Атеросклероз является опасным и почти постоянным осложнением сахарного диабета (СД).
В крови больных СД увеличивается уровень триглицеридов, атерогенных мелких липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), снижается количество антиатерогенных липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) [1]. В артериях активируется липопероксидация, накапливаются пенистые макрофаги, переполненные перекисно-модифицированными ЛПНП, пролиферируют гладкие мышцы и формируются атеросклеротические бляшки. Гликированные белки повреждают базальную мембрану сосудов [2]. Частота развития атеросклероза и ангиопатий при СД вдвое выше, чем в общей популяции. Развитию диабетического атеросклероза можно препятствовать с помощью назначения сахароснижающих, гиполипидемических средств и диетических мероприятий, ограничивающих поступление холестерина в организм. Снижение уровня холестерина на 1 ммоль/л сокращает риск ишемических осложнений на 25%, что может продлить жизнь больным СД на 3,5-7,5 года [3].
При моделях СД и в клинике выраженную гипогликемическую активность проявили продукты, выделенные из травы крапивы двудомной, семян и корней лопуха большого. Введение крысам в желудок водного экстракта крапивы в дозе 1,25 г на 1 кг массы тела в течение 28 дней уменьшало концентрацию глюкозы в крови при моделях СД, увеличивало сниженную массу тела, потенциро- вало способность инсулина повышать утилизацию глюкозы изолированной диафрагмой [4]. При экспериментальном стрептозотоциновом СД крыс спиртово-водный экстракт лопуха, введенный в желудок в дозе 400 мг на 1 кг массы тела на протяжении 14 дней, повышал толерантность к сахарной нагрузке, в крови уменьшал концентрацию глюкозы, мочевины, креатинина, триглицеридов и ЛПНП, увеличивал концентрацию инсулина и ЛПВП [5].
Целью исследования было изучение влияния на показатели обмена липидов и реакции гликозилирования при экспериментальном СД диеты с низким содержание жиров, а также экстрактов листьев крапивы двудомной и корней лопуха большого, примененных на фоне различных пищевых рационов.
Материал и методы
Сухие водные экстракты получали из листьев крапивы двудомной (Urtica dioica L. сем. Urticaceae) и корней лопуха большого (Arctium lappa L., сем. Asteraceae). Растения заготавливали в экологически чистом районе Томской области. Измельченное воздушно-сухое сырье настаивали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин при 80 °С. Экстракцию водой проводили троекратно, после чего объединяли полученные порции и удаляли воду при температуре не выше 60 °С. Сухой экстракт листьев крапивы содержал 78±6 мг% каротиноидов в пересчете на β-каротин и 0,0128±0,002 мкмоль/г хлорофилла в пересчете на хлорофилл а, сухой экстракт корня лопуха содержал 5,0±0,8% полифенолов и 9,6±1,4% инулина. Экстракты крапивы и лопуха характеризуются низкой острой токсичностью. В дозах до 10 000 мг/кг при ежедневном введении в желудок или внутрибрюшинно они не вызывали гибели мышей и крыс в течение 2 нед наблюдения.
У животных не нарушалась координация движений, сохранялись рефлексы, не изменялись концентрации глюкозы, гликированного гемоглобина и триглицеридов в крови.
Эксперимент проводили на 90 аутбредных белых крысах-самцах массой 200-220 г, выращенных в конвенциональных условиях в виварии НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга (Томск). Крыс содержали в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и других научных целях (Совет Европы, Страсбург, 2004 г.). На время эксперимента крыс помещали в индивидуальные клетки при естественном освещении, относительной влажности воздуха 50-60%, температуре 22-24 °С, свободном доступе к воде и пище. Экспериментальный СД вызывали двукратным внутрибрюшинным введением стрептозотоцина ("Sigma", США) в дозе 30 мг на 1 кг массы тела с интервалом в 2 дня [6].
Для формирования инсулинорезистентности животные в течение 4 нед до начала инъекций стрептозотоцина и в течение 8 нед после окончания получали диету с повышенным содержанием жиров (белок - 8%, жиры - 30%, углеводы - 62% от общей суточной калорийности). Отбирали крыс с уровнем гликемии более 10 ммоль/л после голодания на протяжении 12-14 ч. Этим животным ежедневно вводили в желудок за 30 мин до еды в течение 10 дней растворенные в дистиллированной воде экстракты листьев крапивы или лопуха в эффективных дозах 100 и 25 мг на 1 кг массы тела соответственно или в суспензии на 1% крахмальной слизи препарат сравнения - метформин ("Berlin-Chemi AG", Германия) в дозе 100 мг на 1 кг массы тела [7]. В течение срока введения препаратов половина животных продолжала получать диету с высоким содержанием жиров, остальные животные получали пищевой рацион с низким содержанием жиров (белок - 20%, жиры - 8%, углеводы - 72%). Третью группу крыс кормили только пищей с низким содержанием жиров, и она не получала экстрактов или препарата сравнения.
Контрольным животным с моделью СД вводили дистиллированную воду или крахмальную слизь.
В крови измеряли содержание глюкозы (глюкометр "OneTouch UltraEasy", США). В сыворотке крови определяли содержание триглицеридов, общего холестерина, холестерина ЛПВП (тестсистемы "Триглицериды", "Холестерин", "ЛПВПхолестерин", Россия), фруктозамина ЛПВП (тестсистема "Fructosamina", Испания), белка ЛПВП, малонового диальдегида (МДА), суммарное содержание ЛПНП и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП); вычисляли холестероловый коэффициент атерогенности [8]. В эритроцитах регистрировали содержание гликированного гемоглобина (тест-система "Glycohemoglobin", США).
Для количественного определения показателей использовали спектрофотометр СФ-2000 (РФ).
Результаты обрабатывали с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни и Вилкоксона для независимых и зависимых выборок при вероятности ошибочного вывода, не превышающей 5% (р≤0,05). Данные представлены в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q1-Q3) [9].
Результаты и обсуждение
После введения стрептозотоцина и кормления пищей с высоким количеством жиров (30%) в течение 8 нед у крыс появлялись характерные для СД симптомы: полиурия, полидипсия, полифагия.
В этом эксперименте уровень глюкозы в крови становился в 5,3 раза больше, чем у интактных животных, возрастало количество атерогенных фракций липидов и усиливалось гликозилирование белков (см. таблицу). В сыворотке крови количество триглицеридов, общего холестерина, холестерина неЛПВП, суммы ЛПНП и ЛПОНП возрастало в 2-8,3 раза по сравнению с количеством липидов и липопротеинов у интактных животных.
)
Содержание холестерина неЛПВП рассчитывали как разность между количеством общего холестерина и холестерина ЛПВП. Холестерин неЛПВП рассматривают как самую атерогенную фракцию и предиктор сердечно-сосудистых осложнений [1].
Индекс атерогенности повышался с 0,3-4,4 до 1,4-8,9. Содержание в сыворотке крови вторичного продукта липопероксидации МДА увеличивалось в 4,9 раза. Напротив, содержание холестерина и белка ЛПВП снижалось в 1,5-2,3 раза. Основным белком ЛПВП является аполипопротеин А-I.
Он взаимодействует с рецепторами гепатоцитов и активирует лецитин-холестерин-ацилтрансферазу, что усиливает этерификацию холестерина с освобождением в поверхностном слое ЛПВП вакансий для захвата холестерина из тканей [10].
При модели СД интенсифицировалось гликозилирование белков с ростом количества гликированного гемоглобина и фруктозамина ЛПВП в 1,9-2,5 раза (см. таблицу). Фруктозамин представляет собой продукт неферментативной реакции между глюкозой и аминогруппами белков.
Гликированные ЛПВП быстро элиминируются из крови [11].
После кормления животных пищей с низким содержанием жира (8%) ослаблялись гипергликемия и дислипидемия, вызванные стрептозотоцином и высококалорийной диетой. Содержание в крови глюкозы становилось меньше в 1,8 раза, содержание триглицеридов, общего холестерина, холестерина неЛПВП, суммы ЛПНП и ЛПОНП, холестерина и белка ЛПВП, индекс атерогенности нормализовались. Содержание МДА снижалось в 2,3 раза. Диета с низким содержанием жиров не нормализовала уровни глюкозы и МДА в крови и не вызывала регресс реакций гликозилирования, при этом содержание глюкозы и МДА регистрировалось повышенным в 1,8-2,3 раза, гликированного гемоглобина и фруктозамина ЛПВП - в 1,7-2,5 раза (см. таблицу).
При введении экстрактов крапивы и лопуха животным с моделью СД, продолжавшим получать пищу с высоким содержанием жиров, метаболические показатели изменялись в сторону нормы.
Содержание в крови глюкозы, триглицеридов, общего холестерина, холестерина неЛПВП уменьшалось в 1,6-5,8 раза, суммы ЛПНП и ЛПОНП - в 6,3-7,1 раза, МДА - в 2,7-3,5 раза по сравнению с количеством липидных фракций при стрептозотоциновой модели СД. Индекс атерогенности составлял 0,4-1,8. Содержание холестерина и белка ЛПВП повышалось в 1,4-3,7 раза. Экстракт крапивы нормализовал содержание в сыворотке крови всех фракций липидов и липопротеинов, при введении экстракта лопуха только содержание триглицеридов определялось увеличенным в 2,1 раза. Растительные экстракты также препятствовали гликозилированию гемоглобина и белка ЛПВП. Препарат сравнения проявлял такую же, как растительные экстракты, гипогликемическую и антиатерогенную активность (см. таблицу).
У животных с моделью СД, получавших пищу с содержанием жиров 8%, экстракты крапивы и лопуха более эффективно уменьшали не только гипергликемию, но и гипертриглицеридемию, чем при питании богатым жирами кормом. Содержание МДА также снижалось более значительно.
Низкокалорийный пищевой рацион не усиливал способность фитопрепаратов снижать в сыворотке крови содержание атерогенных липидов, гликированных продуктов и индекс атерогенности, повышать содержание ЛПВП. Препарат сравнения в эксперименте с низким потреблением жиров значительнее, чем при кормлении пищей с высоким количеством жиров (30%), снижал уровень глюкозы, суммы ЛПНП и ЛПОНП, препятствовал гликозилированию белков ЛПВП (см. таблицу).
Таким образом, при экспериментальном СД, вызванном панкреотоксическим действием стрептозотоцина и кормлением обогащенной жирами (30%) пищей, развивались гипергликемия, гипертриглицеридемия, гиперхолестеринемия, гликозилирование белков, в крови возрастало содержание атерогенных фракций липопротеинов, более интенсивно образовывался вторичный продукт перекисного окисления липидов МДА, ослаблялась противоатеросклеротическая защита при участии ЛПВП. Как известно, антибиотик стрептозотоцин селективно связывается с маркером β-клеток поджелудочной железы - транспортером GLUT 2.
В β-клетках стрептозотоцин интенсивно метаболизируется с выделением оксида азота и образованием активатора свободнорадикальных реакций пероксинитрильного радикала. Свободные радикалы оказывают в β-клетках детергентный эффект, разобщают окислительное фосфорилирование, вызывают энергетический дефицит и точечные мутации ДНК. В результате панкреотоксического действия стрептозотоцина развивается некроз β-клеток с нарушением секреции инсулина и утилизации глюкозы [12].
Экстракты крапивы двудомной и лопуха большого не слабее метформина уменьшали гипергликемию, ингибировали гликозилирование белков, изменяли в сторону нормы содержание в крови фракций липидов и липопротеинов у животных с экспериментальным СД, даже продолжавших получать пищу с высоким количеством жиров. Экстракты крапивы и лопуха, введенные на фоне низкокалорийной диеты, более эффективно препятствовали развитию гипергликемии, повышению содержания триглицеридов и МДА в крови, чем при питании богатым жирами кормом.
Терапевтическое действие фитопрепаратов обусловлено уменьшением гипергликемии, прямым влиянием на метаболизм липидов и антиоксидантным эффектом. По данным литературы, экстракт крапивы при повреждении поджелудочной железы крыс стрептозотоцином значительно повышал секрецию инсулина и оказывал гиполипидемический эффект в результате роста экспрессии рецепторов PPAR-α и PPAR-γ (рецепторов, активируемых пролифератором пероксисом) [13]. Сумма лигнановых гликозидов семян лопуха у крыс со спонтанным СД 2 типа без ожирения (линия Goto-Kakizaki) стимулировала секрецию инсулина, способствуя высвобождению глюкагоноподобного пептида-1 [14].
Гликозид арктигенин лопуха как индуктор цАМФзависимой протеинкиназы ослаблял глюконеогенез и липогенез, вызывал новообразование митохондрий и усиливал окисление свободных жирных кислот в скелетных мышцах [15].
Полученные результаты свидетельствуют о перспективе применения экстрактов крапивы двудомной и лопуха большого в комплексной терапии СД с целью профилактики и лечения атеросклеротических осложнений этого заболевания.
Литература
1. Кардиоваскулярная профилактика. Национальные рекомендации // Кардиоваскуляр. тер. и профилактика. 2011. Т. 10, № 6. Прил. 2. С. 1-64.
2. Иванов В.В., Шахристова Е.В., Степовая Е.А. и др. Адипоциты. Сахарный диабет. Окислительный стресс. Томск : Печатная мануфактура, 2013. 112 с.
3. Евдокимова А.Г. Дислипидемия как фактор риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и осложнений // Consilium Medicum. 2009. Т. 11, № 10. С. 93-99.
4. Das M., Sarma B.P., Rokeya B. et al. Antihyperglycemic and antihyperlipidemic activity of Urtica dioica on type 2 diabetic model in rats // J. Diabetol. 2011. Vol. 2, N 2. P. 16-20.
5. Cao J., Li C., Zhang P., Cao X. et al. Antidiabetic effect of burdock (Arctium lappa L.) root ethanolic extract on streptozotocin-induced diabetic rats // Afr. J. Biotechnol. 2012. Vol. 11, N 37. P. 9079-9085.
6. King A.J. The use of animal models in diabetes research // Br. J. Pharmacol. 2012. Vol. 166, N 3. P. 877-894.
7. Tahara A., Matsuyama-Yokono A., Nakano R. et al. Hypoglycemic effects of antidiabetic drugs in streptozotozin-nicotinamide-induced mildly diabetic and streptozotozin-induced severely diabetic rats //Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2008. Vol. 103, N 6. P. 560-568.
8. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Минск : Беларусь, 2000. 363 с.
9. Хафизьянова Р.Х., Бурыкин И.М., Алеева Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной и клинической фармакологии. Казань : Медицина, 2006. 373 с.
10. Чумакова Г.А., Гриценко О.В., Веселовская Н.Г. и др. Клиническое значение аполипопротеинов А и В // Кардиоваскуляр. тер. и профилактика. 2011. Т. 10, № 6. С. 105-111.
11. Ren S., Shen G.X. Impact of antioxidant and HDL on glycated LDL-induced generation of fibrinolytic regulators from vascular endothelial cells // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2000. Vol. 20, N 6. P. 1688-1693.
12. Lenzen S. The mechanism of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes // Diabetologia. 2008. Vol. 51, N 2. P. 216-226.
13. Rau O., Wurglics M., Dingermann T. et al. Screening of herbal extracts for activation of the human peroxisome proliferatoractivated receptor // Pharmacy. 2006. Vol. 61, N 11. P. 952-956.
14. Xu Z., Ju J., Wanget K. et al. Evaluation of hypoglycemic activity of total lignans from Fructus Arctii in the spontaneously diabetic Goto-Kakizaki rats // J. Ethnopharmacol. 2014. Vol. 151, N 1. P. 548-555.
15. Huang S.L., Yu R.T., Gong J. et al. Arctigenin a natural compound activates AMP-activated protein kinase via inhibition of mitochondria complex I and ameliorates metabolic disorders in ob/ob mice //Diabetologia. 2012. Vol. 55, N 5. P. 1469-1481.