The determination of glucose, sucrose and fructose by the method of capillary electrophoresis
AbstractThe possibilities of different regimes of micellar capillary electrophoresis using negative polarity and alkaline electrolyte for determination of glucose, sucrose, fructose in extracts of vegetative organs of plants and products of fruits and grapes processing have been studied. A comparative evaluation of the limits of detection of glucose, sucrose, fructose for developed electrolytes have been performed, the advantages and disadvantages of techniques have been discussed. It is recommended to use an aqueous electrolyte containing 0,5% potassium sorbate, 0,62% cetyltrimethylammonium bromide, and 0,02% potassium hydroxide. The analyzed components were detected at 254 nm. The sample was dosed hydrodynamically (30 mbar, 5 sec). Negative voltage 16 kV is recommended, current – 54±4 μA, capillary thermostating at 24 °C is applied, the analysis time – 15 min. The detection limits for fructose and glucose is 0,03 g/dm3 to 0,07 g of sucrose/dm3 . Linearity is stored for each component to 5,0 g/dm 3 inclusive. Electrophoretic mobility of carbohydrates was (10-4sm2V-1sec-1): fructose – 3,12, glucose – 3,03, sucrose – 2,74. Approximate time of release: glucose – 13 min, sucrose – 13,5 min, fructose – 12,5 min. The developed options for mass concentration determining of mono- and disaccharides provide complete separation of the components. Anions, glycerol, ethylene glycol, propylene glycol and butylene isomers do not affect the analysis results.
Keywords:capillary electrophoresis, electrolyte, juice, sugar, mobility detection limit, the migration
Вопр. питания. - 2015. - № 1. - С. 89-94.
Известно, что соки плодового происхождения в основном содержат фруктозу, а виноградные - фруктозу и глюкозу примерно в соотношении 1:1. Изменение соотношений моносахаридов может свидетельствовать о нарушении качества продукта. В связи с этим разработка методов определения концентраций глюкозы и фруктозы при совместном присутствии является важной задачей для реализации контроля качества пищевых продуктов.
Для количественного определения углеводов разработаны многочисленные фотоколориметрические методики, приемы ферментативного анализа, тонкослойной хроматографии, газовой хроматографии или хромато-масс-спектрометрии, жидкостной хроматографии и высокоэффективного капиллярного электрофореза (ВЭКЭ) [18].
Высокоэффективный капиллярный электрофорез - известный способ эффективного решения многих аналитических задач как рутинного, так и исследовательского характера [2, 4-6, 12, 15].
Практическую значимость метода подтверждают действующие и разрабатываемые государственные стандарты России для различных испытаний промышленной и сельскохозяйственной продукции, например ГОСТ Р 52841-2007 "Продукция винодельческая. Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза".
Существенным достоинством ВЭКЭ является практическое отсутствие пробоподготовки, в том числе для сложных по компонентному составу материалов биологического происхождения [3], устойчивость внутренней поверхности кварцевого капилляра к агрессивным веществам, за исключением производных фтора, и загрязнению компонентами исследуемых проб [14]. Для определения глюкозы, сахарозы, фруктозы известно несколько методик, реализующих капиллярный электро форез со спектрофотометрическим детектированием [16].
Главной проблемой при электрофоретическом определении глюкозы, сахарозы, фруктозы с УФдетектированием является отсутствие в их молекулах соответствующих химических связей, что приводит к низкой чувствительности детектирования [10]. Исследователи предлагают дериватизацию образцов или получают комплексные производные с хромофорами и поливалентными металлами [13]. Получение производных не всегда оправданно ввиду различной реакционной способности разных углеводов к одному и тому же реагенту, часто происходит образование сложной смеси стереоизомеров, существует определенная трудоемкость процесса [1]. Для растительных экстрактов, содержащих целый комплекс веществ, способных вступать в конкурирующие реакции с сахарами, искажения могут принять неуправляемый характер и понизить достоверность результатов количественного анализа.
Считается, что для определения моно- и дисахаридов наиболее предпочтительно использование косвенного УФ-детектирования в режиме мицеллярной элек трокинетической хроматографии и лигандообменного электрофореза [1, 9, 11], позволяющее достичь требуемых пределов обнаружения при минимальных затратах на сам ход анализа [9, 11]. Непрямое детектирование углеводов в режиме зонного электрофореза было возможно при использовании электролита с высоким значением pH, содержащего сильно поглощающие в УФ-диапазоне или флюоресцирующие анионы: сорбат, триптофан, n-нитрофенол, 1-нафтилацетат [18]. В условиях использования высокощелочного ведущего электролита углеводы приобретают отрицательный заряд, поэтому для анализа используют отрицательное напряжение 25 кВ. В ходе экспериментов установлено, что калибровочная кривая индивидуальных углеводов линейна в диапазоне концентраций от 50 до 10 000 мг/дм3 [17]. Разработан анализ сахарных кислот, получаемых в результате кислотного гидролиза полисахаридов и гликанов, связанных с гликопротеинами [7]. Для количественного анализа методом капиллярного электрофореза простых углеводов, содержащихся в гликопротеинах после дериватизации силилирующими агентами, были применены боратный электролит (pH 9,0) и ЛИФ-детектирование, для анализа использовали положительное напряжение 20 кВ [8].
Материал и методы
Использовали системы капиллярного электрофореза серии "Капель" ("Люмэкс", РФ) со следующими характеристиками: фотометрический детектор (254 нм), кварцевый капилляр с внешним полиамидным покрытием (внутренний диаметр 75×10 -6 м, эффективная длина - 0,5 м, водное термостатирование), центрифуга "Minispin" ("Eppendorf", Германия), 13 000 об/мин, растирочную машину ("Bioreba", Швейцария), рефрактометр ("Atago", Япония). Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения "Мультихром для Windows, версия 1.5" (ООО "Амперсенд", Москва, РФ).
Пробы готовили следующим образом: пробу сока, вина или другого жидкого объекта разбавляли в 2-50 раз (в зависимости от ожидаемого суммарного содержания моно- и дисахаридов, которое следует оценить рефрактометром и разбавить до суммарной концентрации не более 10 г/дм3 ), центрифугировали в течение 3-5 мин при 6000 об/мин. Гомогенизированные плоды, пюре и подобную продукцию заливали дистиллированной водой в соотношении 1:10, перемешивали, настаивали в течение 1 ч при комнатной температуре, центрифугировали, фильтровали, разбавляли дистиллированной водой и подвергали анализу. Фрагменты вегетативных органов растений измельчали на растирочной машине или вручную, количественно переносили в пробирки из полимерных материалов с завинчивающимися крышками, добавляли дистиллированную воду в соотношении по массе 1:10, перемешивали, настаивали в течение нескольких часов при комнатной температуре, затем декантировали.
Результаты и обсуждение
Оптимизация разделения смеси фруктозы, глюкозы, сахарозы получена при использовании водного электролита, содержащего сорбат калия, цетилтриметиламмоний-основание (ЦТАОН), глицерин и гидроксид калия. Сорбат калия использовали для обеспечения поглощения электролита в ультрафиолетовом спектре, глицерин - для уменьшения влияния матрицы пробы и снижения силы тока, ЦТА-ОН - компонент для формирования условий мицеллярного электрофореза. Для обоснования ионной силы раствора и достижения стабильности работы ведущего электролита были проведены эксперименты по влиянию добавления раствора гидроксида калия, оказывающего основное влияние на ионизацию молекул сахаров и разделение компонентов при наложении отрицательного напряжения. Параметром контроля качества разделения углеводов выбрана их электрофоретическая подвижность (рис. 1).
)
Данные рис. 1 показывают, что содержание 0,015% гидроксида калия в составе электролита обеспечивает ионизированное состояние и существенное различие электрофоретической подвижности углеводов и в то же время их постоянное значение, что важно для проведения количественного анализа. Далее было установлено, что уменьшение рН не позволяло разделить анализируемые компоненты, а увеличение рН приводило к значительному увеличению времени анализа, а в итоге и к снижению качества разделения компонентов за счет роста тепловых шумов.
Таким образом, состав электролита может быть рекомендован как оптимальный. Для анализа использовали водный ведущий электролит, содержащий 0,4% сорбата калия, 0,08% ЦТА-ОН, 3,2% глицерина и 0,015% гидроксида калия; электролит расходуют в течение рабочего дня. Анализируемые компоненты детектировали при 254 нм.
Пробу дозировали гидродинамически (30 мбар; 5 с). Рекомендуемое отрицательное напряжение - 16 кВ, при этом сила тока должна составить 45±2 мкА, термостатирование капилляра происходит при +24 °С, время анализа - 15 мин. Перед работой кварцевый капилляр промывали 1 М соляной кислотой и ди стиллированной водой в течение 10 мин, кондиционировали сначала 10 мин 1 М раствором гидроксида калия, затем 10 мин дистиллированной водой. Между анализами капилляр промывали в течение 2 мин 1 М соляной кислотой, дистиллированной водой, 1 М раствором гидроксида калия.
Ориентировочное время выхода: глюкозы - 13,5 мин, сахарозы - 14 мин, фруктозы - 13 мин. Пределы обнаружения оценивали по графику зависимости отношения высот сигнал/шум от концентрации компонента. Концентрация сахара при величине соотношения сигнал/шум >3 соответствует пределу обнаружения соответствующего компонента. Пределы обнаружения для фруктозы и глюкозы составили 0,01 г/дм3 , для сахарозы 0,03 г/дм3 . Линейность сохранялась для каждого компонента до 5,0 г/дм3 включительно. Электрофоретическая подвижность сахаров составила (10-4см2В-1с-1): фруктозы - 2,97, глюкозы - 2,86, сахарозы - 2,66. При выборе напряжения руководствовались степенью разделения компонентов и длительностью анализа. Пример определения сахаров градуировочной смеси показан на рис. 2. Калибровочные растворы готовили на дистиллированной воде из химически чистых препаратов глюкозы, фруктозы, сахарозы.
)
Ввиду значительного содержания в винах и экстрактах растительного сырья глицерина, изомеров пропиленгликоля, бутиленгликоля было проведено исследование их возможного влияния на результаты анализа. В ходе экспериментов установлено отсутствие влияния данных веществ на результаты анализа. Аналогичная работа проведена для учета влияния анионов хлорида, сульфата, бората, фосфата. Установлено, что анионы не проявляются на электрофореграмме в данных условиях анализа и, соответственно, не оказывают влияния на количественное определение глюкозы, фруктозы, сахарозы.
С целью упрощения условий анализа и эксплуатации раствора электролита были проведены дополнительные экспериментальные исследования, которые позволили предложить модифицированные условия выполнения определения сахаров. Вместо относительно дорогого ЦТА-ОН использовали более доступный цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ). Применение ЦТАБ позволило увеличить ионную силу электролита, уменьшить время анализа и в то же время практически не изменить качество условий разделения компонентов. Применение ЦТАБ позволило отказаться от глицерина, так как он гигроскопичен, что приводит к изменениям его массовой концентрации, а это отражается на стабильности условий получения электролита. Следует отметить, что электролит, содержащий ЦТАБ, обладает меньшей чувствительностью для определения компонентов.
В результате проведенной экспериментальной работы для выполнения анализа рекомендовано применение водного электролита, содержащего 0,5% сорбата калия, 0,62% ЦТАБ и 0,02% гидроксида калия (электролит расходуют в течение рабочего дня). Анализируемые компоненты детектировали при 254 нм. Пробу дозировали гидродинамически (30 мбар, 5 с). Рекомендуемое отрицательное напряжение - 16 кВ, при этом сила тока должна составлять 54±4 мкА, применяют термостатирование капилляра при 24 °С, время анализа - 15 мин. Перед началом работы кварцевый капилляр промывали 1 М соляной кислотой и дистиллированной водой в течение 10 мин, кондиционировали 10 мин 1 М раствором гидроксида калия, затем 10 мин дистиллированной водой. Между анализами капилляр промывали в течение 2 мин 1 М соляной кислотой, дистиллированной водой, 1 М раствором гидроксида калия.
Разработанный вариант определения массовой концентрации моно- и дисахаридов обеспечивает полное разделение компонентов. Проведению анализа не мешают анионы, глицерин, этиленгликоль, изомеры пропиленгликоля и бутиленгликоля.
Пределы обнаружения для фруктозы и глюкозы составляют 0,03 г/дм3 , для сахарозы - 0,07 г/дм3 .
Линейность сохранялась для каждого компонента до 5,0 г/дм3 включительно. Электрофоретическая подвижность углеводов составила (10-4 см2 В-1 с-1 ): фруктозы - 3,12, глюкозы - 3,03, сахарозы - 2,74.
При выборе напряжения руководствовались качеством разделения компонентов и длительностью анализа.
Ориентировочное время выхода: глюкозы - 13 мин, сахарозы - 13,5 мин, фруктозы - 12,5 мин.
Пример определения сахаров в пробе виноградного концентрированного сока показан на рис. 3.
)
Данные рис. 3 демонстрируют полное разделение фруктозы, глюкозы, сахарозы образца концентрированного виноградного сока и, соответственно, пригодность разработанного состава электролита для количественного анализа.
Заключение
Таким образом, разработаны экспресс-методики определения массовой концентрации глюкозы, фруктозы, сахарозы посредством ВЭКЭ. Установлено, что количественному анализу в пробах винодельческой продукции, соков, растительного сырья не мешают анионы хлорид, сульфат, нитрат, глицерин, этиленгликоль, изомеры пропиленгликоля и бутиленгликоля. По итогам исследования получен патент РФ № 2 492 458.
Литература
1. Алексеева А.В., Карцова Л.А., Казачищева Н.В. Определение сахаров методом лигандообменного капиллярного электрофореза // Журн. анал. химии. - 2010. - Т. 65, № 2. - С. 205-211.
2. Арианова Е.А., Богачук М.Н., Передеряев О.И. Определение хондроитин сульфата в биологически активных добавках к пище методом капиллярного зонального электрофореза // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 3. - С. 67-71.
3. Беленький Б.Г. Высокоэффективный капиллярный электрофорез. - СПб.: Наука, 2009. - 320 с.
4. Богачук М.Н., Передеряев О.И., Бессонов В.В. Определение меламина в молоке и молокосодержащих продуктах методом капиллярного зонного электрофореза // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 50-54.
5. Богачук М.Н., Бессонов В.В., Передеряев О.И. Методика количественного определения водорастворимых витаминов в витаминных премиксах и пищевых продуктах с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 67-74.
6. Малинкин А.Д., Бессонов В.В., Шумакова А.А. и др. Определение состава основных катионов в соках и нектарах методом капиллярного зонального электрофореза // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 1. - С. 74-79.
7. Campa C., Baiutti E., Flamingmi A. Capillary electrophoresis of sugar acids // Methods Mol. Biol. - 2008. - Vol. 384. - P. 307-355.
8. Chen F.T., Dobaski Th.S., Evangelista R. Quantitative analysis of sugar constituents of glycoproteins by capillary electrophoresis // Glycobiology. - 1998. - Vol. 69, N 11. - P. 1045-1052.
9. Hoffstetter-Kuhn S., Puulus A., Gassman E., Widmer H.M. Determination of sugar by capillary electrophoresis // Anal. Chem. - 1991. - Vol. 63. - P. 1541-1550.
10. Klockow A., Paulus A., Figuereis V. et al. Determination of carbohydrates in fruit juices by capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. - 1994. - Vol. 680, is. 1. - P. 187-200.
11. Lee Y., Lin T.-I. Analysis of sugar by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. B. - 1996. - Vol. 681. - P. 87.
12. Li S.F. Capillary Electrophoresis. - Amsterdam: Elsevier. Sci. Publ., 1992. - 608 p.
13. Lu B., Westerlund D. Capillary electrophoresis of sugar with complexon // Electrophoresis. - 1996. - Vol. 17. - P. 325.
14. O’Flanerty B., Yang W.P., Sengupta S., Cholli A.L. Near-real time detection of impurities in sugar and wine samples: a novel approach. Ass. AVH 7 Symposium. - Reims, 2000. - P. 22.
15. Pesek J.J., Matyska M.T. Etched chemically modified capillaries: Novel separation media for electrophoretic analyses // J. Sep. Sci. - 2004. - Vol. 27. - P. 1285-1291.
16. Rassi Z. Recent developments in capillary electrophoresis of carbohydrates // Electrophoresis. - 1997. - Vol. 18, is. 12-13. - P. 2400-2407.
17. Sogaa T., Serweb M. Determination of carbohydrates in food by capillary electrophoresis with indirect UV detection // Food Chem. - 1997. - Vol. 69, is. 3. - P. 339-344.
18. Suzuki Sh., Honda S. A tabulated review of capillary electrophoresis of carbohydrates // Electrophoresis. - 1998. - Vol. 19, is. 15. - P. 2539-2560.
All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)
© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.