Effect of probiotic product containing bifidobacteria and biogel from brown algae on the intestinal microflora and parameters of innate immunity in mice with experimental drug dysbacteriosis

• T.A. Kuznetsova
• I.D. Makarenkova
• E.L. Koneva
• N.M. Aminina
• E.V. Yakush

AbstractThе article represents the results of studying the effect of a new fermented product (FP) containing the probiotic strain Bifidobacterium bifidum 791 and Biogel from brown algae Laminaria japonica on the composition of intestinal microflora and parameters of innate immunity in mice with experimental dysbacteriosis, induced by administration of gentamicin in dose of 25 mg per kg body weight during 7 days. The experimental animals received for 6 weeks in addition to the diet FP, which was 2% of the average volume of feed intake. The FP influence was manifested by more rapid reduction of dyspepsia symptoms, restoration of body weight and balance the intestinal microbiocenosis (increasing of bifido- and lactobacteria, typical E. coli, reducing of the bacteria genus Proteus and Clostridium, elimination of S. aureus). As the results of FP administration we observed the statistically significant reduction of endogenous intoxication values and increasing of the phagocyte activity of neutrophils, related to effector cells of innate immunity, compared with animals not receiving FP. Identified effects of FP are due to both its probiotic properties through the presence of bifidobacteria and immunomodulating and enteral sorbtion activities of alginate component.

Keywords:probiotic products, probiotics, antibiotic-assotiated dysbiosis, alginate, biogel from brown algae, intestinal microbiocenosis, innate immunity

Условия жизни человека при воздействии ряда негативных факторов окружающей среды способствуют развитию нарушений обмена веществ, ослаблению иммунитета, нарушению микробной экологии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и развитию дисбактериозов. К важнейшим средствам профилактики дисбактериозов относят пробиотики и пребиотики, в том числе в составе продуктов функционального питания, причем наиболее эффективны в этом отношении комплексы из пробиотиков и пребиотиков - синбиотики [16, 19].

В последние годы появились публикации, посвященные экспериментальным и клиническим испытаниям биогелей из бурых водорослей, причем ряд из них свидетельствует об эффективности последних не только при лечении различных гастроэнтерологических заболеваний, но и как средств коррекции дисбактериозов [1, 9]. Альгинаты, составляющие основу биогеля, относятся к растворимым пищевым волокнам [2, 18, 21, 22, 24], обладают уникальными иммуностимулирующими свойствами [4, 8, 11], являются мощными энтеросорбентами, способными связывать и удалять из организма побочные продукты обмена веществ, соли тяжелых металлов и радионуклиды [2, 15, 18]. По данным Н.М. Амининой [1], включение в рационы биогеля из морской капусты в количестве 100 г в течение 14 дней подавляло патогенные микроорганизмы в содержимом кишечника у больных хроническими гастроэнтерологическими заболеваниями (хронический эрозивный гастрит, гастроэнтероколит, дисбактериоз), способствуя сохранению основной облигатной микрофлоры.

В работах этого и других авторов [6, 7] также показано, что биогель стимулирует рост пробиотического штамма Bifidobacterium bifidum in vitro.

Вместе с тем в настоящее время недостаточно данных о наличии у альгиновой кислоты, ламинарана, фукоидана и других полисахаридов, входящих в состав бурых водорослей, пребиотических свойств: способности селективно улучшать рост и активность определенных популяций защитной кишечной микрофлоры.

В связи с этим целью работы явилось изучение влияния пробиотического продукта (ПП), содержащего бифидобактерии и биогель из бурых водорослей, на состав кишечной микрофлоры и показатели врожденного иммунитета у мышей с экспериментальным дисбактериозом кишечника, индуцированным введением антибиотика широкого спектра действия (гентамицина).

Материал и методы

Объект исследования - ПП на основе ферментированной Bifidobacterium bifidum 791 смеси молока с биогелем "Ламиналь" из морской капусты (охлажденным, массовая доля в составе продукта составляет 20%). В состав биогеля входят альгинат натрия (71,5% на сухую массу), белок (0,52% на сухую массу) и другие компоненты (клетчатка, манит, липиды, пигменты). ПП получен по разработанной ранее технологии, включающей стадии подготовки сырья, восстановления сухого молока, стерилизации, внесения биогеля, гомогенизацию и пастеризацию, охлаждение до температуры заквашивания, заквашивание, ферментацию при 38±1 °С до рН 4,7±0,1, охлаждение до 20-25 °С, розлив, упаковку, маркировку и хранение [6]. Содержание альгината натрия в продукте составляет 0,58 г/100 г, бифидобактерий - не менее 10 9 КОЕ/г (см³).

Экспериментальные исследования выполнены на неинбредных белых мышах массой тела 18-20 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая", находившихся на стандартном рационе вивария в боксированных помещениях. Работа выполнена с соблюдением международных рекомендаций Европейской конвенции по за щите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах [20]. Выведение животных из опыта проводили с использованием эфирного наркоза.

У мышей 1-й группы (60 животных) воспроизводили экспериментально дисбактериоз кишечника путем внутрибрюшинного введения в течение 7 дней антибиотика широкого спектра действия (гентамицина) в дозе 25 мг/кг массы тела. Мыши 2-й группы (60 животных), у которых также индуцировали дисбактериоз кишечника, ежедневно получали дополнительно к рациону перорально ПП 2 раза в сутки по 100 мкл на прием, что составляло 2% от средневзвешенного объема потребления корма. Получение животными ПП начиналось одновременно с введением гентамицина и продолжалось в течение 6 нед. Вскрытие и обследование животных 1-й и 2-й групп проводили в динамике (через 1, 4, 6 нед). 20 животных 3-й группы (интактный контроль) содержали на стандартном рационе вивария и обследовали однократно через 1 нед.

У экспериментальных животных оценивали массу тела, общее состояние, характер стула, исследовали состав кишечного микробиоценоза, формулу крови с определением лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ), определяли уровень молекул средней массы (МСМ) в крови, показатели функциональной активности клеток перитонеального экссудата.

Микробиологическое исследование фекалий животных проводили в соответствии с отраслевым стандартом ОСТ 91500.11.0004-2003 [12].

Лейкоцитарный индекс интоксикации рассчитывали по формуле Каль-Калифа. Содержание МСМ определяли по методу, описанному И.И. Жаденовым и соавт. [13], с измерением уровня оптической плотности пробы на спектрофотометре "Multiscan RC" ("Labsystems", Финляндия) при длине волны 254 нм. Фагоцитарную активность нейтрофилов перитонеального экссудата мышей оценивали по фагоцитарному показателю (ФП) - процент клеток, участвующих в фагоцитозе, и фагоцитарному числу (ФЧ) - среднее число латексных частиц, поглощенных одним фагоцитом [14].

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы Statistica7. Использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (для сравнения независимых выборок).

Результаты и обсуждение

При моделировании дисбактериоза у мышей 1-й группы через 12 ч после введения гентамицина проявлялись клинические симптомы заболевания, которые сохранялись в течение недели и выражались в полифекалии, изменении консистенции стула сначала в виде поноса, а затем запора, снижении аппетита и массы тела животных. Так, мыши этой группы потеряли в среднем до 2,4 г за 1-ю неделю, к концу наблюдаемого периода (через 6 нед) их масса тела постепенно восстанавливалась, составив 18,6±0,7 г.

По окончании введения гентамицина в фекалиях мышей 1-й группы наблюдалось статистически значимое снижение количества бифидобактерий, лактобактерий и энтерококков по сравнению с показателями 3-й группы (интактный контроль) (табл. 1). У животных этой группы наблюдалось появление представителя патогенной микрофлоры - Staphylococcus aureus, который в кишечнике здоровых животных отсутствовал. Также выявлено увеличение содержания условно-патогенных бактерий родов Clostridium и Proteus по сравнению с контролем (см. табл. 1). При проведении повторного обследования животных этой группы (через 4 и 6 нед после моделирования дисбактериоза) восстановления кишечной микрофлоры до нормы не выявлено (см. табл. 1).

Полученные результаты свидетельствуют о количественных и качественных нарушениях состава кишечной микрофлоры, которые проявлялись значимым уменьшением числа бифидо- и лактобактерий, а также появлением S. aureus, возрастанием содержания бактерий родов Clostridium и Proteus.

У животных 2-й группы, получавших ПП, через 12 ч после введения гентамицина также были отмечены клинические симптомы дисбактериоза, которые купировались к концу недели. Масса тела животных восстановилась через 4 нед, а затем наблюдалось ее возрастание до 21,8±0,8 г.

В результате недельного курса приема продукта у животных выявлено увеличение содержания бифидобактерий, а в последующем (через 4 и 6 нед) их содержание значительно превышало показатели у животных с модельным дисбактериозом и достигало уровня интактного контроля (см. табл. 1). Такая же тенденция отмечена в отношении лактобактерий. Кроме того, у животных этой группы к концу лечения выявлена элиминация S. aureus и отмечено снижение содержания бактерий родов Proteus и Clostridium по сравнению с их уровнем у животных 1-й группы (см. табл. 1).

При анализе формулы крови у животных 1-й группы с экспериментальным дисбактериозом через 1 нед выявлен незначительный лейкоцитоз (8,5±0,9×10⁹/л против 7,4±0,6×10⁹/л в контроле). Лейкоцитарная реакция сопровождалась изменением клеточного состава лейкограммы: в периферической крови увеличивалось процентное содержание палочкоядерных (3,6±0,3 против 3,0±0,2%) и сегментоядерных лейкоцитов (37,2±5,3 против 26,3±2,3%) и снижалось процентное содержание лимфоцитов (53,3±4,4 против 66,2±3,4%). Эти изменения могут свидетельствовать о возможной эндогенной интоксикации. Для более достоверной оценки реакции системы крови или степени интоксикации определяли ЛИИ, который, кроме того, служит косвенным признаком, характеризующим состояние иммунной системы.

У животных 1-й группы выявлено значимое увеличение ЛИИ по сравнению с таковым показателем у интактных животных 3-й группы (0,62±0,07 против 0,46±0,03 усл. ед.). В группе животных, получавших ПП, по истечении недели лейкоцитарная реакция сохранялась (8,2±0,6×10⁹/л), ЛИИ также оставался повышенным (0,57±0,04 усл. ед.).

При оценке уровня МСМ (см. рисунок) как маркера эндотоксикоза у животных с экспериментальным дисбактериозом (1-я группа) выявлена их повышенная по сравнению с контролем концентрация в динамике наблюдения (1, 4 и 6 нед). При этом степень повышения МСМ (до 17%) характеризуется как слабый уровень интоксикации . Под влиянием ПП (2-я группа) установлено статистически значимое снижение концентрации МСМ по сравнению с их уровнем в 1-й группе животных на протяжении всего исследования. К 4-6-й неделе у животных 2-й группы концентрация МСМ достигала уровня таковой у контрольных животных (3-я группа), что свидетельствует о купировании интоксикации.

Исследование показателей фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов перитонеальной полости у животных с экспериментальным дисбактериозом как принимавших в течение недели ПП (2-я группа), так и не принимавших ПП (1-я группа) выявило ее статистически значимое снижение по сравнению с интактным контролем (3-я группа).

Через 4 нед у мышей 2-й группы наблюдалось восстановление этих показателей до уровня интактного контроля, а к концу наблюдаемого периода (через 6 нед) у этих животных выявлено статистически значимое повышение ФП и ФЧ по сравнению с животными 1-й группы (табл. 2).

Таким образом, нами установлено, что применение ПП у мышей с экспериментальным дисбактериозом способствовало купированию симптомов диспепсии, восстановлению массы тела и оказывало корригирующее влияние на состав кишечной микрофлоры: наблюдалось восстановление содержания бифидо- и лактобактерий, типичной кишечной палочки, уменьшение количества бактерий родов Proteus и Clostridium, элиминация S. aureus. Применение ПП также приводило к снижению уровня МСМ как маркера эндогенной интоксикации организма и увеличению показателей фагоцитарной активности нейтрофилов, относящихся к клеткам-эффекторам врожденного иммунитета.

Рассматривая возможные механизмы корригирующего влияния ПП, следует учитывать, что в его состав входят 2 биологически активных компонента - пробиотический штамм B. bifidum 791 и альгинат натрия, содержащийся в биогеле из морской капусты.

Альгинаты обладают всеми характерными для пищевых волокон свойствами: не расщепляются пищеварительными ферментами в верхних отделах ЖКТ, в неизмененном виде достигают толстого кишечника, селективно ферментируются его микрофлорой [18, 22], а также стимулируют активный рост бифидо- и лактобактерий как in vitro, так и in vivo [21, 24].

Выявленное нами восстановление микробиоценоза кишечника также может быть связано с повышением местного иммунитета при применении ПП. Хорошо известно, что кишечная микрофлора с первых дней жизни участвует сначала в формировании иммунной системы, а затем и в поддержании нормального ее функционирования [23]. Напротив, нарушение микробиоценоза ЖКТ снижает резистентность организма к вирусным и бактериальным инфекциям, способствует развитию атопических заболеваний, аллергического дерматита, нейродермита и др. [3, 16, 25].

При развитии дисбиотических изменений в кровь поступает повышенное количество экзо- и эндотоксинов грамотрицательной микрофлоры, что может приводить к развитию эндогенной интоксикации, в свою очередь усугубляющей клинические проявления дисбактериоза [17]. С депрессивным влиянием бактериальных эндотоксинов может быть связано угнетение функциональной активности фагоцитов, что свидетельствует об иммунных нарушениях. Под влиянием ПП наблюдалось восстановление поглотительной и переваривающей функций нейтрофилов, относящихся к клеткам-эффекторам врожденного иммунитета.

Увеличение показателей фагоцитарной активности нейтрофилов у животных 2-й группы, вероятно, связано с действием биогеля и его основной составляющей - альгинатом натрия и обусловлено его стимулирующим влиянием на качественные и количественные параметры врожденного иммунитета [4, 8, 11].

Среди факторов патогенеза, значимых при формировании иммунодепрессии при синдроме эндогенной интоксикации, выделяют накопление МСМ.

Последние являются важным маркером эндоинтоксикации и включают компоненты различной природы, в том числе высокомолекулярные полисахаридные комплексы, локализованные на наружной мембране бактерий [5, 10]. В нашем эксперименте в процессе применения ПП уровень МСМ снижался, приближаясь к показателю у интактных животных (см. рисунок), что, по-видимому, свидетельствует о снижении уровня эндогенной интоксикации организма. Известно, что альгинаты обладают широким спектром биологической активности и применяются с целью купирования проявлений эндогенной интоксикации в составе комплексной терапии [15, 18]. Результаты проведенных нами исследований показывают, что в составе нового ПП альгинаты сохраняют свою иммуностимулирующую активность, в результате которой активируются фагоцитарные процессы и снижается уровень МСМ.

Таким образом, на примере экспериментального лекарственного дисбактериоза нами продемонстрирована положительная динамика восстановления нарушений микроэкологии кишечника и снижение степени интоксикации, а также стимулирующее влияние ПП на показатели врожденного иммунитета, что обусловлено как пробиотическими свойствами продукта за счет содержания бифидобактерий, так и его альгинатной составляющей, обеспечивающей иммуномодулирующую и энтеросорбционную активность. Полученные результаты открывают перспективы для использования ПП, содержащего бифидобактерии и биогель из бурых водорослей, для лечебного питания больных с антибиотикассоциированным дисбиозом, сопровождающимся микробной эндотоксемией.

Литература

1. Аминина Н.М. Лечебно-профилактический продукт "Ламиналь - биогель из морских водорослей". - Владивосток: ТИНРО, 2006. - 34 с.

2. Беспалов В.Г. Альгинат кальция. Источник растворимых пищевых волокон и кальция. - М., 2010. - 26 с.

3. Бондаренко В.М. Молекулярно-клеточные механизмы терапевтического действия пробиотических препаратов // Фарматека. - 2010. - № 2. - С. 26-32.

4. Добродеева Л.К., Морозова О.С., Сергеева Е.В. Механизмы иммуномодулиpующих эффектов альгинатов калия и магния // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т. 6. № 1. - С. 238.

5. Карякина Е.В., Белова С.В. Молекулы средней массы как интегральный показатель метаболических нарушений (обзор литературы) // Клин. лаб. диагностика. - 2004. - № 3. - С. 4-8.

6. Конева Е.Л. Обоснование и разработка технологий альгинатсодержащих функциональных продуктов: Дис. - канд. техн. наук. - Владивосток, 2009. 150 с.

7. Конева Е.Л., Аминина Н.М., Якуш Е.В. Бифидогенные свойства продуктов переработки бурых водорослей // Известия ТИНРО. - 2010. - Т. 161. - С. 303-308.

8. Морозова О.С. Влияние солей альгиновой кислоты на клеточные и гуморальные механизмы системы иммунитета: Дис. - канд. биол. наук. - Архангельск, 2010. - 128 с.

9. Морские водоросли в восстановительной медицине, комплексной терапии заболеваний с нарушением метаболизма / Под ред. А.Н. Разумова и др. - М.: МДВ, 2008. - 106 с.

10. Нагоев Б.С, Габрилович М.И. Значение определения средних молекул в плазме крови при инфекционных заболеваниях вирусной и бактериальной этиологии // Клин. лаб. диагностика. - 2000. - № 1. - С. 9-11.

11. Новгородцева Т. П., Виткина Т.И., Караман Ю.К., Аминина Н.М. Использование биологически активной добавки на основе калия и магния при экспериментальной кардиовазопатии // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 5. - С. 55-59.

12. Отраслевой стандарт ОСТ 91500.11.0004-2003 (утв. Приказом МЗ РФ от 9.07.2003 №231) "Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника".

13. Патент РФ № 2193780 от 27.11 2002 "Способ определения эндогенной интоксикации" / Жаденов И.И., Карякина Е.В., Белова С.В., Горячев В.И.

14. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 352 с.

15. Хотимченко М.Ю. Фармаконутрициология альгинатов. - Владивосток: Дальнаука, 2009. - 169 с.

16. Шендеров Б.А. Современное состояние и перспективы развития концепции "Функциональное питание" // Пищ. пром-сть. - 2003. - № 5. - С. 4-7.

17. Яковлев М.Ю. "Эндотоксиновая агрессия" как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных // Успехи соврем. биол. - 2003. - Т. 123. № 1. - С. 31-40.

18. Brownlee I.A., Allen A., Pearson J.P. et al. Alginate as a source of dietary fiber // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. - 2005. - Vol. 45. - Р. 497-510.

19. De Preter V., Hamer H.M., Windey K., Verbeke K. The impact of pre- and/or probiotics on human colonic metabolism: Does it affect human health? // Mol. Nutr. Food Res. - 2011. Vol. - 55, N 1. - Р. 46-57.

20. European Convention for Protection of Vertebrate Animals used in Experimental and other Studies. Cets No.: 123. - Strasbourg, 18.03.1986.

21. Janczyk P., Pieper R., Smidt H., Souffrant W.B. Effect of alginate and inulin on intestinal microbial ecology of weanling pigs reared under different husbandry conditions // FEMS Microbiol. Ecol. - 2010. - Vol. 7. - Р. 132-142.

22. Michel C., Benard C., Lahaye M. et al. Algal oligosaccharides as functional foods: in vitro study of their cellular and fermentative effects // Food Sci. - 1999. - Vol. 19. - Р. 311-332.

23. Ouwehand A., Isolauri E., Salminen S. The role of intestinal microflora for the development of the immune system in early childhood // Eur. J. Nutr. - 2002. - Vol. 41, suppl. 1. - Р. 132-137.

24. Ramnani P., Chitarrari R., Tuohy K. et al. In vitro fermentation and prebiotic potential of novel low molecular weight polysaccharides derived from agar and alginate seaweeds // Anaerobe. - 2012. - Vol. 18. - Р. 1-6.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.