (рис. 3а). Полное лишение крыс поступления экзогенного белка приводит к снижению ферментной активности в 2,4 раза по сравнению с контрольными значениями, в то время как в группе, частично обеспеченной белком, на 28-е сутки эксперимента активность аргиназы снижалась лишь в 1,5 раза по сравнению с контролем.
)
Известно, что экспрессия митохондриальной изоформы изменяется в зависимости от воздействия экзогенных или эндогенных факторов и потребностей метаболизма [15]. Учитывая роль аргиназы ІІ в регуляции клеточной концентрации L-аргинин/орнитин и непосредственного синтеза NO [17], мы предположили, что в клетках печени крыс, находившихся на безбелковой диете, снижение аргиназной активности происходит вследст- вие активации синтазы NO. Недостаток белка в данных экспериментальных условиях можно рассматривать как определяющий стрессовый фактор функционально-метаболических нарушений организма. Данные литературы [32] свидетельствуют о том, что в условиях индуцированных стрессовых состояний происходит активация NOS с усиленным синтезом NO.
Действительно, результаты исследований показали, что в условиях содержания животных на безбелковой диете в митохондриальной фракции клеток печени на протяжении всего экспериментального периода наблюдается повышение NO-синтазной активности по сравнению с контролем соответственно в 5 и 7,2 раза на 14-е и 28-е сутки (рис. 4а).
)
Пребывание крыс на низкобелковом рационе приводило к снижению активности фермента в исследуемой фракции по сравнению с таковой у животных, лишенных белка, но она все же оставалась выше контроля в 3,5 раза (см. рис. 4а).
Вероятно, увеличение NO-синтазной активности на фоне стабильности активности аргиназы на 14-е сутки эксперимента определяется общностью субстрата для обоих исследованных ферментов и возникновением конкурентных взаимосвязей [1, 20]. Снижение количественного содержания аргинина в митохондриальной фракции клеток печени крыс обеих опытных групп (рис. 3б), вероятно, вызвано интенсификацией NO-синтазной реакции (рис. 4), т.е. отсутствием характерных изменений аргиназной активности в данный период (рис. 3а) и усилением окислительного превращения L-аргинина с участием NOS в NO и L-цитруллин [26]. Цитруллин, с одной стороны, является предшественником синтеза L-аргинина de novo, а с другой - ингибитором окислительного метаболизма по принципу отрицательной обратной связи. Следует также отметить, что промежуточный продукт NO-синтазной реакции -
Nω-гидрокси-L-аргинин - является потенциальным ингибитором аргиназы [22]. Таким образом, очевидно, что снижение аргиназной активности с одновременным уменьшением количества L-аргинина в митохондриальной фракции клеток печени крыс в условиях алиментарной белковой недостаточности непосредственно связано с активацией NO-зависимой системы.
В целом полученные результаты позволяют сделать вывод, что при алиментарной белковой недостаточности в клетках печени крыс на фоне снижения аргиназной активности преобладает окислительный метаболизм L-аргинина с активацией NOS и усиленной генерацией NO.
Литература
1. Близнецова Г.Н., Артемьева С.С., Рецкий М.И. Влияние L-аргинина и ингибиторов NO-синтазы на образование оксида азота и нитрозотиолов при токсическом повреждении печени // Биомед. химия. - 2005. - Т. 51, № 6. - С. 656-661.
2. Бородин Е.А., Аксенова Т.В., Анищенко Н.И. Пищевые продукты из сои. Новая роль // Вестн. ДВО РАН. - 2000. - № 5. - С. 72-85.
3. Ванин А.Ф. Оксид азота: регуляция клеточного метаболизма без участия системы клеточных рецепторов // Биофизика. - 2001. - Т. 46, № 4. - С. 631-641.
4. Галкин Б.Н. Антитоксические свойства аргинина // Соврем. пробл. токсикол. - 2003. - № 1. - С. 80-86.
5. Громова Л.В. Влияние белкового голодания на гидролитические и транспортные характеристики тонкой кишки крыс в условиях хронического опыта // Рос. физиол. журн. - 2006. - Т. 92, № 10. - С. 1239-1249.
6. Кишко Т.О., Шандренко С.Г., Дмитренко Н.П. Аргинин: биологическое действие, влияние на синтез оксида азота // Журн. АМН Украины. - 2008. - Т. 14, № 1. - С. 150-158.
7. Котровский А.В. Соевое питание. - М.: Полиграфлес, 2001. - 42 с.
8. Манухина Е.Б., Дауни Х.Ф., Маллет Р.Т., Малышев И.Ю. Защитные и повреждающие эффекты периодической гипоксии: роль оксида азота // Вестн. РАМН. - 2007. - № 2. - С. 25-33.
9. Осипов А.Н., Борисенко Г.Г., Владимиров Ю.А. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов // Успехи биол. химии. - 2007. - T. 47. - C. 259 - 292.
10. Перетятко Ю.В., Сибирная Н.А. Особенности аргиназного и NO-синтазного путей метаболизма L-аргинина в лейкоцитах периферической крови крыс в условиях хронического рентгеновского облучения // Укр. биохим. журн. - 2009. - Т. 81, № 2. - С. 40-48.
11. Сумбаев В.В., Ясинская И.М. Влияние ДДТ на активность синтазы оксида азота в печени, легких и головном мозге крыс // Соврем. пробл. токсикологии. - 2000. - № 3. - С. 3-7.
12. Тимофеева Н.М., Никитина А.А., Егорова В.В., Гордова Л.А. Влияние дефицита белка в питании крыс в раннем онтогенезе на функционирование ферментных систем пищеварительных и непишеварительных органов во взрослой жизни // Бюл. экспер. биол. - 2004. - Т. 138, № 7. - С. 12-15.
13. Тышко Н.В.,. Жминченко В.М, Пашорина В.А. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 5. - С. 30-38.
14. Ash D.E. Structure and function of arginases // J. Nutr. - 2004. - Vol. 134. - P. 2760-2764.
15. Bachetti T., Comini L., Francolini G. et al. Arginase pathway in human endothelial cells in pathophysiological conditions // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2004. - Vol. 37, N 2. - Р. 515-523.
16. Bellentani S., Tinbelli C. Epidemiology and risk factors for fatty liver // Steatohepatitis (NASH and ASH) / Eds U. Leuschner, O.F.W. James, H. Dancygier - Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2001. - Р. 3-10.
17. Bode-Boger S.M. Effect of L-arginine supplementation on NO production in man // Eur. J. Clin. Pharmacol. - 2006. - Vol. 62, N 1. - P. 91-99.
18. Cederbaum S., Yu H., Grody W. et al. Arginases I and II: do their functions overlap? // Mol. Genet. Metab. - 2004. - Vol. 81, N l. - Р. 38-44.
19. Craig W.J., Mangels A.R. Position of the American Dietetic Association: vegetarian diets // J. Am. Diet. Assoc. - 2009. - Vol. 109, N 7. - Р. 1266-1282.
20. Durante W., Johnson F.K., Johnson R.A. Arginase: a critical regulator of nitric oxide synthesis and vascular function // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. - 2007. - Vol. 34, N 9. - P. 906-911.
21. Fontana L. Long-term low-protein, low-calorie diet and endurance exercise modulate metabolic factors associated with cancer risk // Am. J. Clin. Nutr. - 2006. - Vol. 84, N 6. - Р. 1456-1462.
22. Hayashi T., Juliet P., Matsui-Hirai H. et al. L-citrulline and L-arginine supplementation retards the progression of highcholesteroldiet-induced atherosclerosis in rabbits // Proc. Natl Acad. Sci. USA - 2005. - Vol. 102, N 38. - P. 13681-13686.
23. Hwang S., Lopec C.A., Heck D.E. et al. Osteopontin inhibits induction of nitric oxide synthase gene expression by inflammatory mediators in mouse kidney epithelial // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 264. - P. 711-715.
24. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. Protein measurement with Folin phemol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 123, N 1. - P. 265-273.
25. Mashiko S., Ishihara A., Iwaasa H. et al. A Pair-Feeding Study Reveals That a Y5 Antagonist Causes Weight Loss in DietInduced Obese Mice by Modulating Food Intake and Energy Expenditure // Mol. Pharmacol. - 2007. - Vol. 71, N 2. - P. 602-608.
26. Nikoli E., Carruba M.O. Nitric oxide and mitochondrial biogenesis // J. Cell Sci. - 2006. - Vol. 119. - P. 2855-2862.
27. Pan Y. Low-protein diet for diabetic nephropathy: a meta-analysis of randomized controlled trials // Am. J. Clin. Nutr. - 2008. - Vol. 88, N 3. - Р. 660-666.
28. Piccoli G., Ferraresi M., Deagostini M. et al. Vegetarian lowprotein diets supplemented with keto analogues: a niche for the few or an option for many? // Nephrol. Dial. Transplant. - 2013. - Vol. 28, N 9. - Р. 2295-2305.
29. Rasmussen L., Winning H., Savorani F.et al. Assessment of the effect of high or low protein diet on the human urine metabolome as measured by NMR // Nutrients. - 2012. - Vol. 4, N 2. - Р. 12-31.
30. Reeves P., Nielsen F., Fahey G. AIN-93 Purified Diets for Laboratory Rodents: Final Report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the AIN-76A Rodent Diet // J. Nutr. - 1993. - Vol. 123, N 11. - P. 1939-1951.
31. Scibior D., Czeczot H. Arginine - metabolism and functions in the human organism // Postepy Hig. Med. Dosw. - 2004. - Vol. 58. - P. 321-332.
32. Takeuchi K., Hatazava R., Tanigami M. Role of endogenous nitric oxide (NO) and NO synthase in healing of indomethacin-induced intestinal ulcers in rats // Life Scі. - 2007. - Vol. 80, N 4. - P. 329-336.
33. Weinbach T.C. A procedure for isolating stadle mitochondria from rat liver and kidney // Anal. Biochem. - 1961. - Vol. 2. - P. 335-343.